果胶寡糖的制备、分离纯化及其生物活性研究进展

孔 慧，张达莉，徐海山，傅鑫程，王蓉蓉，单 杨，丁胜华,*

（1.湖南大学研究生院隆平分院，湖南 长沙 410125；
2.湖南省农业科学院农产品加工研究所，果蔬贮藏加工与质量安全湖南省重点实验室，湖南 长沙 410125；
3.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410128）

果胶是一种结构非常复杂的多糖，平均相对分子质量为50～300 kDa，主要存在于高等植物细胞壁中[1]。果胶的分子结构分为光滑区和毛发区，光滑区由D-半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键聚合形成线性主链，毛发区由高度分支的L-鼠李半乳糖醛酸构成主链，阿拉伯糖、半乳糖、木糖和葡萄糖等中性糖组成侧链[2]。果胶主要由聚半乳糖醛酸（homogalacturonan，HG）、鼠李半乳糖醛酸聚糖（rhamnogalacturonan，RG）-I、RG-II和木聚半乳糖醛酸（xylogalacturonan，XGA）等结构域组成[2-6]，这些结构域相互结合形成不同结构的果胶，因此活性也存在差异。果胶在水果及其残渣中（柑橘皮（30.0%）、柠檬皮（23.8%）、苹果肉（20.9%）、芒果（21.0%）和山楂（10.3%）[7]）含量丰富，市售商品果胶主要为柑橘果胶和苹果果胶。我国食品行业对果胶需求量很大，每年消耗量在4 000 t以上，但其中80%依赖进口[8]，主要是因为我国果蔬副产物加工利用率低，大部分加工副产物未得到充分利用，潜在经济价值亟待挖掘开发。近年来，有研究报道，柑橘罐头加工的脱囊衣酸碱废水也是提取回收果胶新的重要来源[9-12]。

果胶具有良好的增稠、稳定、胶凝、乳化等特性，在食品工业中可用作多种食品添加剂。同时果胶作为一种天然、安全的多糖，具有多种生理活性，如促进肠道蠕动、降血脂、降胆固醇、吸附重金属离子[13-15]、抗肿瘤[16]、抗癌[17]、抗氧化[18-20]、抗菌[21]和作为益生元等，被广泛应用于食品、医药、化工等行业。天然果胶分子质量大、溶解性差，不易被人体吸收利用，限制了其生物活性的发挥和在功能食品中的应用[22]。而果胶寡糖（pectic oligosaccharides，POS）是由天然果胶降解得到的一种分子质量较小、溶解度较高的低聚寡糖，结构更加明确，不仅更容易被吸收[23]，而且具有更强的生物活性[24]。大量研究表明，在不同制备条件下，会得到一系列不同分子质量和结构的POS。而POS的生物活性与其分子质量及结构之间存在着密切关系。因此，探究如何制备适合分子质量大小和结构的POS成为当今的研究热点。本文以POS为主要研究对象，综述了POS的制备、分离纯化、结构鉴定方法及其生物活性等方面的研究进展，旨在为POS的研究应用提供理论参考。

目前POS的制备方法包括3 种：从天然原料中直接提取法、化学合成法及降解法。直接提取法是获得POS最初的手段[25]，但由于直接提取法得到的提取物成分复杂、分离困难，导致该法未广泛应用。化学合成法因合成线路繁琐、副反应多、难以分离纯化[26]，目前还未实现工业量产。而果胶来源广泛、价格低廉，因此，选择合适的方法进行降解是目前制备POS的主要途径。按照作用原理，POS的降解制备方法包括物理法降解、化学法降解、酶法降解和联合法降解。

1.1 物理法降解

1.1.1 超声降解

超声降解的主要机理是利用超声波（ultrasound，US）产生剧烈的空化效应和机械效应（扰动、高剪切、破碎和搅拌等），使物料周围的水或氧分子分解为·OH、H·和HO2·等活性自由基[27]（反应式（1）～（3）表示US作用），引发有机物高温水解、化学键断裂、自由基氧化等反应，从而发挥其降解效应。超声不会产生二次污染，具有环保、温和、省时、低成本等特点，已被广泛应用于果胶的降解改性研究中[28]。

超声降解果胶受多种因素的影响[29]，如超声强度[30-31]、超声温度[32]、超声时间[33]、pH值[34]和占空比[32]等（表1）。Qiu Wenyi等[30]研究结果表明超声强度越高，半柔性果胶在水溶液中的分子和构象参数变化越大。Yan Jingkun等[34]对柑橘果胶在不同pH值（4.0、7.0、10.0）条件下进行超声处理，发现在高pH值下进行超声处理会导致果胶特性黏度和重均分子质量（mw）的降低更为显著。一般超声效应随超声强度、温度的增加和时间的延长而升高，但不会无限增加[35]。Zhang Lifen等[32]发现超声强度过高或过低均不利于反应进程，当温度从5 ℃升高到45 ℃时，超声效应会有所下降，表明低温下超声效应更显著。Liu Donghong等[36]的研究也得出类似结论。由于在长时间或高强度的超声场下，能量在传递过程中逐渐衰减，导致该法降解能力有限，只能产生大于20 kDa的POS，因此通常将其作为一种辅助降解手段[37]。

