参乌健脑胶囊 [参知健脑胶囊对Beagle犬的急性毒理研究]

　　[摘要] 目的：观察Beagle犬灌胃给予参知健脑胶囊后，所出现的急性毒性反应情况，为临床前反复给药的毒性研究和临床安全用药提供参考。方法：试验用Beagle犬6只，随机分为3组，分别为低、中、高剂量组，每组雌雄各1只，经口灌胃给药。实验设计的给药剂量分别为1 000、2 000和5 000 mg/kg，由于中、高剂量组动物药后呕吐，中剂量组2只动物的实际给药剂量均约为2 000 mg/kg，高剂量组2只动物的实际给药剂量为2 209和3 092 mg/kg，药物浓度为100 mg/ml。给药后进行了14 d的临床观察，期间进行了体重、体温、心电图、血细胞计数、凝血功能、血液生化和眼科检查指标检测。观察期结束后，将所有动物安乐处死，进行解剖观察。结果：试验期间，没有发现动物死亡或濒死。低剂量组动物未见临床异常反应，中、高剂量组4只动物临床反应为药后一过性呕吐和稀便，药后次日至观察期结束未见异常反应。6只动物的体重、体温、心电图、血细胞计数、凝血功能、血液生化、眼科检查等均未见有与药物相关的规律性改变。大体解剖未见组织、脏器的病理改变。结论：在本试验条件下，参知健脑胶囊单次灌胃给予Beagle犬，安全剂量为1 000 mg/kg，最大耐受量（MTD）大于3 000 mg/kg。
　　[关键词] 参知健脑胶囊；Beagle犬；急性毒理研究
　　[中图分类号] R977 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）01（a）-054-05
　　
　　Acute toxicological study of Shenzhi Jiannao Capsule on Beagle Dogs
　　MA Dayong1, HAN Zhenyun2*, FAN Jiping3
　　1.Department of Encephalopathy, Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100700, China; 2.Department of Encephalopathy, Dongfang Hospital Affiliated to Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100078, China; 3.China Academy of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100700, China
　　[Abstract] Objective: To observe the acute toxicity reaction of Beagle dogs after poured Shenzhi Jiannao Capsule into their stomachs to provide reference for toxicity study of dosing repeatedly before clinical research and safe use of drugs in clinical research. Methods: Six Beagle dogs were randomly divided into three groups, including QDTMTL, QDTMTM and QDTMTH with one male and one female in every group. The drug administration was oral gavage. The dosages of original design were designed as 1 000, 2 000 and 5 000 mg/kg, but due to vomitting of QDTMTM and QDTMTH after oral gavage, the actual dosage of QDTMTM was both approximately 2 000mg/kg, and the actual dosage of QDTMTH were approximately 2 209 and 3 092 mg/kg. There was a 14-day clinical observation after dose, and among that period, the animals′weight, temperature, ECG, blood cell count, blood coagulation, blood biochemistry, eye examination were observed. Afer clinical observation, all the dogs were euthanized, and observed for the gross anatomy. Results: In the period of test, there wasn"t animal death or articulo mortis; there wasn"t abnormal clinical reaction found in QDTMTL, but transient vomiting and loose stools after oral gavage were observed in QDTMTM and QDTMTH. However, there wasn"t abnormal clinical reaction from morrow to end of the experiment. There wasn"t any regularly change of drug-related in the results of all the animals′weight, temperature, ECG, blood cell count, blood coagulation, blood biochemistry, eye examination. There was no change abnormal in the gross anatomy of animals′tissue and viscera. Conclusion: In this experiment condition, the safe dose of single gavage of Shenzhi Jiannao Capsule for Beagle dogs is 1 000 mg/kg, and MTD is greater than 3 000 mg/kg.
