[标准曲线法对灵杆菌素测定方法的研究①] 说明标准曲线法测定物质含量的步骤
时间：2019-05-30 03:25:20 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
摘要:灵杆菌素是从革兰氏阴性菌的细胞壁中提取的细菌性脂多糖,是目前已知的最具潜力的免疫促进剂。本实验以酚水法提取得到的灵杆菌多糖作为研究对象,应用苯酚—硫酸法、蒽酮—硫酸法、测定其多糖含量,并通过多次实验对各种方法测定糖含量的条件进行筛选。
关键词:灵杆菌素苯酚—硫酸法蒽酮—硫酸法含量测定
中图分类号:R96文献标识码:A文章编号:1672-3791(2011)09(c)-0060-01
1前言
1.1 关于灵杆菌素
灵杆菌素系微生物来源的免疫剂,是一种细菌性脂多糖,可诱生干扰素,调节人体免疫功能,具有恢复机体内环境稳定和抗病毒的作用,此品具有用量小、生理活性高、起效快等优点。对慢性盆腔炎总有效率为92%,对口腔粘膜性疾病总有效率达87.9%,对防治放化疗引起的白细胞减少症总有效率为91.6%,达到用国外同类产品水平,填补了国内空白,为国内首创水平。
1.2 标准曲线的应用
在利用苯酚—硫酸法测定多糖的研究中,王忠民[1]等利用苯酚—硫酸分光光度法测定葡萄多糖含量。研究显色温度、显色时间、苯酚及硫酸用量对葡萄多糖含量测定的影响。以此为基础,采用正交试验法确定最佳反应条件为:显色温度为沸水,显色时间为15min,苯酚用量为1.0ml,硫酸用量为5.0ml。证明此方法可测定多糖含量,结果准确,重现性好。
在利用蒽酮—硫酸法测定多糖的研究中,连锦明[2]等用蒽酮—硫酸法测定香菇中的活性多糖,研究了显色温度、显色时间、检测波长等对葡萄糖含量测定的影响,得到了较为优化的测定条件。证明了此方法测定糖的准确性好、稳定性好。
2材料与方法
2.1 实验目的
通过对两种常用测定糖含量方法的各种反应条件的研究比较,筛选出一种精确性好、专属性强、操作方法简单和结果比较稳定的方法,以此来测定灵杆菌多糖的含量。
2.2 实验仪器
紫外可见分光光度计、电子天平、水浴锅、干燥箱。
2.3 实验方法
2.3.1 苯酚-硫酸标准曲线法
吸取1ml葡萄糖溶液于具塞试管中,补蒸馏水至2.0ml,加苯酚溶液适量,摇匀后迅速滴加浓硫酸适量。摇匀后放置5min,置不同温度水浴中(20、50、75、100)加热数分钟,取出冷却至室温,在不同波长下测定吸光度值。
(1)标准曲线的绘制。
加样混匀后静置15min,置沸水浴中加热15min,取出迅速冷却至室温,在490nm处测定其吸光度,以吸光度为纵坐标,葡萄糖标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。
(2)灵杆菌素总糖含量的测定。
在1号试管中加入灵杆菌素标准品溶液0.1ml,蒸馏水1.9ml,1ml苯酚溶液和5ml浓硫酸,在2号试管中加入灵杆菌素标准品溶液0.2ml,蒸馏水1.8ml,1ml苯酚溶液和5ml浓硫酸,2ml蒸馏水作空白对照,混匀后静置5min,置沸水浴中加热15min[3],取出迅速冷却至室温,按标准曲线绘制项下方法在490nm处测定其吸光度。
2.3.2 蒽酮-硫酸标准曲线法
吸取1ml葡萄糖溶液于具塞试管中,补蒸馏水至2.0ml,加浓硫酸适量。摇匀后,置不同温度水浴中加热10min,取出冷却至室温,在不同波长下测定吸光度值。
(1)标准曲线的绘制。
加塞混匀后,置沸水浴中加热10min,取出迅速冷却至室温,在620nm处测定其吸光度,以吸光度为纵坐标,葡萄糖标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。