表1 超声降解法制备POSTable 1 POS preparation by ultrasonic degradation of pectin

1.1.2 辐照降解

辐照降解作为辐照技术的一个分支，也是一种制备POS的有效方法[40]，其主要机理是高能射线作用于果胶时，能够打断分子间的连接键形成自由基，引发糖苷键断裂，破坏分子链的结构，从而使果胶发生降解[41]。影响辐照降解的因素有辐照源、辐照剂量、温度、时间和pH值等，其中辐照源对辐解有直接影响。微波、60Co γ射线、电子束、紫外线等应用广泛，γ射线、微波辐射穿透能力较强，为100 mm，其次是电子束辐射（l～10 mm），紫外线的穿透能力小于0.1 mm[42]。使用不同的辐照源，果胶的辐解程度和产物种类也会有所差异。

微波是一种频率为300 MHz～300 GHz的电磁波，其热效应能够导致果胶糖苷键断裂，引发降解，具有受热均匀、处理时间短、绿色环保等优点[43]。近来有研究报道，微波降解果胶过程还伴随着微波非热效应[44-45]，但具体是哪种非热效应导致果胶降解，机理如何，还有待进一步探究。以60Co为γ射线源的辐解具有高效、简洁等特点，在果胶降解应用上的优势得以突现。Kang等[46-47]采用60Co γ射线对柑橘果胶进行20 kGy剂量的辐照处理，得到了分子质量小于10 ku的POS。Gamonpilas等[48]利用电子束降解柚子皮果胶，辐照剂量为3～250 kGy，结果表明电子束辐照剂量越高，分子质量越低。电子束辐解不依赖60Co等放射源，且处理时间短，因此被认为比γ辐射技术更安全、更经济。但电子束辐照的一个主要缺点是穿透深度不够[49-50]。此外，还可利用紫外线（ultraviolet，UV）作为辐射源来降解果胶[51-52]。相对常规降解工艺而言，辐照降解具有操作简单、绿色环保、降解效率高等优势，但辐照降解法也存在技术门槛高、综合投资大等限制因素。

辐照降解法制备POS的研究汇总如表2所示。

表2 辐照降解法制备POSTable 2 POS preparation by radiation degradation of pectin

1.1.3 高压降解

高压处理分为静高压技术和动态高压技术，静高压处理不会引起果胶主链的降解，而动态高压处理时，果胶会发生降解[55]。因此，目前通过高压降解制备POS主要是采用动态超高压均质（dynamic high pressure homogenization，DHPH）和动态超高压微射流（dynamic high pressure micro-fluidization，DHPM）（表3）。其中DHPH在食品、药品和化妆品等行业中早已得到广泛应用[56-57]。近年来，DHPH也越来越多地用于果胶的降解研究中。徐柔[58]采用DHPH处理秋葵果胶后其分子质量从542 kDa降至277 kDa，粒径从4 835 nm减至1 710 nm，并发现80 MPa处理后的果胶分子质量分布最为均匀，溶液更为稳定。DHPM是一种新兴的动态高压均质技术，其作用机理是在高压环境中，果胶受到高频振荡、强剪切力、空化和涡旋等作用，引起机械性超微粉碎[59-61]，该技术可在低温、短时间内即可实现，对物料处理能起到很好的超微化、微乳化和均一化效果[62]。Chen Jun等[59]采用DHPM降解苹果果胶，发现随着压力的升高，果胶的表观黏度、平均分子质量和粒径逐渐降低。帅希祥[60]利用DHPM处理低酯和高酯果胶，结果表明它们的降解主要缘于分子内糖苷键的断裂，没有发生去酯化和消除反应。然而，DHPM技术所需装备投资大、成本高，这限制了其在工业化大规模生产中的应用。

表3 高压降解法制备POSTable 3 POS preparation by high pressure degradation of pectin

1.1.4 热液处理

热液处理是采用水热压缩法制备POS[55]，该方法只用水作为处理介质，具有绿色环保的优点[65]。Martinez等分别以苹果渣[66]和橙皮[67]为原料，在160 ℃、严重因子（Ro）为288 min的条件下对其进行水热处理，POS得率分别为29.7 g/100 g和25.1 g/100 g。姜美云等[68]采用水热法降解果胶，在最优工艺条件下（140 ℃、pH 6、30 min），果胶降解产物得率达46.2%，并分离纯化得到3 种寡糖，mw分别为13.4、7.5 kDa和5.7 kDa。亚临界水处理也属于热液处理法，利用高温高压条件下亚临界水所具有的强降解能力，可很好地从天然产物中获得降解产物[69]。陈剑兵[70]利用亚临界水处理柑橘果胶，105、120、135 ℃处理后得到的果胶mw分别为50、20 ku和10 ku，其中120 ℃亚临界水处理是制备低分子果胶的较好方法。Klinchongkon等[71]在不同温度（100、120、140 ℃和160 ℃）和升温速率（3.5 ℃/min和7.0 ℃/min）下水解西番莲果胶，结果表明随着亚临界水解程度的增加，果胶的黏度和相对分子质量逐渐降低，分子质量从197 kDa降到3 kDa。

此外，脉冲处理[72-73]和机械处理[74]（如研磨、挤压、脱水）等物理法也可以使果胶发生降解，但并不常用。物理法降解具有操作简单、环保无污染、较少试剂用量的特点，常用于制备POS，但降解作用不明显，降解能力有限，通常将其作为辅助手段与其他降解方法联合使用。

