壳寡糖对过氧化氢诱导肝细胞损伤的改善作用及机制

刘 朋，侯智兴，茅洪维，李 恒,*，龚劲松，蒋 敏，许泓瑜，许正宏，史劲松,*

（1.糖化学与生物技术教育部重点实验室，江南大学生命科学与健康工程学院，江苏 无锡 214122；
2.上海市农业科学院食用菌研究所，上海 201403；
3.江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122；
4.粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心，江苏 无锡 214122）

氧化应激与多种疾病的发生发展相关，其引起的过量氧自由基或活性氧（reactive oxygen species，ROS）可以导致DNA和细胞大分子大规模损伤，如改变膜的流动性和通透性、破坏细胞骨架、促进蛋白变性等，最终引起细胞凋亡、癌变等在内的细胞功能障碍现象[1-2]。因此，抗氧化应激治疗成为改善疾病进程的有效策略之一。壳寡糖（chitooligosaccharides，COS）作为自然界中的一种低聚寡糖，具有抗肿瘤、抗凝、伤口修复、抗氧化等生理活性。此外，COS在酒精性肝损伤、脂肪肝、肝癌等多种肝脏疾病中均表现出较好的改善效果，但其具体作用机制仍然不清楚[3-5]。鉴于氧化应激在肝脏疾病中的重要作用[6-7]，本实验利用过氧化氢（H2O2）诱导肝细胞L-02建立氧化应激细胞损伤模型，分析COS对其保护作用，为COS的保肝作用提供理论参考。

1.1 材料与试剂

COS（聚合度2～4） 扬州日兴生物科技股份有限公司；
胎牛血清 以色列Biological Industries公司；
胰蛋白酶、青霉素-链霉素、活性氧荧光探针（2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）上海碧云天生物试剂公司；
逆转录试剂盒 上海翊圣生物科技有限公司；
RPMI 1640培养基、H2O2美国Sigma-Aldrich公司；
SYBR Green Mix试剂盒 瑞士Hoffmann-La Roche公司；
细胞毒性实验细胞计数（cell counting kit-8，CCK-8）试剂盒 日本同仁公司。

1.2 仪器与设备

Multiskan MK3全波长酶标仪 德国Eppendorf公司；
CFX96 Touch荧光定量聚合酶链反应分析仪美国Bio-Rad公司；
CytoFlex流式细胞仪 美国Beckman公司；
实时单细胞多模态分析仪 江苏瑞明生物科技有限公司；
TCS SP8激光共聚焦显微镜 德国Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养

L-02细胞生长在含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的RPMI 1640培养基中，于37 ℃、5% CO2的环境中培养。

1.3.2 L-02细胞存活率检测

待细胞生长至对数期后，用胰蛋白酶消化以获得细胞悬液，96 孔板中每孔加入相同体积的L-02细胞悬液（1.2×104个），静置培养24 h。弃上清液，并加入添加或不添加COS（终质量浓度31.25、62.5、125、250、500、1 000 µg/mL）的新鲜培养基继续培养24 h。然后吸弃每孔培养基，用pH 7.5磷酸盐缓冲溶液（phosphatebuffered saline，PBS）冲洗3 遍，更换含10% CCK-8溶液的无血清培养基，避光孵育1.5～2.0 h后于450 nm波长处检测OD值，根据下式计算细胞存活率。

1.3.3 H2O2刺激L-02细胞氧化应激模型的建立

96 孔板每孔加入同体积L-02细胞悬液（1.2×104个），待细胞贴壁后，添加不同浓度H2O2（0.5、1、2、4、8 mmol/L）继续培养1 h。然后通过CCK-8检测不同分组细胞在450 nm波长下的吸光度，细胞存活率计算同1.3.2节，通过计算细胞存活率以确定H2O2造模浓度。

同体积的L-02细胞悬液加入96 孔板中（1.2×104个）。细胞分为对照组、模型组（H2O2组）、低剂量组（质量浓度100 µg/mL COS）、中剂量组（质量浓度200 µg/mL COS）和高剂量组（质量浓度400 µg/mL COS）。待细胞完全贴壁后，根据分组不添加或添加不同质量浓度的COS至培养基中继续培养24 h，在最后1 h时加入H2O2（终质量浓度为1 mmol/L、母液浓度为880 mmol/L）。后续细胞存活率检测同1.3.2节，ROS水平分析方法见1.3.4节。