　　[Key words] Shenzhi Jiannao Capsule; Beagle dog; Acute toxicological study
　　
　　参知健脑胶囊是以王永炎院士提出的血管性痴呆“正虚毒损络阻”创新病因病机学说为指导研发而来[1-4]，主要由人参、知母、赤芍等药物提取物按一定比例优化配伍而成[5]，具有扶正通络解毒的功效[6-7]，是国家重大新药创制项目的候选新药。
　　本研究旨在观察参知健脑胶囊对Beagle犬的急性毒理反应，为临床前反复给药的毒性研究及临床安全用药提供实验依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验药物
　　参知健脑胶囊由北京中医药大学中药学院提供，批号：20100907。
　　1.2 实验动物
　　5～7个月龄普通级Beagle犬6只，雌雄各半，体重：雌性5.85～6.68 kg，雄性6.45～7.47 kg，由北京玛斯生物技术有限公司提供，合格证号：0165269。
　　1.3 动物饲养与管理
　　在北京昭衍新药研究中心有限公司普通级动物房饲养，所有动物购入后，由兽医负责检疫，检疫驯养期15 d；饲料由北京科澳协力饲料有限公司生产；动物饮用水为符合国家生活饮用水卫生标准的自来水，用饮水盆供应，外观和细菌指标每月检测一次；不锈钢材料笼具，规格为长×宽×高＝1 250 mm×800 mm×900 mm，单笼饲养；动物房设定的温度范围是18~26℃，实测温度范围是18～23℃，设定的湿度范围是40%~70%，实测湿度范围是29％~66％，光照12 h明暗交替。除实验方案规定的禁食时间外，每只动物每天上午和下午各喂食1次，每次喂食150 g左右，动物自由摄水；笼具每天冲洗1次，动物房地面和墙面每周消毒1次，用0.1%新洁尔灭或0.5%的84消毒液擦拭消毒，两种消毒液交叉使用。
　　1.4 动物分组
　　 采用区段随机法分组，即按性别将动物分成雌雄两个区段，然后用Excel软件给出每个动物的随机数，之后将随机数从小到大进行排序，将比格犬分为3组，每组雌雄各1只。
　　1.5 药物配制
　　根据给药前最近1次的动物体重，计算各组动物的给药量。称取适量供试品，用灭菌注射用水溶解。溶解后的供试品常温条件下保存使用。
　　1.6 给药剂量及方法
　　首次给药剂量、给药浓度、给药容量见表1。
　　
　　表1 第1次灌药剂量
　　
　　
　　
　　
　　注：人体重按60 kg计算，临床拟用剂量为17.5 mg/kg
　　
　　由于中、高剂量组动物药后半小时左右呕吐，呕吐物颜色与给予的供试品相似，考虑给药量不能达到实验设计要求。此外，低剂量组动物没有呕吐，考虑动物呕吐可能与药物浓度较高有关。所以，在首次给药2 d后，对中、高剂量组动物进行了第2次给药，并对给药容量和药物浓度进行了相应的调整，具体见表2：
　　
　　表2 第2次灌药剂量
　　
　　
　　
　　
　　
　　 灌胃给药，低剂量组动物给药1次，中、高剂量组动物给药2次。动物灌胃前禁食过夜，药后再禁食约1 h。灌胃给药时，使用20 ml一次性注射器准确抽取所需溶液，用16号灌胃管经口灌胃给药，每只动物给药完毕后给予约10 ml饮用水冲洗胃管。
　　1.7 检测指标
　　1.7.1 临床观察
　　 一般临床观察内容：笼旁观察动物死亡或濒死情况、精神状态、行为活动、进食情况、粪便形状等；详细临床观察内容：精神状态、行为活动、皮肤、被毛、眼、耳、鼻、口腔、腹部、外生殖器、肛门、四肢、足和呼吸等。
　　1.7.1.1 给药当天 给药后笼旁观察，1 h内连续观察，每隔15 min记录1次，1～4 h内至少每隔1 h观察1次；对未出现明显异常反应的动物，4 h后结束观察；对出现明显异常表现的动物，进行1次详细临床观察，部分动物药后5 h结束观察。给药当天的笼旁观察和详细临床观察均记录在同一张记录表中。
　　1.7.1.2 其他时间 观察时间：检疫驯养期每天1次一般临床观察；给药后次日开始，每天上午和下午各进行1次一般临床观察，第7天和第14天进行详细临床观察，观察期为14 d。在同一时间段，一般临床观察与详细临床观察不重复实施。
　　1.7.2 生命体征
　　1.7.2.1体重 给药前、给药后第7天和第14天称重，每次称重均在上午喂食前进行。
　　1.7.2.2体温 给药前、药后4～5 h、第7天和第14天测量体温。
　　1.7.2.3心电图 测定时间：给药前、药后4～5 h、第7天和第14天，心电指标包括心率、P-R间期、Q-T间期和QRS时限。
　　1.7.3 血液学检查
　　给药前、给药后第7天和第14天三个时点取血，动物前肢皮下静脉取血；血常规血样用EDTA-2K抗凝，用Bayer Advia 2120全自动血球分析仪测定；血凝血样用枸橼酸钠1∶9抗凝，分离血浆，使用MC-4Plus四通道血凝仪测定，用光学比浊法；血生化血样不抗凝，取血后2 h内分离血清。使用TBA-120FR型全自动生化分析仪和Medica Easylyte型全自动电解质分析仪测定。
　　1.7.3.1 血常规 包括红细胞计数网织红细胞计数、血红蛋白、红细胞容积、平均红细胞血红蛋白、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白浓度、血小板计数、白细胞计数、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞。