1.2 化学法降解

1.2.1 酸法/碱法水解

酸水解法是果胶糖苷键的氧原子发生质子化过程，常用的水解酸有三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、乙酸、硝酸、盐酸（HCl）等（表4）。Round等[75]使用酸水解和原子力显微镜（atomic force microscopy，AFM）观察发现，HG作为一种侧链存在于果胶中，其最小平均尺寸约为之前报道的3 倍[76]。Zhang Shanshan等[77]通过改变TFA的浓度，获得了3 种柑橘皮POS，且酸性单糖的相对含量从68.58%增加到89.93%。而碱水解法主要是由氢氧化钠、氢氧化钾等水解碱引起皂化反应，降低果胶的酯化度，对其分子质量影响不明显，因此并不常用。酸法/碱法操作简单、成本低，但需使用大量强酸、强碱等化学试剂，反应条件剧烈，对环境不友好。

表4 酸水解法制备POSTable 4 POS prepararation by acid hydrolysis of pectin

1.2.2 氧化降解

相比于酸法/碱法降解，氧化降解法条件相对温和，降解速度快，产生的副产物和污染物较少。它通常利用过氧化氢（H2O2）、次氯酸钠等强氧化剂降解果胶，即在酸性条件下，氧化剂被分解产生大量自由基（·OH、O2-·），引发自由基链式反应，使果胶糖苷键断裂发生降解[81]。

H2O2氧化降解果胶的终产物为水和氧气，具有高效、绿色的特点，已被证明是一种制备POS的有效方法[82-83]。为提高H2O2产生自由基和降解的速率，有研究将Cu2+[7]、Fe2+[84]等二价金属离子作为催化剂加入反应体系中（表5）。H2O2和二价金属离子组成的试剂被定义为Fenton试剂，该反应被称为Fenton反应[7]。Fenton氧化降解果胶的机理是在Cu2+、Fe2+等的作用下，H2O2产生的大量·OH优先攻击果胶HG区域，使得RG-I区域富集（图1）。Li Junhui等[85]采用Fenton体系对柑橘罐头加工废水中回收的果胶进行降解，得到6 种低分子质量POS组分。Yeung等[86]利用Fenton反应在不同FeSO4浓度条件下降解秋葵果胶，结果表明随着FeSO4浓度的增加，POS的分子质量逐渐降低，这与Zhi Zijian等[87]研究结果一致。Fenton氧化降解反应虽然速度快，但后续还需要使用金属螯合剂等去除金属离子才能得到高纯度的降解产物。此外，在H2O2体系中加入抗坏血酸（VC）也可以提高降解速率[88-90]。刘闪闪[7]通过对羟自由基含量的测定验证了较低浓度的VC（10 mmol/L）对H2O2有辅助降解作用。

图1 Fenton反应降解果胶的机理[98]Fig.1 Mechanism of pectin degradation by Fenton reaction[98]

表5 氧化降解法制备POSTable 5 POS preparation by oxidative degradation of pectin

臭氧（O3）作为一种强氧化剂，可用于彻底氧化降解有机物。O3氧化降解具有绿色高效、反应过程可控、原料来源充足等优点，已广泛用于污水处理[91]、环境消毒杀菌[92]和食品防腐保鲜[93]，以及大分子淀粉改性[94]等方面。因此，有研究者也将O3用于果胶的可控降解制备POS。Zimin等[95]发现苹果果胶在H2O2（1.25%）/O3-O2混合物、70 ℃条件下氧化60 min，分子质量从125 kDa降低到6.4 kDa。肖中平等[96]通过控制反应条件（压力0.1～1.0 MPa、温度20～50 ℃、pH 3～10）和臭氧发生的通量（基于多糖固体质量计为10～500 mg/g），可以高效、可控地进行果胶的降解反应，以高收率获得期望分子质量范围（1～100 kDa）的寡糖。最近，Lupascu等[97]将20 g果胶在双氧水中均质，并通过O3-O2（鼓泡率为10 L/min）的混合物处理60 min，得到了具有优异离子交换能力的低分子质量果胶，可用于去除重金属和放射性金属离子。由此可见，O3氧化降解有望成为一种绿色无污染的制备POS的有效方法。

1.2.3 光催化降解

光催化降解主要依赖于钛氧化物（TiO2）作为催化剂产生活性氧，氧化多糖链中的单个糖残基来降解果胶。TiO2在光化学反应发生后可通过离心或过滤去除，是一种环境友好的光化学反应[99]。Burana-Osot等[100]以TiO2作为催化剂，利用紫外光化学反应部分解聚果胶，结果表明，在pH 7的条件下，经6 h的紫外光光解作用，果胶平均分子质量从400 kDa下降到200 kDa；
并发现降解后的果胶结构完整，几乎不发生变化，解聚产物的分子大小可由紫外光照射时间和pH值调控。

1.3 酶法降解

酶法降解是利用特定酶切断糖苷键对果胶进行降解，从而得到小分子POS[101-102]。酶法降解因能够在温和条件下进行区域选择性解聚而变得越来越重要。目前已经开发出多种果胶降解酶，极大地推动了果胶结构的研究进程。根据底物和反应机制的不同，可将果胶降解酶分为4大类：原果胶酶、聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果胶裂解酶（pectin lyases，PL）和果胶酯酶（pectinesterase，PE）。不同类型的果胶降解酶与果胶的作用方式不同，最终降解产物也随之不同，如图2所示[103]。