1.3.4 ROS水平测定

激光共聚焦显微镜分析：细胞处理参照1.3.3节。细胞在H2O2处理后，去掉培养基并用PBS清洗3 遍后，加入10 mmol/L DCFH-DA探针（终浓度为10 µmol/L），避光37 ℃孵育30 min后，无血清培养基清洗3 遍。然后加入Hoechst 33342探针孵育15 min进行细胞核复染。最后，在发射波长（λex）/激发波长（λem）＝488 nm/525 nm和λex/λem＝346 nm/460 nm条件下经激光共聚焦显微镜拍照观察。

流式细胞仪分析：步骤同上，在获得细胞悬液（1×106个/100 µL）后加入1 µL DCFH-DA探针避光37 ℃孵育30 min后，850 r/min离心3 min，PBS清洗掉未进入细胞的游离探针。最后重悬于PBS中，选择荧光素5-异硫氰酸酯（fluorescein isothiocyanate，FITC）通道进行流式细胞仪分析。

单细胞纳米生化分析：步骤同上，分析质量浓度400 µg/mL COS对损伤单细胞的保护作用。细胞经H2O2处理后，倒掉培养基并用PBS清洗3 遍后，更换0.5 mL新鲜无血清培养基。参照Zheng Xinting等[8-9]方法，在正常1640培养基中孵育，记录稳态背景荧光（F0），之后将光纤纳米探针精确插入单个细胞的细胞质中，随即在培养基中添加0.5 mL质量浓度20 µmol/L DCFH-DA探针溶液，通过荧光检测系统在单个细胞中测定荧光强度（F1）以动态观察胞内ROS水平变化情况。

1.3.5 线粒体膜电位变化测定

细胞处理参照1.3.3节。在获得细胞悬液（1×106个/100 µL）后加入质量浓度5 µg/mL罗丹明123探针避光37 ℃孵育30 min后，850 r/min离心3 min，PBS清洗去掉未入胞的游离探针。最后重悬于PBS中，选择FITC通道进行流式细胞仪分析。

1.3.6 荧光定量聚合酶链式反应分析

分离总RNA后，根据Hifair®III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒将0.5 µg RNA逆转成目标cDNA。反应体系为200 ng cDNA，各5 nmol/L的上下游引物，SYBR Green混合物，总体系体积为10 µL，在95 ℃15 s、60 ℃ 30 s条件下反应，共40 个循环。测定核因子E2相关因子2（nuclear factor E2 p45-related factor 2，Nrf2）、血红素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、白细胞介素（interleukin，IL）-6、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase3）、半胱氨酸蛋白酶 9（Caspase9）、β细胞淋巴瘤-2（β-cellymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相关蛋白X（Bcl-2-associated X protein，Bax）和β-肌动蛋白（β-actin）基因的相对表达水平，并用2-ΔΔCT方法进行分析。引物序列见表1。

表1 荧光定量聚合酶链式反应引物序列Table 1 Primer sequences used for florescence quantitative polymerase chain reaction

1.4 数据统计与分析

实验结果以平均值±标准差表示，数据采用单因素方差分析，P＜0.05具有显著性差异。所有数据结果用GraphPad Prism 5软件分析并作图。

2.1 COS对L-02细胞存活率的影响

COS处理24 h后，与对照组比较，COS在质量浓度31.25～1 000 µg/mL范围内对L-02细胞增殖能力无显著影响（P＞0.05）（图1）。

图1 COS对L-02细胞存活率的影响Fig.1 Effect of COS on L-02 cell viability

2.2 H2O2对L-02细胞氧化应激模型的影响

由图2可知，随H2O2浓度的增加，L-02细胞增殖活力逐渐降低，与对照组比较，当1 mmol/L H2O2刺激细胞1 h时细胞存活率显著下降（P＜0.05），而且细胞形态表现出明显的皱缩、变圆及触角断裂等变化。综合考虑，选择1 mmol/L H2O2诱导L-02细胞1 h进行后续实验。

图2 H2O2对L-02细胞增殖的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of H2O2 on proliferation of L-02 cells

2.3 COS对损伤L-02细胞增殖活力的改善作用

如图3所示，相较于对照组，H2O2组细胞增殖活力显著降低（P＜0.05）。与H2O2组相比，低剂量组（质量浓度100 µg/mL COS）对细胞增殖活力无显著改善作用（P＞0.05），而中剂量和高剂量COS可以显著提高H2O2损伤L-02细胞的增殖活力（P＜0.05）。进一步观察细胞形态变化发现，COS明显改善了氧化应激导致的细胞皱缩、变圆等状态。