　　1.7.3.2 血凝 包括凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）。
　　1.7.3.3 血生化 天门冬氨酸氨基转换酶（AST）、丙氨酸氨基转换酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、肌酸磷酸激酶（CK）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血糖（GLU）、总胆红素（TBil）、钾离子浓度（K+）、钠离子浓度（Na+）、氯离子浓度（Cl-）。
　　1.7.4 眼科检查
　　给药前以及给药后第14天行眼科检查。检查方法为通过肉眼或检眼镜观察动物的眼睑、结膜、巩膜、角膜、前房、虹膜、瞳孔、晶体、玻璃体和眼底有无明显异常。
　　1.7.5 病理检查
　　所有动物实验结束后均进行大体解剖，发现任何组织器官体积、颜色、质地等肉眼可见的病变时，记录并将有异常改变的组织器官取材并固定于10％中性福尔马林溶液中，制片并进行组织病理学检查。
　　1.8 动物麻醉及安乐死方法
　　观察期结束（给药后第15天）时，用浓度为30 mg/ml的戊巴比妥钠溶液，按30 mg/kg的剂量静脉注射麻醉动物，直至动物进入无意识状态后，股动脉快速放血，将动物安乐死。
　　1.9 数据处理方法
　　将不同组别及同一组动物给药前后的体重、体温、心电图、血液细胞计数、凝血功能和血液生化等指标直接进行比较，综合评价。
　　2 结果
　　2.1 不同组别给药后的临床观察
　　试验期间，没有发现动物死亡或濒死。低剂量组（1 000 mg/kg）2只动物未见异常反应；中、高剂量组的4只动物临床反应主要是药后出现呕吐和稀便，药后次日至观察期结束未见异常反应。
　　2.2 不同组别给药前后体重的变化
　　试验期间，各剂量动物的体重均呈增长趋势，增长幅度未见明显异常。见表3。
　　
　　表3 不同组别给药前后体重的变化（kg）
　　
　　
　　
　　
　　
　　
　　
　　2.3 不同组别给药前后体温的变化
　　试验期间，各剂量组动物的体温基本在正常参考值范围内波动，未见与药物相关的规律性变化。
　　2.4 心电图
　　试验期间，各剂量组动物的心电参数在动物正常参考值范围内波动，未见明显异常改变。
　　2.5 血液学
　　2.5.1 不同组别给药前后血细胞计数的变化
　　 试验期间，各剂量组动物的血细胞计数在动物正常参考值范围内波动，未见有规律性的明显异常改变。见表4。
　　2.5.2 不同组别给药前后凝血功能的变化
　　试验期间，各剂量组动物的凝血功能指标未见有规律性的明显异常改变。见表5。
　　2.5.3 不同组别给药前后血液生化量的变化
　　试验期间，各剂量组动物的血液生化指标在正常参考值范围内波动，未见有规律性的明显异常改变。见表6。
　　2.6 眼科检查
　　各剂量组动物的眼睑、结膜、角膜、虹膜、巩膜、前房、瞳孔、晶状体、玻璃体和眼底均未见异常改变。
　　2.7 病理学检查
　　所有动物大体解剖观察，各组织脏器均无肉眼可见异常改变。
　　2.8 影响研究可靠性和造成研究工作偏离实验方案的异常情况
　　试验期间，饲养室设定湿度范围为40%~70%，实测湿度范围为29%~66%，其中有部分时间段湿度超过设定的下限，最长时间不超过1.5 h。由于偏离的时间较短，在此期间未见动物因湿度的变化出现相关的异常表现，故认为此项偏离不影响试验结果的可靠性。此外，未见影响研究可靠性和造成研究工作偏离实验方案的其他异常情况。
　　3 讨论
　　Beagle犬灌胃给予参知健脑胶囊，当给药剂量为2 000 mg/kg及以上剂量时，可见动物出现呕吐和稀便；给药剂量为1 000 mg/kg时，未见异常反应。2 000 mg/kg剂量组动物共给药2次；第1次给药容量与1 000 mg/kg剂量组相同，药物浓度为1 000 mg/kg剂量组2倍；第2次给药容量为1 000 mg/kg剂量组的2倍，药物浓度与1 000 mg/kg剂量组相同。该组动物2次给药后均发生呕吐，呕吐反应发生时间为药后30～40 min，提示动物药后呕吐与给药剂量相关。
　　第2次给药后，由于动物呕吐，高剂量组2只动物的实际给药剂量为2 209和3 092 mg/kg。由于中、高剂量组动物的实际给药剂量均大于2 000 mg/kg，且两组动物药后均可见到稀便，而1 000 mg/kg剂量组动物未见该反应，提示动物稀便与给药剂量相关。
　　中、高剂量组动物药后次日动物即恢复正常，呕吐和稀便为一过性反应。试验期间，这两组动物的体重、体温、心电图、血液学、血液生化、眼科和大体解剖等检查均未见明显异常，表明在本试验条件下，Beagle犬灌胃给予2 000 mg/kg的供试品，耐受性较好。
　　在本试验条件下，参知健脑胶囊灌胃给予Beagle犬，安全剂量为1 000 mg/kg，最大耐受量（MTD）大于3 000 mg/kg。
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　　（收稿日期：2011-10-17）