图2 果胶酶对果胶的降解途径[103]Fig.2 Degradation pathways of pectin by pectolytic enzymes[103]

果胶酶是能够水解果胶物质的多种酶的总称，可以从植物或微生物（如细菌和真菌等）中分离获得，但来源于植物的果胶酶存在许多不足，如产量低且不易分离、提取与纯化，所以较难实现大规模生产[104]。目前，由于微生物具有生长条件简单、生长速度快和分布范围广等特点而成为生产果胶酶的优良生物资源[105]，包括青霉（Penicillium）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、曲霉（Aspergillus）、米根霉（Rhizopus oryzae）、囊酵母（Zygoascussp.）等。如表6所示，不同的微生物和发酵条件生产果胶酶的能力也不同。Meneghel等[106]评估了Aspergillus oryzaeIPT-301在限制和非限制氧气供应条件下生产果胶酶的能力，结果表明较低的pH值更有利于果胶酶的产生和稳定性。卢晓华等[107]通过优化菌株XHV25的发酵产果胶酶条件，使其活力提高了65.11%。合成果胶酶的能力广泛存在于所有微生物群中，但丝状真菌类是首选，如黑曲霉（Aspergillus niger）、木霉（Trichoderma）、根霉（Rhizopus），因为多达90%的果胶酶可以在培养基中产生[108]。然而，真菌具有生长速度缓慢等限制因素。因此，商业用途迫切需要更高产果胶酶的新型分离菌株，进一步为采用酶法降解果胶提供基础。

表6 果胶酶生产发酵条件Table 6 Fermentation conditions for pectinase production

酶法降解具有专一性高、反应条件温和、副反应少、降解速度快等特点，可实现对果胶的定向和可控降解，成为近年来一种很有吸引力且广泛应用的方法，部分酶法降解制备POS的研究汇总如表7所示。由于曲霉具备特有的安全性，其代谢物也是安全无害的，在酶法制备POS中得到了广泛应用。Lemaire等[114]采用来自尖孢曲霉（Aspergillus aculeatinus）的3 种新型果胶酶降解果胶，发现RHG-GAN酶通过改变RG-I主链和支链结构来降低其黏度。POS的酶法制备会受到酶浓度和酶与底物接触时间等因素的影响。Babbar等[115]发现不同浓度的内聚半乳糖醛酸酶（endo-polygalacturonase，EPG）-M2产生不同聚合度（degree of polymerization，DP）的POS片段，当EPG-M2浓度为2.6 IU/mL时，DP2和DP3在75～90 min的时间范围内获得最高产量；
相比之下，在15～30 min内，用5.2 IU/mL可获得最大DP4产量，为处理生物量干质量的5.2%～5.5%（质量分数）。此外，酶膜生物反应器常被用于酶解法制备POS，它属于生物催化反应器和膜工艺（如超滤（ultrafiltration，UF））的综合应用，允许产品在渗透时持续分离，确保POS不被进一步水解，并防止单糖形成，同时实现更高的POS产率。Baldassarre等[116]以洋葱皮为原料，采用一种基于跨流连续酶膜生物反应器连续生产POS，该工艺采用一种复合纤维素酶与截留分子质量（molecular weight cut-off，MWCO）为10 kDa的膜，能够获得稳定的POS产率（22.0 g/（L·h）），与之前分批获得的黏菌酶L的结果相比，酶膜生物反应器提供了3～5 倍的体积生产率。但由于果胶结构复杂，果胶酶种类多样，该法对酶的活性、特异性和纯度的依赖较强，对于某些特定酶难以分离和实现工业化生产[117]。目前，这种方法多用于实验室研究。

表7 酶法降解制备POSTable 7 POS preparation by enzymatic degradation of pectin

1.4 联合法降解

在对果胶进行降解制备POS的研究中，往往不是单一地使用一种方法，而是联合使用两种或多种方法，产生协同作用，进而达到更高效的降解目的。联合法更多地是利用物理法中的US法与酶法、酸法或氧化法结合对果胶进行降解（表8）。牟方婷等[124]报道，US和微波处理均能有效提高果胶酶的降解效率，且US、微波作用显著提高了半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）的含量。Larsen等[125]发现，与单独超声或酶处理相比，超声辅助酶浸渍法水解果胶后的产物含量有显著差异，US先将果胶分割成中等分子质量的少支聚物，再通过果胶酶进一步降解。

表8 联合法降解制备POSTable 8 POS preparation by degradation of pectin with combined treatments

氧化降解法中的H2O2和Fenton试剂用量较高，为解决此问题，有研究者在H2O2或Fenton体系中引入了US辅助降解果胶。US的机械作用和微射流作用起到搅拌和传质的作用，产生协同效应，不仅可减少氧化试剂的用量、降低成本，还能加快反应进程、缩短反应时间。Hu Weiwei等[126]利用US-NaHCO3-H2O2体系降解果胶，50 min内果胶的分子质量从1 088 kDa降至33 kDa。Zhi Zijian等[22]联合US-Fenton降解法制备了RG-I富集的超低分子质量POS，发现超声协同提高了Fenton反应的效率，可在35 min内将果胶分子质量从448.0 kDa降至5.5 kDa。另外，Fenton降解体系还存在一个问题，即引入了过渡金属离子，而无金属类Fenton体系是一种新兴的替代降解技术。Li Junhui等[98]报道了一种超声加速无金属类Fenton降解法（US-H2O2/VC），该体系能在30 min内将果胶分子质量降低到7.9 kDa。由此可见，US可以作为一种辅助降解果胶的有效手段。

