LncRNA,XIST调节miR-545-3p/SMAD5轴对人成骨细胞增殖、迁移及成骨分化的影响
时间：2023-04-25 19:10:05 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
丁平 罗政
骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种全身性骨骼疾病,表现为骨量低、骨组织退化、骨结构受损[1]。该病会增加骨折和其他骨相关疾病的发生风险,导致全球死亡率和医疗保健成本增加[2]。据报道,骨组织中成骨细胞成骨能力降低是OP形成原因之一[3]。而骨形成涉及成骨细胞增殖、迁移及分化等过程。因此,探究成骨细胞增殖、迁移及分化相关的分子机制对于OP的治疗具有重要的意义。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一种长度>200个核苷酸的非编码RNA,研究表明,lncRNAs在多种疾病中异常表达[4]。X染色体失活特异转录本(X chromosome inactivation specific transcript,XIST)是一种lncRNA,已有研究报道,过表达XIST能促进人骨髓间充质干细胞的成骨分化[5]。而XIST对人成骨细胞增殖、迁移及分化的影响笔者所见鲜有报道。lncRNA通过海绵化miRNA来调控mRNA表达是近年来阐述lncRNA作用机制的常用方法[6]。本研究通过生物信息学分析发现,XIST与miR-545-3p存在调控关系,miR-545-3p与SMAD5可靶向结合。而笔者发现XIST能否通过调控miR-545-3p/SMAD5轴影响人成骨细胞增殖、迁移及分化尚不明确。因此,本研究主要探究XIST对人成骨细胞增殖、迁移及分化的影响以及其作用的分子机制。
1.1 实验材料 人成骨细胞(human osteoblast,hOB)购自武汉原生原代生物公司。
1.2 主要试剂 CCK-8试剂盒(货号:CK04)购自上海经科化学公司;细胞核蛋白提取试剂盒(货号:KTP3002)购自亚科因(武汉)生物公司;兔源一抗SMAD5(货号:ab40771)、p-SMAD5(货号:ab92698)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)(货号:ab229126)、Runt相关转录因子2(runt related transcription factor 2,Runx2)(货号:ab236639)、骨钙素(osteocalcin,OCN)(货号:ab133612)、GAPDH(货号:ab8245)、Histone H3(简称H3,货号:ab1791)及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(货号:ab6721)均购自美国Abcam公司。
1.3 细胞培养及分化诱导 将hOB细胞置于含有10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的α-MEM培养基中,在37℃、5% CO2的潮湿环境中培养。每3天更换1次培养基。为诱导hOB细胞分化,将1×105个细胞接种在6孔板中,并在含有10 mmol/L β甘油磷酸钠、50 μmol/L抗坏血酸的分化培养基中培养。每3天更换1次培养基。
1.4 细胞转染 将对数生长期的hOB细胞分为ctrl组(正常培养的hOB细胞)、pcDNA组(转染pcDNA3.1)、pcDNA-XIST组(转染pcDNA3.1-XIST)、pcDNA-XIST+miR-NC组(pcDNA3.1-XIST和miR-NC共转染)、pcDNA-XIST+ miR-545-3p mimic组(pcDNA3.1-XIST和 miR-545-3p mimic共转染)。对hOB细胞先进行上述转染24 h,再在分化培养基中进行诱导分化培养7 d,然后进行后续实验。
