葛花总黄酮通过TLR4/MyD88/NF-κB通路减轻糖氧剥夺对人脑血管内皮细胞损伤的机制
时间：2023-06-19 19:05:04 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
陈梦宇 张金武 杜杰 肖骋
(咸宁市中心医院 湖北科技学院附属第一医院神经内科，湖北 咸宁 437000)
脑卒中又称为“中风”，是临床上常见的一种急性脑血管疾病，由于脑部血管裂开或阻塞导致的血液不能正常流入大脑组织引起脑组织损伤，引起缺血性或出血性脑卒中，其发病率、死亡率和致残率较高，是威胁患者生命健康安全的头号杀手〔1〕。葛花是豆科野葛或甘葛藤的花，主要生产地集中在河南、四川、广东、浙江和安徽等地，常用于治疗解酒醒脾、不思饮食、吐血、状热、头晕等症状〔2～4〕。葛花具有降低血糖、抗炎和抗肿瘤等功效，黄酮类是葛花含量较高的活性成分〔5〕，葛花总黄酮(TFG)减缓小鼠脑组织的炎症反应，抑制神经细胞凋亡，减缓脑部缺血再灌注损伤，对脑组织起到保护作用〔6〕，但是对糖氧剥夺(OGD)诱导人脑血管内皮细胞的研究尚不明确。Toll样受体(TLR)4/髓样分化的初级应答(MyD88)/核因子(NF)-κB通路是参与炎症反应的经典通路，与多种疾病的发展密切相关〔7〕。张业昊等〔8〕研究结果显示，黄芩苷通过调控TLR4/NF-κB信号通路减缓缺氧复氧诱导人脑微血管内皮细胞(HBMEC)炎性损伤。本研究探讨TFG通过TLR4/MyD88/NF-κB通路减轻OGD对人脑血管内皮细胞损伤的机制。
1.1细胞和主要试剂 HBMEC购于美国ATCC公司；
胎牛血清购于美国Hyclone公司；
高糖DMEM培养基、DMEM培养基购于美国Gibco BRL公司；
TFG(含量50.57%)购于南京泽朗医药公司；
pcDNA、TLR4购于上海吉玛公司；
Lipofectamine2000试剂盒购于美国Invitrogen公司；
噻唑蓝(MTT)试剂盒、凋亡试剂盒购于北京索莱宝公司；
B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关X蛋白(Bax)抗体、裂解的胱天蛋白酶(Cleaved cas)3抗体、TLR4抗体、MyD88抗体、p-NF-κB抗体、NF-κB抗体、GAPDH抗体购于美国Santa Cruz公司；
辣根过氧化物酶(HRP)标记的IgG抗体购于北京中山金桥公司；
超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、白细胞介素(IL)-6、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α试剂盒购于南京建成生物研究所。
1.2细胞培养和分组 复苏HBMEC在含有10%胎牛血清、双抗的高糖DMEM培养基内，并在条件为37℃、5% CO2培养箱中进行培养。观察细胞的生长状态，待细胞生长至80%时，加入胰酶消化，每2 d换1次培养基。
取对数生长期的HBMEC接种在96孔板中，冲洗2次更换为无糖培养基，然后将细胞培养板放置在95%N2、5%CO2培养中培养6 h，建立OGD细胞模型，将细胞分为对照(Control)组、OGD模型(OGD)组、OGD模型+TFG低、高剂量(OGD+TFG-L、OGD+TFG-H)组、OGD+TFG+pcDNA组和OGD+TFG+TLR4组。Control组在正常条件下培养，不做任何处理，其余5组进行OGD处理，OGD+TFG-L组、OGD+TFG-H组：TFG低、高剂量浓度为10、100 mg/L处理；
OGD+TFG+pcDNA组、OGD+TFG+TLR4组：将pcDNA、TLR4转染至细胞，并采用浓度为100 mg/L TFG处理。细胞转染时采用Lipofectamine2000试剂盒说明书进行。
1.3MTT检测细胞活力 取1.2各组HBMEC调整密度为5.0×104/ml，并接种在96孔板中，在37℃、5% CO2培养箱固定培养48 h，然后在每孔内加入20 μl的MTT试剂，继续培养4 h，在每孔内加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)试剂，结晶充分溶解后，在酶标仪490 nm处检测细胞吸光度值，计算细胞活力。