现有的降解方法仍存在一定的局限性，或降解能力有限，或反应条件苛刻，或对环境不友好。因此，寻找其他更加经济高效、绿色环保的降解方法来制备POS是今后研究的重要方向。

2.1 POS的分离纯化

对果胶降解后得到的一系列POS产物进行分离纯化，可为后续寡糖片段的结构鉴定和活性研究奠定基础。常用于POS分离纯化的方法，包括色谱法、膜分离法及二者的联合法。

2.1.1 色谱法

色谱法具有选择性好、分离效率高、操作简便等优点，被广泛应用于多糖类物质的分离纯化过程。离子交换色谱法和凝胶过滤色谱法是最常用的色谱分离技术[129-131]。李健军等[132]利用强阴离子交换树脂对半乳糖醛酸寡糖的分离分析方法进行了研究，得到了5 种单一DP的寡糖片段。葡聚糖凝胶（SepHadex）、琼脂糖凝胶（SepHarose）和聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel P）是3 种常用的凝胶过滤色谱柱[23]。刘闪闪[7]通过离子交换层析柱Superdex30对果胶降解产物进行分离纯化，采用高效排阻色谱法（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）在线跟踪检视，合并相同组分，得到6 种单一峰的POS。Yu Li等[131]通过Sephadex G-25、Sephadex G-75和Sepharose CL-6B 3 个系列柱洗脱果胶降解产物，得到5 种纯化的POS馏分。

2.1.2 膜分离法

膜分离法包括UF和纳滤（nanofiltration，NF），具有过滤简单、易控制等优点，也常被用于POS的分离纯化。Zhu Rugang等[3]通过UF、NF膜分离技术对果胶降解产物进行分级，得到3 种分子质量范围的POS。Prandi等[133]采用4 种UF/NF平板膜（MWCO分别为400、700、1 000、5 000 Da）对甜菜果胶的降解产物进行分级，得到5 种不同的寡糖片段。Iwasaki等[134]采用UF膜和NF膜从酶解果胶中分离出具有促进生菜根系生长活性的POS。

2.1.3 色谱法和膜分离法联合

除了色谱法和膜分离法，也有研究联合这两种方法进行分离纯化[135]，以获得更高纯度的POS。对系列POS混合物分离纯化后，还需要对其纯度进行鉴定。多糖纯度分析是其精细结构和化学性质分析的前提。测定多糖纯度的方法有薄层色谱法、高效液相色谱法[23]、电泳法[136]、超滤离心法、凝胶过滤法等，其中电泳法和色谱法最为常用，若为均一或纯的多糖，则在色谱柱上洗脱后表现为单一对称峰[137-138]，电泳后为单一条带。石慧敏等[139]利用离子色谱、质谱对得到的7 种寡聚半乳糖醛酸进行了纯度、相对分子质量检测，结果表明这些寡聚半乳糖醛酸分子纯度均高于95%，DP为2～7，连接方式为α-(1→4)。高纯度的POS分子可作为果胶结构解析的标准品，有利于进一步研究其生物活性，同时有待于进一步开发为功能性寡糖产品。

POS分离纯化方法汇总如表9所示。

表9 POS的分离纯化方法Table 9 Methods for isolation and purification of POS

续表9

2.2 POS的结构鉴定和形貌表征

POS具有复杂的结构特征，其生物活性与结构之间存在密切关系。因此，解析分离纯化后POS的结构，进行实时、快速的定性定量分析，对今后POS生物活性机制的研究及功能性食品的开发具有指导意义。

2.2.1 结构鉴定

POS的结构鉴定方法有：分子质量测定[24]、单糖组成分析[27]、高碘酸氧化及Smith降解[137]、甲基化分析[138]、傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared，FTIR）分析[86]、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）分析[128]、色谱分析[103]、质谱（mass spectrometry，MS）分析[141]、X射线衍射分析[126]和紫外光谱分析[142]等。

POS分子质量测定是根据分子相对大小进行分离测定，主要包括HPSEC[143]和高效凝胶渗透色谱（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）法[141]。支梓鉴[24]利用HPSEC法检测了降解后果胶的分子质量，并利用breeze2软件测定其mw及分散系数。Cao Jing等[128]通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）系统对POS进行分离，采用凝胶渗透色谱（gel permeation chromatograph，GPC）法测定了MCP的分子质量。单糖组成分析常用的方法有PMP/AEC柱前衍生化-HPLC法[144]、高效阴离子色谱-脉冲安培检测[128]（high performance anion exchange chromatographypulse amperometric detection，HPAEC-PAD）、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用[142]等。大量研究表明，果胶在降解前后，单糖组分未发生明显变化，但各部分单糖含量变化较大。Cao Jing等[128]采用HPAEC法测定了纯化的MCP的单糖组成，结果表明MCP4和MCP10均由7 种单糖组成，MCP10被认为是一个高度支化的RG-I富集结构，MCP4是一个高度线性化的HG富集结构。Yeung等[86]利用PMP柱前衍生反相高效液相色谱（reversed phase-HPLC，RP-HPLC）分析了POS的单糖组成，结果表明在POS中，随着FeSO4浓度的增加，GalA含量显著降低，Rha含量显著增加，说明果胶的HG区域发生解聚；
RG-I侧链相关的中性糖Ara和Gal含量显著降低，说明RG-I区域也发生了部分裂解。