1.5 qRT-PCR检测XIST、miR-545-3p表达 使用Trizol试剂提取细胞中的总RNA,将RNA逆转录为cDNA后,以cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。分别以GAPDH、U6为内参,使用2-ΔΔCt方法计算XIST、miR-545-3p的表达量。引物:XIST:正向5’-CATTGCTAGGCATTGGGGATG-3’;反向,5’-CCAGGAAGCATGTATCTTCTGG-3’;GAPDH:正向,5’-CTGGGCTACACTGAGCACC-3’;反向,5’-AATGGTCGTTGAGGGCAATG-3’;miR-545-3p:正向,5’-TGGCTCAGTTCAGCAGGAAC-3’;反向,5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’;U6:正向,5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’;反向,5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。
1.6 CCK-8法检测细胞增殖 转染的细胞以5×104个/孔接种到96孔板中。分别将细胞培养24、48、72 h后,弃去细胞上清液,且在指定的时间点向每个孔中加入含有10 μl CCK-8溶液的100 μl完全培养基。孵育2 h后,使用酶标仪在450 nm处监测吸光度。
1.7 划痕实验检测细胞迁移 细胞以5×105个/孔接种到6孔板中,使用100 μl移液器吸头在约达到100%汇合细胞单层上进行划痕。用倒置光学显微镜记录0、48 h的划痕面积为W0和W48。划痕愈合率(%)=(1-W48/W0)/×100%。
1.8 Western blot检测蛋白表达 利用细胞核蛋白提取试剂盒提取hOB细胞核蛋白,RIPA裂解缓冲液提取hOB细胞总蛋白。检测hOB细胞总蛋白中SMAD5、ALP、Runx2、OCN蛋白表达,hOB细胞核蛋白中p-SMAD5蛋白表达。具体操作:将蛋白质进行定量、电泳、转膜、封闭后,将膜与一抗SMAD5、ALP、Runx2、OCN、GAPDH、Histone H3在4℃下孵育过夜,再将膜与HRP偶联的羊抗兔二抗在室温下孵育2 h。加入ECL试剂观察蛋白质印迹,Image J软件评估蛋白的灰度值。
1.9 茜素红S染色检测矿化结节形成 将在分化培养基上诱导分化7 d的各转染组细胞用PBS洗涤2次,并在室温下用95%乙醇固定10 min。随后,将固定的细胞在37℃下用1%茜素红S溶液染色30 min,使用光学显微镜观察矿化结节形成情况。通过使用Image J软件来评估矿化结节形成率。
1.10 双荧光素酶报告基因实验 (1)构建XIST野生型质粒(XIST-WT)和突变型质粒(XIST-MUT),将XIST-WT和XIST-MUT分别与miR-NC或miR-545-3p mimic共转染于hOB细胞,48 h后,检测荧光素酶活性。(2)构建SMAD5野生型质粒(SMAD5-WT)和突变型质粒(SMAD5-MUT),将SMAD5-WT和SMAD5-MUT分别与miR-NC或miR-545-3p mimic共转染于hOB细胞,48 h后,检测荧光素酶活性。
2.1 5组hOB细胞中XIST及miR-545-3p表达比较 与ctrl组、pcDNA组比较,pcDNA-XIST组hOB细胞中XIST表达升高、miR-545-3p表达降低(P<0.05);与pcDNA-XIST组、pcDNA-XIST+miR-NC组比较,pcDNA-XIST+ miR-545-3p mimic组hOB细胞中XIST表达差异无统计学意义(P>0.05),miR-545-3p表达升高(P<0.05)。见表1。
表1 5组hOB细胞中XIST、miR-545-3p表达比较
2.2 5组hOB细胞增殖能力比较 与ctrl组、pcDNA组比较,pcDNA-XIST组hOB细胞OD450值(48、72 h)升高(P<0.05);与pcDNA-XIST组、pcDNA-XIST+miR-NC组比较,pcDNA-XIST+ miR-545-3p mimic组hOB细胞OD450值(48、72 h)降低(P<0.05)。见表2。