图3 COS对H2O2损伤L-02细胞的改善作用Fig.3 Ameliorative effect of COS on proliferation and morphology of H2O2-injured L-02 cells

2.4 COS对损伤L-02细胞ROS水平的改善作用

DCFH-DA是检测ROS的最常用探针，本身无荧光，渗透进胞内后荧光强度与ROS水平成正比。经DCFH-DA探针检测后发现，与对照组比较，H2O2组的荧光强度明显增强，经COS处理后的细胞荧光强度则呈下降趋势（图4A）。通过流式细胞仪定量分析发现，H2O2组平均荧光强度高度显著高于对照组（P＜0.001），与H2O2组比较，COS中高剂量组平均荧光强度显著降低（P＜0.05）（图4B）。另外，通过单细胞纳米生化分析仪检测发现，加入DCFH-DA探针后，与对照组比较，H2O2组细胞的荧光强度逐渐增强，高剂量COS干预组细胞的荧光强度则明显低于H2O2组，结果表明，COS处理后可以缓解胞内ROS水平升高（图5）。

图4 COS对H2O2损伤L-02细胞ROS水平的改善作用Fig.4 Effect of COS on ROS level in H2O2-injured L-02 cells

图5 L-02单细胞中ROS水平变化Fig.5 Changes in ROS level in single L-02 cells

2.5 COS对损伤L-02细胞线粒体膜电位变化的影响

线粒体膜电位的下降象征了细胞凋亡现象的发生。如图6所示，相较于对照组，H2O2组中线粒体膜电位下降的细胞占比高度显著提高（P＜0.001）。与H2O2组相比，质量浓度200 µg/mL和400 µg/mL COS处理则极显著或高度显著降低了该部分细胞的占比（P＜0.01、P＜0.001）。以上结果说明COS的处理能够明显改善由H2O2造成的L-02细胞凋亡。

图6 COS对H2O2损伤L-02细胞线粒体膜电位变化的影响Fig.6 Effect of COS on mitochondrial membrane potential of H2O2-injured L-02 cells

2.6 COS对H2O2损伤L-02细胞炎症和凋亡相关基因mRNA相对表达量的影响

鉴于氧化应激损伤与细胞凋亡之间具有直接关系，为进一步评估COS对损伤细胞的修复作用，本实验探究了损伤细胞炎症、凋亡相关基因的mRNA相对表达量。如图7所示，与对照组比较，H2O2组细胞炎症因子相关基因IL-6、TNF-α和凋亡相关基因Caspase 3、Caspase 9、BaxmRNA相对表达量极显著或高度显著提高（P＜0.01、P＜0.001）；
与H2O2组相比，COS处理后细胞炎症因子相关基因和凋亡相关基因存在下降趋势，而与对照组比较，Bcl-2mRNA相对表达量在H2O2组细胞中高度显著下降（P＜0.001）。经COS处理后，Bcl-2mRNA相对表达量较H2O2组显著升高（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001）。

图7 COS对H2O2损伤L-02细胞炎症和凋亡相关基因水平的影响Fig.7 Effect of COS on mRNA expression levels of inflammation- and apoptosis-related genes in L-02 cells injured by H2O2

2.7 COS对H2O2损伤L-02细胞Nrf2/HO-1通路的调控作用

转录调节因子Nrf2与其下游调控因子HO-1二者通过级联反应在氧化应激反应中发挥关键作用。为探究COS的潜在作用机制，分析了Nrf2和HO-1mRNA相对表达量。如图8所示，与对照组比较，H2O2组细胞Nrf2、HO-1mRNA相对表达量高度显著或极显著提高（P＜0.001、P＜0.01）；
与H2O2组相比，中、高剂量COS孵育后Nrf2、HO-1mRNA相对表达量显著或极显著下降（P＜0.05、P＜0.01）。这说明Nrf2/HO-1通路可能参与了COS抗L-02细胞损伤的作用过程中。

图8 COS对H2O2损伤L-02细胞Nrf2/HO-1通路的影响Fig.8 Effect of COS on Nrf2/HO-1 signaling pathway in H2O2-injured L-02 cells

