摘 要：考察了分离得到的一株产中性蛋白酶枯草芽孢杆菌B.SUBT12最适作用温度、pH值以及温度、pH值、金属离子和表面活性剂对酶稳定性的影响。试验研究表明：该酶最适作用温度为
55℃，最适作用pH为7.5，酶在
55℃反应45min仍有50%的酶活力，热稳定性较好。金属Ca
2+和表面活性剂Tween-80对酶有一定的激活作用，但激活作用不太明显。
关键词:枯草芽孢杆菌；
中性蛋白酶；
酶学性质；
中国分类号: Q925.2 文献标码: A
中性蛋白酶是一类适合于在中性条件下水解蛋白质肽键的酶类,最早被发现并广泛应用于工业化生产,可用于皮革脱毛、动物血液蛋白酶水解制备复合氨基酸营养液[1]、大豆蛋白水解[2]以及医学治疗[3]等应用领域中。目前国内外有关中性蛋白酶的研究相当的多[1-7]。酶作用条件不是酶的特征性参数,因环境的改变而改变,酶活力不仅受温度、pH的影响,而且还易受到金属离子、表面活性剂等环境因素的影响。因此,本试验着重考察了酶反应体系温度、pH值、金属离子以及表面活性剂对酶作用条件及稳定性的影响,希望通过此研究得到B.SUBT12的最佳反应条件和酶的稳定性,为其应用奠定良好的理论基础。
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌种 由课题组分离得到，经初步鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )。
1.1.2 培养基
1.1.2.1 牛肉膏蛋白胨培养基[8] 培养基配方略。
1.1.2.2发酵培养基[9] 培养基配方略。
1.2 方法
1.2.1 菌种鉴定 通过观察菌落形态、培养特性及生理生化特性等对B.SUBT12进行鉴定。
1.2.2酶活力测定 按Folin-酚法[10]
1.2.4 酶最适作用温度 将稀释粗酶液分别于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃不同温度下反应,测定其蛋白酶活力。以温度为横坐标,相对酶活力为纵坐标作图。
1.2.5 酶最适pH值的研究 分别配制pH(3.0～10.5)不同的1%的干酪素溶液,按Folin-酚法[10]进行蛋白酶活力测定。以pH为横坐标,以相对酶活力为纵坐标作图。其中pH3.0-5.0由Na2HPO4-柠檬酸缓冲液配制,pH6.0-8.0由磷酸缓冲液配制,pH9.0由硼酸缓冲液配制,pH10.0由硼砂-NaOH缓冲液配制。
1.2.6 温度对酶稳定性的影响 取20ml稀释粗酶液于55℃恒温水浴10min、20min、30min、40min、50min、60min,然后测定其残存酶活力,以时间为横坐标,相对酶活力为纵坐标作图。
1.2.7 pH对酶热稳定性影响 用pH7.5的缓冲液定容1ml粗酶液至100ml,分别取20ml稀释酶液于40℃、50℃、60℃、70℃保温30min,测残余酶活。以温度为横坐标,相对酶活力为纵坐标作图。
1.2.8 金属离子对酶稳定性的影响 在稀释酶液中加入0.1mol/L的不同金属离子,保温30min,测定蛋白酶活力,以金属离子作横坐标,蛋白酶活力作纵坐标作图。
1.2.9 表面活性剂对酶稳定性的影响 在稀释粗酶液中加入不同体积的表面活性剂Tween80 (1-5ml),于40℃保温30min,然后测定其蛋白酶活力。以Tween-80添加量作横坐标,酶活力为纵坐标作图。
2 结果与分析
2.1 菌种鉴定
细胞杆状,成链状排列,端口成圆形,芽孢椭圆或圆形,单芽孢,兼性好氧,能利用葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖和D-甘露糖产酸。葡萄糖产气,最适生长温度35-37℃, 5℃和50℃以上无法生长,菌落成乳白色,边缘整齐,表面有皱褶、隆起,菌落表面干燥,G+,菌落不透明,M.R试验、V.P试验、过氧化氢酶试验均为阳性,可利用丙二酸盐。初步鉴定为枯草芽孢杆菌.
2.2 酶最适作用温度
将粗酶液分别于不同温度下反应,测定其蛋白酶活力。结果如图1。从图1可以看出，酶在55℃酶活性最高，在45℃-60℃有较好的稳定性，酶最适作用温度为55℃。
2.3 酶最适作用pH值
将稀释粗酶液于不同pH值的缓冲液体系中反应,然后测定其蛋白酶活力,结果如图2。从图2可以看出,酶在pH7.5缓冲液体系中酶活力最高。因此酶最适pH为7.5。
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