高碘酸氧化-Smith降解和甲基化分析是确定植物多糖和寡糖糖苷键类型和位置的重要手段[145]。糖苷键的类型、位置及分支数等信息可通过测定高碘酸的消耗量和甲酸的生成量来初步判断，然后利用Smith降解进行酸水解，可进一步确定糖苷键的类型和位置[146]。甲基化分析通常结合GC-MS等手段来确定寡糖和多糖中单糖单位间糖苷键的位置，同时还可以得到不同连接方式的单糖残基在多糖分子中的比例信息[147]。例如，Shakhmatov等[148]通过Smith降解石榴果胶（PGO）得到PGO-SD，通过凝胶过滤色谱对PGO-SD进行分馏，得到分子质量为17 kDa的PGO-SD1亚馏分，与初始多糖相比，PGO-SD1中性单糖残基（Gal、Rha和Ara）含量较高，UA残基含量较低。孙玮璇[149]采用甲基化、核磁共振分析方法发现薯渣果胶RG-I结构域中1,4-半乳聚糖、1,5-阿拉伯聚糖通过Rha的O-2连接在RG-I主链，其中1,4-半乳聚糖中还具有1,3-半乳聚糖分支和末端Ara修饰。

另外，FTIR、NMR和MS法也常用于POS结构的解析。其中FTIR可以根据特征吸收峰，分析寡糖结构中的官能团等信息[86]。NMR包括1H-NMR、2D-NMR[128]（相关谱、总相关谱、异核单量子关系）和13C-NMR，可以提供寡糖的重要结构信息，如α-或β-异位构型、单糖组成和键合模式，能准确测定出结构表征基团的化学位移[23]和峰宽。Zhi Zijian等[22]针对1H-NMR谱分辨率较低的问题，采用2D-NMR通过分配化学位移进一步确定了降解馏分UFP2的化学结构。MS包括GC-MS[6]、电子电离质谱、电喷雾电离质谱[83]、电喷雾电离-碰撞诱导解离质谱（electrospray ionization-collision induced dissociation-MSn，ESI-CID-MSn）[141]等，具有检测灵敏度和分辨率高、分析快速、所需样品量小（只需pmol～nmol）等特点，在糖苷键连接方式、寡糖序列分析方面具有重要作用。例如，吕友晶[141]采用ESI-CID-MSn技术共鉴定出46 种POS寡糖序列。

2.2.2 颗粒形貌表征

为了更直观地观察果胶降解前后的变化，可进一步对POS的颗粒形貌进行表征，包括粒径分析、扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）分析和AFM分析等[126,150]。Chen Xiaowen等[35]发现山楂果胶经超声处理10 min，其粒径从1 465 nm降低到453.6 nm，SEM分析表明US处理的果胶呈片状结构，表面出现一些丝状结构和部分剥落。Hu Weiwei等[126]利用AFM对果胶降解前后的分子形状进行了观察，AFM图像表明降解前的果胶链略有聚集，降解后聚合物结构消失，长链被裂解成短链。这些表面形貌变化的结果与其分子质量等测定结果一致，进一步证明了US-NaHCO3-H2O2是一种制备低分子质量果胶的有效方法。

近年来，大量研究表明，果胶降解后得到的POS片段具有更强的生物活性[98,126]。它们的活性与其独特的结构之间存在密切关系，如分子质量、单糖组成、DP、化学成分、精细结构等。

3.1 抗癌（抗肿瘤）活性

虽然化疗在肿瘤和癌症治疗中是目前最有效的手段，但也存在一些缺点，如肿瘤细胞耐药性、对健康细胞的严重副作用等，因而使用天然抗癌物质近年来备受关注。肿瘤特异性半乳糖凝集素-3（galectin-3）是一种β-半乳糖结合蛋白，是肿瘤细胞转移的关键分子，通过与正常细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的β-半乳糖苷结合，从而将正常细胞转化为癌细胞（图3A）[151-152]。已有研究证实，POS可与galectin-3相互作用，降低体内galectin-3水平，从而抑制癌细胞的形成、转化和转移（图3B）。

图3 POS抑制癌细胞增殖的作用机理[23]Fig.3 Mechanism by which POS inhibits proliferation of cancer cells[23]