表2 5组hOB细胞OD450值比较
2.3 5组hOB细胞迁移能力比较 与ctrl组、pcDNA组比较,pcDNA-XIST组hOB细胞划痕愈合率升高(P<0.05);与pcDNA-XIST组、pcDNA-XIST+miR-NC组比较,pcDNA-XIST+ miR-545-3p mimic组hOB细胞划痕愈合率降低(P<0.05)。见图1,表3。
图1 划痕实验检测hOB细胞迁移(×100)
表3 5组hOB细胞划痕愈合率比较
2.4 5组hOB细胞中SMAD5及成骨分化标志蛋白ALP、Runx2、OCN表达比较 与ctrl组、pcDNA组比较,pcDNA-XIST组hOB细胞中SMAD5、ALP、Runx2、OCN蛋白表达升高,细胞核中p-SMAD5蛋白表达升高(P<0.05);与pcDNA-XIST组、pcDNA-XIST+miR-NC组比较,pcDNA-XIST+ miR-545-3p mimic组hOB细胞中SMAD5、ALP、Runx2、OCN蛋白表达降低,细胞核中p-SMAD5蛋白表达降低(P<0.05)。见图2、3,表4。
图2 Western blot检测hOB细胞中SMAD5、ALP、Runx2、OCN蛋白表达;A ctrl组;B pcDNA组;C pcDNA-XIST组;D pcDNA-XIST+miR-NC组;E pcDNA-XIST+ miR-545-3p mimic组
图3 Western blot检测hOB细胞核中p-SMAD5蛋白表达;A ctrl组;B pcDNA组;C pcDNA-XIST组;D pcDNA-XIST+miR-NC组;E pcDNA-XIST+ miR-545-3p mimic组
表4 5组hOB细胞中SMAD5、ALP、Runx2、OCN蛋白表达及细胞核中p-SMAD5蛋白表达比较
2.5 5组hOB细胞矿化结节形成比较 与ctrl组、pcDNA组比较,pcDNA-XIST组hOB细胞矿化结节形成增多(P<0.05);与pcDNA-XIST组、pcDNA-XIST+miR-NC组比较,pcDNA-XIST+ miR-545-3p mimic组hOB细胞矿化结节形成减少(P<0.05)。见图4,表5。
图4 茜素红S染色检测hOB细胞矿化结节形成(×200)
表5 5组hOB细胞矿化结节形成率比较
2.6 双荧光素酶报告基因检测结果 分别利用Starbase、TargetScan网站预测XIST与miR-545-3p、miR-545-3p与SMAD5的结合位点。与miR-NC和XIST-WT共转染组比较,miR-545-3p mimic和XIST-WT共转染组荧光素酶活性降低(P<0.05);与miR-NC和XIST-MUT共转染组比较,miR-545-3p mimic和XIST-MUT共转染组荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。与miR-NC和SMAD5-WT共转染组比较,miR-545-3p mimic和SMAD5-WT共转染组的荧光素酶活性降低(P<0.05);与miR-NC和SMAD5-MUT共转染组比较,miR-545-3p mimic和SMAD5-MUT共转染组荧光素酶活性变化差异无统计学意义(P>0.05)。见图5、6,表6,7。
图5 XIST与miR-545-3p的结合位点
图6 miR-545-3p与SMAD5的结合位点
表6 荧光素酶活性比较
表7 荧光素酶活性比较
作为一种慢性骨骼疾病,OP的特点是骨结构受损和骨量低,并且其发病时可以降低骨强度和增加骨折的易感性[7]。双膦酸盐是常见地用于治疗OP的药物,长期使用这些药物可以降低OP患者骨折的风险[8]。然而,目前的药物治疗方案存在各种限制,包括治疗效果缓慢和长期使用时不良事件风险增加等[9]。因此,开发新的治疗策略来调节OP患者的骨形成至关重要。