(2)灵杆菌素总糖含量的测定。
在1号试管中加入灵杆菌素标准品溶液0.1ml,蒸馏水1.9ml,蒽酮硫酸溶液5ml,在2号试管中加入灵杆菌素标准品溶液0.2ml,蒸馏水1.8ml,蒽酮硫酸溶液5ml,2ml蒸馏水作空白对照,加塞混匀后,置沸水浴中加热10min,取出迅速冷却至室温,按标准曲线绘制项下方法在620nm处测定其吸光度。
3实验结果
3.1 苯酚硫酸法反应条件筛选结果
利用苯酚硫酸法对不同显色温度、显色时间、苯酚用量、硫酸用量下的吸光值以及不同波长下的吸光值进行筛选,产生最大吸光值的为最佳反应条件,得出显色温度在100℃,显色时间为15min,苯酚用量为1.0ml,硫酸用量为5ml,波长为490nm时产生最大吸光值。
3.2 蒽酮硫酸法反应条件筛选结果
利用蒽酮硫酸法对不同显色温度、显色时间下的吸光值以及不同波长下的吸光值进行筛选,产生最大吸光值的为最佳反应条件,得出显色温度为100℃,显色时间为10min,波长为620nm时产生最大吸光值。
3.3 各种方法对灵杆菌素含量的测定
3.3.1 苯酚法测定灵杆菌素的总糖含量
利用苯酚硫酸法测定灵杆菌素总糖含量,样品吸光度为0.42时,含量为53.26%,样品吸光度为0.859时,含量为54.38%,则平均含量为53.82%。
3.3.2 蒽酮法测定灵杆菌素的总糖含量
利用蒽酮硫酸法测定灵杆菌素总糖含量,样品吸光度为0.258时,含量为58.34%,样品吸光度为0.517时,含量为59.26%,则平均含量为58.80%。
3.3.3 苯酚法测定灵杆菌多糖的含量
苯酚法灵杆菌多糖的含量=总糖含量(53.82%)-还原糖含量(2.0%)=51.82%
3.3.4蒽酮法测定灵杆菌素的含量
蒽酮法灵杆菌多糖的含量=总糖含量(58.80%)-还原糖含量(2.0%)=56.80%
4讨论
4.1 有关紫外分光光度法测糖的反应原理
4.1.1 蒽酮-硫酸法
糖类遇浓硫酸脱水生成糖醛或其衍生物,可遇蒽酮试剂缩合产生颜色物质,反应后溶液呈蓝绿色,在适当的波长处有最大吸收,显色与多糖含量呈线性关系[4]。
4.1.2 苯酚-硫酸法
多糖类在硫酸作用下,先水解成单糖分子,并迅速脱水生成糖醛衍生物,糖醛衍生物再与酚性物质如苯酚形成有色化合物,以比色法在适当波长处测定多糖含量。
4.2 实验结果分析
实验通过苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法对灵杆菌素的含量测定进行研究,实验结果只是针对本次实验得出的,由于测定时主观和客观因素的影响,实验数据可能不够严谨,实验方法还不够科学,但本次实验为灵杆菌多糖的含量测定做了铺垫工作,为进一步的研究提供了参考依据。
5结语
实验对灵杆菌素的含量测定的两种方法进行研究。首先进行单糖标准曲线的绘制,然后通过单因素实验对含量测定中的各种条件进行确定,再进行影响因素的考察,最后证实,应用苯酚－硫酸法进行含量测定时,显色温度为100℃,显色时间为15min,苯酚用量为1.0ml,硫酸用量为5.0ml,波长为490nm;应用蒽酮－硫酸法进行含量测定时,显色时间为10min,波长为620nm。
参考文献
[1]王忠民,王跃进,周鹏.苯酚-硫酸法测定葡萄多糖含量[J].新疆农业大学学报,2004,27(2):87～90.
[2]连锦明,黄颖,陈前火,等.蒽酮-硫酸法测定菌类保健品中的活性多糖[J].吉林化工学院学报,2003,20(1):13～15.