相比完整的天然果胶，POS由于分子质量较小、生物利用度较高而具有更好的galectin-3抑制作用。Kapoor等[23]从番茄果胶中分离的低聚糖（pectic-oligosaccharide isolated from sour raw tomato，SrTPO）比番茄完整果胶（SrTPP）对galectin-3的抑制效果强10.4 倍，并发现SrTPP仅附着在细胞表面或低摄入量，而SrTPO是一种小分子结构，可以通过其特异性的糖结合域与galectin-3更好地结合（图3）。RG-I结构域富集的POS由于含有半乳糖醛酸侧链而具有较强的生物活性[153-154]。Li Junhui等[98]的研究表明，相比天然果胶，低分子质量果胶多糖（low-molecular-weight pectin polysaccharide，LMP）3（7.65 kDa）对MCF-7细胞具有更强的抗肿瘤活性，这可能与其分子质量和降解过程提供了RG-I富集的具有高度分支的结构有关。然而，也有研究表明富含RG-II结构域的POS具有更强的生物活性[155-156]。Ai Lianzhong等[143]研究发现果胶片段RG-II对体外培养的人结肠癌细胞（Caco-2）的抗增殖作用优于RG-I，且呈浓度依赖性。另外，多糖的活性与硫酸基团含量也有很大关系，较高的硫酸基团含量使其具有较好的抗肿瘤活性。刘闪闪[7]研究结果表明，柑橘囊衣果胶经降解后，其体外抗肿瘤活性增强，且对降解产物POS1及POS2进行硫酸酯化后，其体外抗肿瘤活性进一步增强。

除细胞模型外，还有研究利用小鼠模型分析POS的体内抗癌作用。沈彦伟[157]利用4T1细胞系建立了Balb/c小鼠的乳腺癌自发肿瘤模型，并利用该摸型阐明了低分子柑橘果胶联合氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）化疗治疗可抑制乳腺癌的肿瘤生长，延长乳腺癌荷瘤小鼠的生存时间；
进一步信号通路分析显示，低分子柑橘果胶是通过阻断galectin-3分子，从而减少MDSC细胞在小鼠体内的积累。有些抗癌药物不仅抑制癌细胞的生长，而且也会抑制正常细胞的生长，对正常细胞具有毒性；
而低分子质量POS具有天然安全、无毒性，可选择性地抑制癌细胞生长，它将成为一种潜在的肿瘤和癌症协同治疗方法。

表10总结了POS抗癌活性与其结构之间的关系。

表10 POS抗癌活性与其结构之间的关系Table 10 Relationship between anticancer activities of POS and their structures

续表10

3.2 抗氧化活性

过度活性氧或活性氮诱导的氧化应激反应会对细胞结构和生物分子功能造成严重破坏，引发多种疾病。过度产生活性氧及活性氮将被非酶抗氧化剂和抗氧化酶平衡[159]。近年来，研究表明天然果胶降解产物POS具有潜在的抗氧化活性，引起了人们的广泛关注。

POS的低分子质量是果胶降解后抗氧化活性提高的主要影响因素（表11）。一般来说，多糖的相对分子质量越大，体积越大，越不利于其跨越多重细胞膜障碍进入生物体内发挥生物学活性。POS由于分子质量降低、表面积和水溶性增加，与自由基相互作用机率升高而具有更强的抗氧化活性[86,101]。Abari等[101]采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法测定了质量浓度相同的果胶和POS的抗氧化效果，结果表明，POS质量浓度为20 mg/mL时，其清除自由基的能力约为93%，超过相同质量浓度果胶的50%。然而，也有研究表明并非多糖的分子质量越低其活性就越强[160-161]，POS的抗氧化活性与其分子质量之间并不是简单的线性关系，POS的抗氧化活性与其质量浓度也有关系[68]。因此，需要进一步研究POS片段的抗氧化活性与结构差异之间的关系。

表11 POS抗氧化活性与其结构之间的关系Table 11 Relationship between antioxidant activities of POS and their structures

续表11

3.3 抗炎活性

研究表明，POS的抗炎作用可能与多种分子机制有关，通过降低炎症反应从而影响免疫系统，在免疫调节方面发挥不同的功能[154]。亚硝酸盐（一氧化氮的稳定代谢物）含量的异常产生是RAW 264.7细胞炎症出现的标志[86]。基于此，Yeung等[86]研究了3 种POS（POS3、POS5、POS7，mw分别为6.09、4.89、1.79 kDa）的抗炎活性，结果表明低分子质量的POS抑制了脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的亚硝酸盐和炎症因子（包括白细胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-6）以及诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）/核因子（nuclear factor，NF）-κB信号通路在RAW264.7细胞中的表达，因为低分子质量的POS有更多的活性位点与自由基相互作用，从而阻止促炎细胞因子的合成。NF-κB的激活可诱导编码促炎细胞因子（如IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α））的基因表达上调[162]，罗司丹[127]以LPS刺激的THP-1细胞作为炎症模型研究了MCP（MCP12-P和MCP4-P）的抗炎作用，结果显示MCP12-P和MCP4-P均可显著抑制IL-1β和TNF-α细胞因子的分泌，抑制率分别达到29%～34%和24%～42%，且两种MCP还可以抑制NF-κB蛋白表达，抑制率为25%～35%，这可能与其GalA残基的减少和RG-I片段的保留有关。由于结肠炎与结肠癌的发生高度相关，而NF-κB在LPS将结肠炎转化为结肠癌的过程中具有重要作用[128]，因此，推断POS可通过抑制炎症来抑制结肠癌。