氧化应激反应在肿瘤、炎症以及神经性疾病中均发挥重要作用，而肝脏作为机体主要的解毒器官，在物质代谢和解毒过程中极易受到氧化应激的损伤，从而引起肝脏的炎症、水肿甚至坏死现象发生[10-12]。机体内过量ROS的出现是氧化应激的主要表现形式，主要由肝脏中的线粒体产生，并由抗氧化酶、II相代谢酶等清除ROS，从而维持氧化还原系统的稳态[13-14]。然而有害刺激可以打破氧化应激的平衡状态，氧化应激刺激能够通过线粒体、死亡受体、内质网应激等途径直接介导细胞凋亡及病理损伤[15]。因此，以高水平ROS为特征的氧化应激与肝病的发生发展关系越来越密切，寻找具有高抗氧化能力的ROS清除剂显得十分有必要。

COS作为天然抗氧化剂，被广泛应用于功能性食品的开发利用，已有报道显示COS拥有抗炎、降血脂、降血糖、心脑血管疾病保护等独特的生理活性[5-7,16-18]。H2O2通过诱导ROS的过量产生导致蛋白质变性或脂质损伤，是诱导氧化应激模型最常用的促氧化剂[19]。本实验通过H2O2诱导肝细胞L-02氧化应激反应，用来探究COS对肝细胞氧化应激的改善效果。结果发现，COS可以降低H2O2诱导L-02细胞氧化应激的ROS水平，改善细胞增殖活力及细胞病理状态。监测单个细胞内ROS动态变化有助于了解COS对其作用机制，结果发现在给予H2O2刺激后，与对照组相比，未经COS处理的L-02细胞内ROS水平高度显著升高（P＜0.001），然而，COS处理组的胞内ROS水平则一定程度上低于H2O2组。

鉴于氧化应激与细胞凋亡具有直接诱导关系，因此，评估COS对损伤L-02细胞凋亡的保护作用十分有意义。细胞生理功能的正常发挥依赖于线粒体内膜两侧形成的梯度电位，因此，线粒体膜电位的下降是细胞早期凋亡的一种表现形式[20]。当细胞受到氧化应激刺激时，会诱导线粒体膜电位降低或丧失，能量耗尽，而导致细胞凋亡[21-23]。在H2O2诱导的L-02细胞氧化应激模型中，线粒体膜电位明显下降，COS可以显著改善损伤细胞的线粒体膜电位下降情况。Caspase 3作为Caspase家族成员之一，是参与细胞凋亡过程的关键蛋白酶，扮演着细胞凋亡实施者的角色[24]。Bcl-2和Bax是目前已知的Caspase 3上游调控基因，Bax在外界刺激因素下可以聚集到线粒体膜上，并通过形成多聚体形式破坏线粒体膜，从而影响膜内离子浓度，促进促凋亡因子的释放[25-26]。促凋亡因子会激活Caspase 9，而活化的Caspase 9进一步诱导Caspase 3活化。但是Bcl-2的高表达可以抑制促凋亡因子的释放，平衡氧化应激反应，阻断凋亡进程[27]。本研究中COS可以抑制H2O2诱导的L-02细胞氧化应激模型中Caspase 3、Caspase 9、Bax基因水平的高表达，提高Bcl-2基因水平，进一步体现出COS对损伤细胞的抗凋亡效果。有研究发现，COS在神经元损伤和肠道氧化应激损伤中均可以通过降低Caspase家族的表达水平从而发挥保护作用[28-29]。这与本实验结果基本一致。Nrf2作为细胞氧化应激的关键蛋白，介导着胞内凋亡、炎症等多种生理反应，可增强下游抗氧化酶的表达，在机体抗氧化应激过程中起重要作用。然而，本研究结果显示，与对照组比较，H2O2刺激提高细胞中Nrf2基因的表达水平，且COS可逆转其水平。陈晶晶等研究发现，H2O2亦可诱导SH-EP1细胞中Nrf2的高表达[30]。在生理状态下，Nrf2以非活性形式存在于细胞质内，在机体处于应激状态时，会进入细胞核发挥其级联效应。故在后续实验中，应进一步检测细胞核内Nrf2及其下游因子的蛋白水平变化情况，以剖析COS改善L-02细胞氧化应激损伤的作用机制。

综上，COS可改善H2O2诱导L-02细胞的凋亡和氧化应激损伤，研究结果可为COS的进一步功能评价和应用提供一定的参考。

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