1.4流式细胞术检测细胞凋亡 取1.2各组HBMEC培养48 h后，采用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2遍，按照凋亡试剂盒说明书步骤，分别加入膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)试剂10 μl，再加入碘化丙啶(PI)试剂5 μl，在暗室中反应15 min，1 h内在流式细胞仪上检测细胞凋亡情况。
1.5Western印迹检测Bax、Cleaved cas3和TLR4/MyD88/NF-κB通路相关蛋白表达 取1.2各组HBMEC提取总蛋白后，按照二喹啉甲酸(BCA)法检测定量蛋白。取45 μg蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电泳结束后转移到PVDF膜上，脱脂奶粉封闭培养2 h，加入一抗Bax、Cleaved cas3、TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB和GAPDH，4℃过夜培养，加入HRP标记的IgG抗体，室温培养2 h，加入发光液显影、曝光。Quantity One软件扫描蛋白条带灰度值，以GAPDH作为内参，计算分析目的蛋白表达。
1.6酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞SOD、GSH-Px、IL-6、IL-10和TNF-α表达 取1.2各组HBMEC，PBS清洗2遍，裂解震荡，离心后收集细胞上清液，按照SOD、GSH-Px、IL-6、IL-10和TNF-α试剂盒说明书，检测SOD、GSH-Px、IL-6、IL-10和TNF-α表达。
1.7统计学分析 采用SPSS20.0软件进行t检验、方差分析。
2.1TFG对OGD诱导HBMEC增殖和凋亡的影响 与Control组相比，OGD组细胞活力显著降低，细胞凋亡率、Bax、Cleaved cas3蛋白表达显著增加(均P<0.05)；
与OGD组相比，OGD+TFG-L组、OGD+TFG-H组细胞活力显著增加，细胞凋亡率、Bax、Cleaved cas3蛋白表达显著降低(均P<0.05)。见图1、图2、表1。
图1 TFG对OGD诱导HBMEC凋亡的影响
1～4:Control组、OGD组、OGD+TFG-L组、OGD+TFG-H组图2 Western印迹检测相关蛋白表达
表1 TFG对OGD诱导HBMEC增殖和 凋亡的影响
2.2TFG对OGD诱导HBMEC氧化应激的影响 与Control组相比，OGD组SOD、GSH-Px活性显著降低(P<0.05)；
与OGD组相比，OGD+TFG-L组、OGD+TFG-H组SOD、GSH-Px活性显著升高(P<0.05)。见表2。
2.3TFG对OGD诱导HBMEC炎症反应的影响 与Control组相比，OGD组IL-6、IL-10、TNF-α表达显著升高(P<0.05)；
与OGD组相比，OGD+TFG-L组、OGD+TFG-H组IL-6、IL-10、TNF-α表达显著降低(P<0.05)。见表2。
2.4TFG对OGD诱导HBMEC TLR4/MyD88/NF-κB通路的影响 与Control组相比，OGD组TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白表达显著升高(P<0.05)；
与OGD组相比，OGD+TFG-L组、OGD+TFG-H组TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白表达显著降低(P<0.05)。见表3、图3。
表2 TFG对OGD诱导HBMEC氧化应激、炎症反应、TLR4/MyD88/NF-κB通路的影响