3.4 益生元活性

益生元是一种非消化的食物成分，通过选择性地促进益生菌（主要是双歧杆菌和乳酸菌属）的生长和产生短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）从而降低有害细菌的致病作用，进而有益于宿主[86]。近年来，低聚木糖、低聚半乳糖和异麦芽糖等多种非消化低毒低聚糖逐渐进入市场。同时，果胶也被认为是具有益生元潜力的低聚糖来源，在食品和制药行业有着很高的需求[163-167]。在使用前，果胶必须被水解成短链的POS，以更好地提高益生菌的生长性能。Wongkaew等[168]利用酶解处理芒果果胶获得分子质量为643 Da的寡糖，此时B.animalisTISTR 2195和L.reuteriDSM 17938的益生元活性得分最高。Zhu Rugang等[3]发现POS的体外抗糖基化活性和益生元活性与其分支度（Ara与Rha物质的量比和Gal与Rha物质的量比）有关，而酯化程度对抗糖基化和益生元活性的影响较小。同样，Singh等[167]也报道称POS可被视为有效的益生元，用于维持人体肠道内的免疫和微生物稳态，并发现POS的DP和结构决定了其生物学活性，POS的酯化程度不是关键影响因素。目前，虽然初步研究已经获得了具有良好益生元效应的POS（表12），但仍不清楚它们在人体研究中是否会具有类似的效果。因此，双歧杆菌和乳酸菌利用POS的机制有待进一步研究。

表12 POS益生元活性与其结构之间的关系Table 12 The relationship between prebiotic potential of POS and their structures

3.5 抗菌活性

另有研究报道，POS还具有良好的抑菌活性。孙静[136]利用滤纸片法测定了果胶及其降解产物的抑菌活性，结果表明果胶及其降解产物中，只有寡聚半乳糖醛酸可以抑制大肠杆菌（E.coli）及金黄色葡萄球菌（S.aureus）的增殖。Li Peijun等[161]采用S.aureus、B.subtilis和E.coli对3 种POS进行抑菌活性检测，结果表明，3 种POS对细菌有较强的抑制作用，对真菌无抑制作用，且POS1、POS2（对S.aureus、B.subtilis、E.coli的MIC分别为12.5、12.5、25.0 mg/mL）的抑菌活性高于POS3（对S.aureus、B.subtilis、E.coli的MIC分别为25、25、50 mg/mL）；
在该研究中低分子质量低聚物比高分子质量低聚物具有更高的抗菌活性，这可能与游离的未解离的羧基、甲氧基及其DP有关。同样，王巍[170]研究了不同DP的山楂POS（DP 2～5）作用于5 种供试菌的抑菌性，结果显示DP为3的山楂POS抑菌效果最显著，其中对S.aureus、E.coli和B.subtilis有很好的抑菌效果，MIC分别为0.625、1.250、0.625 g/L，抑菌圈大小分别为16.5、15.0、20.5 mm。微生物污染是食品腐败变质的一个重要原因，而POS作为一种潜在的天然、经济又安全的抑菌物质，可将其应用于食品加工、贮藏、保鲜与食品材料的开发应用中。

3.6 其他活性

除上述生物活性外，POS还具有许多与人类健康密切相关的生理活性，如降胆固醇、降血脂、改善肥胖、免疫功能、肠道菌群调节、吸附重金属离子等。张若培等[171]探讨了低分子质量柑桔果胶对肥胖大鼠体质量、血脂和瘦素水平等的影响，发现MCP具有改善大鼠肥胖及降低高血脂水平的作用。Eliaz等[172]评估了改良的低分子质量MCP对健康个体尿液中有毒元素排泄的影响，研究表明口服MCP可显著增加具有“正常”金属体负荷的受试者对有毒金属的尿液排泄。MCP对有毒重金属的螯合作用可能部分归因于其蛋壳结构（RG-II）的存在[173]。低分子质量果胶还具有更强的免疫调节功能，能增强人体免疫，可用于制备增强免疫功能的食品、药品和保健品等[174]。

综上所述，降解反应能够提高果胶的生物活性，这可能是由于降解反应使得果胶链断裂，分子质量降低，一方面接触面积增加，亲水基团更多暴露在溶液中更容易发生降解反应；
另一方面，随着分子质量的降低，溶解性增加，生物可利用度也随之增加，活性基团暴露增多。值得注意的是，POS的生物活性与其分子质量、DP、单糖组成及精细结构等特征密切相关。然而，即使有如此多关于POS生物活性与其结构之间关系的研究，还是很难将一个独特的分子结构与特定的某种与健康相关的生物活性联系起来。

本文综述了POS的制备、分离纯化、结构解析方法、生物活性及其构效关系等方面的内容。POS可以通过物理法、化学法、酶法和联合法降解制备。目前研究中对于POS的制备多以联合法降解为主，但这些方法仍存在一定的局限性，或降解能力有限、或反应条件苛刻、或污染环境、或影响降解产物的活性，需要寻找其他更加经济高效、绿色新颖的降解方法。而O3氧化降解具有高效、绿色、原料来源充足等优点，有望成为一种制备POS的新方法。POS也因独特的结构和生物活性越来越受到研究者们的关注，大量国内外研究表明POS具有抗肿瘤、抗癌、抗氧化、抗炎、益生元、抑菌、免疫调节、降血脂和吸附重金属离子等多种活性。本文对POS的构效关系进行了初步探讨，为了更好地理解POS的作用机理，还需要更进一步研究其精细结构与生物活性之间的关系，从而为POS的应用提供理论指导。此外，目前对POS生物活性开展了大量体外细胞实验研究，未来可将其延伸至动物水平或具体食品基质中探究其活性，以及POS在人体胃肠道内的代谢情况，以期开发出富含POS的新型功能性食品，并有利于POS在食品、农业和医学等领域发挥其重要作用。

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