证据表明,lncRNA参与骨重构以调节代谢性骨病,例如OP[10]。XIST是一种涉及X染色体失活的lncRNA[11]。有研究报道,沉默XIST抑制牙周膜干细胞的成骨分化[12]。而笔者发现XIST对人成骨细胞hOB的影响尚不完全清楚。成骨细胞的充分迁移对于维持骨的质量和数量都很重要,成骨细胞迁移障碍可能会降低骨强度,导致骨折风险增加[13]。此外,成骨细胞的增殖与成骨分化对于骨形成至关重要[14]。ALP、Runx2、OCN是成骨分化的标志蛋白,ALP为成骨分化早期的标志物,其在细胞内表达增高代表成骨的增加[15];OCN是一种成骨分化晚期的标志物,出现在成骨分化和矿化过程中[16];Runx2与成骨细胞特异性顺式作用元件2结合,作为成骨细胞分化的关键转录调节因子发挥作用[4]。成骨分化还包括基质的沉积和矿化等过程[17]。本研究结果显示,过表达XIST促进hOB细胞增殖、迁移,ALP、Runx2、OCN蛋白表达、矿化结节形成,提示过表达XIST可促进hOB细胞增殖、迁移及成骨分化。
研究证实lncRNA可以作为竞争性内源性RNA来下调miRNA[18]。本研究证实XIST是miR-545-3p的海绵。miR-545-3p是一种miRNA,已有研究发现miR-545-3p可阻碍成骨分化[19]。本研究结果与文献[19]是一致的。本研究结果显示,过表达XIST可靶向负调控miR-545-3p表达,且上调miR-545-3p减弱了过表达XIST对hOB细胞增殖、迁移及成骨分化的促进作用。提示过表达XIST可能通过下调miR-545-3p促进hOB细胞增殖、迁移及成骨分化。
此外,本研究表明,SMAD5是miR-545-3p的靶标。SMAD5是一种受体调节的SMAD蛋白,其是成骨分化的关键转录因子,在生理条件下,SMAD5主要位于细胞质中,当SMAD5被磷酸化时,它被导向细胞核,进而调节成骨基因的表达,诱导成骨分化[20]。据报道,抑制p-SMAD5的核转位可以抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化[21]。本研究表明,过表达XIST促进SMAD5蛋白及核p-SMAD5蛋白表达,上调miR-545-3p减弱了过表达XIST对SMAD5蛋白及核p-SMAD5蛋白表达的促进作用,且miR-545-3p靶向调控SMAD5表达,提示过表达XIST可能通过海绵化miR-545-3p并上调SMAD5促进hOB细胞增殖、迁移及成骨分化。
综上所述,过表达XIST可能通过海绵化miR-545-3p并上调SMAD5促进hOB细胞增殖、迁移及成骨分化。XIST/miR-545-3p/SMAD5轴可能成为治疗OP的一种新的靶点。然而本研究尚存在不足之处,仅仅在细胞水平上验证了XIST/miR-545-3p/SMAD5轴对hOB细胞增殖、迁移及成骨分化的影响,并未在体内水平上进行探讨,后续研究将会在体内水平上进行进一步探索。
猜你喜欢共转染货号成骨lncRNA SNHG6通过microRNA-26b-5p对三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的作用机制研究*中国现代医学杂志(2022年16期)2022-08-31经典Wnt信号通路与牙周膜干细胞成骨分化口腔医学(2021年10期)2021-12-02鞋品牌新品爆单“故事汇”服饰导报·鞋世界(2021年4期)2021-05-17长链非编码RNA-ATB对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究中国现代医学杂志(2021年4期)2021-03-16EIAV Rev 蛋白拮抗eqTRIM5α介导的AP-1 信号通路的机制研究中国预防兽医学报(2020年1期)2020-06-05作者更正致歉说明中国药理学通报(2019年5期)2019-01-11糖尿病大鼠Nfic与成骨相关基因表达的研究中华老年口腔医学杂志(2016年2期)2017-01-15绵羊肺腺瘤病毒SU蛋白与Hyal-2蛋白的结合域研究动物医学进展(2016年4期)2016-05-10液晶/聚氨酯复合基底影响rBMSCs成骨分化的研究中国病理生理杂志(2015年8期)2015-12-2130例Ⅰ型成骨不全患者股骨干骨折术后康复护理天津护理(2015年4期)2015-11-10