表3 TFG通过TLR4/MyD88/NF-κB通路对OGD诱导HBMEC增殖、凋亡、氧化应激和炎症反应的影响
2.5TFG通过TLR4/MyD88/NF-κB通路对OGD诱导HBMEC增殖、凋亡的影响 与OGD+TFG+pcDNA组相比，OGD+TFG+TLR4组细胞活力显著降低，TLR4蛋白表达、细胞凋亡率、Bax、Cleaved cas3蛋白表达显著升高(P<0.05)。见表3、图4、图5。
2.6TFG通过TLR4/MyD88/NF-κB通路对OGD诱导HBMEC氧化应激和炎症反应的影响 与OGD+TFG+pcDNA组相比，OGD+TFG+TLR4组SOD、GSH-Px活性显著降低(P<0.05)，IL-6、IL-10、TNF-α表达显著升高(P<0.05)。见表3。
1～4:Control组，OGD组，OGD+TFG-L组，OGD+TFG-H组图3 TFG对OGD诱导HBMEC TLR4/ MyD88/NF-κB通路的影响
图4 葛花总黄酮通过TLR4/MyD88/NF-κB通路对 OGD诱导HBMEC凋亡的影响
1～2:OGD+TFG+pcDNA组，OGD+TFG-TLR4组图5 Western印迹检测TLR4、Bax、 Cleaved cas3蛋白表达
脑卒中是脑部血管疾病常见的疾病，大约占全部脑血管疾病的70%，目前关于治疗脑卒中尚无有效的方法〔9〕。脑血管内皮细胞缺氧或缺血能够促进炎症因子的分泌、促进细胞氧化自由基损伤，因此，如何改善脑血管内皮细胞功能紊乱引起的脑卒中至关重要〔10，11〕。葛花作为中国的传统医药，具有多种活性成分，如黄酮类、挥发油类和皂苷类等〔12，13〕。康乐等〔14〕研究结果显示，TFG可以减缓大鼠局灶性脑缺血再灌注炎性反应，保护脑组织免受损伤。TFG能够减低胰岛素抵抗，改善大鼠的认知功能，减缓大鼠海马神经元的炎性损伤〔15〕。本研究结果说明，TFG可以抑制OGD诱导HBMEC的凋亡、氧化应激和炎症反应，并促进细胞增殖。
TLR4是一种跨膜蛋白，广泛存在各种细胞内，能够识别病原分子引起炎症反应，且活化的TIR结构域激活MyD88依赖性途径，引起NF-κB被活化〔16，17〕。研究发现，TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表达在小鼠胶质细胞中表达下调，利用siRNA干扰技术，发现TLR4 siRNA抑制小鼠胶质细胞的自噬和脑部出血引起的炎性损伤〔18〕。韩晨阳等〔19〕研究显示，丁苯酚通过抑制抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路减缓糖氧剥夺导的HBMEC的炎症反应和细胞凋亡。本研究结果说明，TFG可以调控TLR4/MyD88/NF-κB通路的表达。在HBMEC转染TLR4后，结果发现，过表达TLR4可以抑制OGD诱导HBMEC的增殖，促进细胞的凋亡、氧化应激和炎症反应，说明TFG通过调控TLR4/MyD88/NF-κB通路减轻OGD诱导HBMEC损伤。
猜你喜欢脑血管氧化应激试剂盒全脑血管造影术后并发症的预见性护理中国典型病例大全(2022年13期)2022-05-10脑血管造影中实施改良规范化住院医师培训的临床意义现代临床医学(2021年6期)2021-11-20基于炎症-氧化应激角度探讨中药对新型冠状病毒肺炎的干预作用世界科学技术-中医药现代化(2020年2期)2020-07-25试剂盒法制备细胞块的效果及其技术要点天津医科大学学报(2019年6期)2019-08-13基于CLSI-M43国际标准改良的Mycoview-AST试剂盒检测性能评估现代检验医学杂志(2016年2期)2016-11-14氧化应激与糖尿病视网膜病变西南军医(2016年6期)2016-01-23纳洛酮治疗脑血管疾病的临床效果中国当代医药(2015年33期)2015-03-01尼麦角林注射液治疗脑血管功能不全观察西南国防医药(2015年11期)2015-02-28氧化应激与结直肠癌的关系西南军医(2015年2期)2015-01-22牛结核病PCR诊断试剂盒质量标准的研究当代畜禽养殖业(2014年6期)2014-02-27
