藿乌粉的提取工艺研究
时间：2023-04-16 18:35:03 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
卢鹏怀， 曹众达， 孙耀贵， 孙盼盼， 孙 娜， 李宏全， 程 佳
(中兽医药现代化山西省重点实验室， 山西农业大学动物医学学院， 山西太谷 030801)
我国是畜禽养殖与消费大国， 鸡蛋产量位居世界首位， 但我国“小规模、大群体”的产业特征依然存在， 万只以下的中小规模养殖仍然是蛋鸡养殖的主体。由于生产设施简陋、饲养管理不到位、从业人员专业知识匮乏、疾病、应激等因素的影响， 导致蛋鸡养殖过程中疾病频发、高峰产蛋率降低、蛋品质下降。在实际养殖过程中， 经营者为了追求蛋鸡的生产性能和抗疾病能力， 往往会在饲料中添加抗生素。长期不规范使用抗生素， 不仅会引起蛋鸡免疫能力下降、肠道菌群平衡破坏等一系列问题， 同时还会危害到人类的健康。中草药富含多种生物活性物质和营养成分， 具有纯天然、耐药性弱、有害残留少、毒副作用小等优势， 在替代抗生素方面有着巨大的潜力。2020版《中国兽药典》二部中收录的具有改善蛋鸡产蛋性能、提升蛋品质的中兽药仅有降脂增蛋散、蛋鸡宝、激蛋散三种[1]。且三种中兽药均为传统散剂， 存在组方药味多、制剂工艺粗糙、质量难以控制、药物利用率低、疗效不稳定等缺点。蛋鸡养殖行业迫切需要能够安全、有效延长蛋鸡产蛋周期， 提升蛋品质的新型中兽药。
淫羊藿和制何首乌为传统补益中药。淫羊藿为助阳药， 性温， 味辛、甘， 归肝经、肾经， 具有温肾助阳、强筋壮骨、益精补气的功效。现代药理研究表明其主要有促进性腺功能、防治骨质疏松、促进造血功能、抗肿瘤、抗炎等作用[2-3]。制何首乌为滋阴药， 性微温， 味苦、甘、涩， 归肝、心、肾经， 具有滋补肝肾、填精益血、强筋健骨的功效。现代药理研究表明其主要有延缓机体衰老、增强机体免疫力、改善心脑血管功能、预防动脉粥样硬化等作用[4-5]。课题组前期针对蛋鸡产蛋时期的生理特点， 以肝肾阴阳双补立法， 精选淫羊藿、制何首乌两味药材进行组方， 经粉碎混合制备成传统散剂“藿乌散”， 研究发现其具有提高蛋鸡产蛋性能和改善蛋品质的效果。为了更好的推广应用， 课题组拟将传统散剂“藿乌散”开发成一款新型中兽药“藿乌粉”。
本研究将在前期研究的基础上， 应用现代中兽药制剂技术，进行 “藿乌粉”的提取工艺研究， 为将其开发为微量、安全、高效、质量可控、使用方便的新型中兽药和在蛋鸡养殖过程中的推广应用奠定基础。
1.1 仪器 Agilent 1260 Infinity Ⅱ 高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；
B-491旋转蒸发仪(瑞士BU CHI公司)；
SB25-12D超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；
TB-215D电子分析天平(德国赛多利斯天平有限公司)；
HH-56数显恒温水浴锅(江苏金坛市金城国胜实验仪器厂)。
1.2 试药 对照品2， 3， 5， 4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(简称二苯乙烯苷、批号82373-94-2， 含量98%)、淫羊藿苷(批号489-32-7， 含量98%)、朝藿定A(批号110623-72-8， 含量98%)、朝藿定B(批号110623-73-9， 含量98%)， 购于江西佰草源生物科技有限公司；
液相部分所用甲醇、乙腈、乙醇均为色谱纯(美国Fisher公司)；
淫羊藿、制何首乌药材， 购于河北省安国市祁源中药材有限公司。
2.1 含量测定
2.1.1 色谱条件 Agilent 5 TC-C18(250 mm×4.6 mm)色谱柱；
柱温30 ℃， 流速1 mL/min， 进样量10 μL；
二苯乙烯苷含量检测：以V(乙腈)∶V(水)= 25∶75为流动相；
检测波长为320 nm；
淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B含量检测：以V(乙腈)∶V(水)=30∶70为流动相；
检测波长为270 nm。
2.1.2 对照品溶液的制备 精密称定二苯乙烯苷对照品适量， 加50%乙醇定容至刻度， 制成0.3920 mg/mL的对照品储备液。精密称定淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B对照品适量， 加50%乙醇定容至刻度， 制成含淫羊藿苷0.3463 mg/mL、朝藿定A 0.2334 mg/mL、朝藿定B 0.2607 mg/mL的混合对照品储备液。
2.1.3 供试品溶液的制备 精密称取藿乌提取物0.1 g， 置具塞锥形瓶中， 加入50%乙醇20 mL， 称定重量， 超声处理15 min， 用50%乙醇补足减失的重量， 摇匀， 滤过， 取续滤液， 即得。
2.1.4 阴性供试品溶液的制备 分别称取缺制何首乌、淫羊藿的阴性处方量药材2份， 按最佳工艺制得缺何首乌和缺淫羊藿阴性样品。精密称取阴性样品0.1 g， 同“2.1.3”项下的处理方法， 制得阴性供试品溶液。
2.1.5 方法学考察
2.1.5.1 系统适应性 取对照品、供试品、阴性对照溶液适量， 分别进样， 得到相应的液相图谱。二苯乙烯苷色谱图见图1， 淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B三种成分的色谱图见图2。
A-对照品；
B-供试品；
C-缺制何首乌阴性供试品；
1- 二苯乙烯苷图1 二苯乙烯苷HPLC图Fig 1 HPLC chromatograms of Stilbene glycoside
A-对照品；
B-供试品；
C-缺淫羊藿阴性供试品；
1- 朝藿定A；
2-朝藿定B；
3-淫羊藿苷图2 淫羊藿三种黄酮成分的HPLC图Fig 2 HPLC chromatograms of three flavonoids in Epimedium
2.1.5.2 线性关系考察 精密吸取上述对照品溶液、混合对照品溶液适量， 对照品溶液依次稀释2、4、8、16、32倍。混合对照品溶液依次稀释2、4、8、16、32、64倍。按相应的色谱条件进样测定， 记录峰面积。以峰面积为纵坐标(Y)， 质量浓度为横坐标(X)绘制标准曲线， 进行回归分析， 线性关系考察结果见表1。
表1 线性关系考察Tab 1 Investigation of linear relationship
2.1.5.3 精密度试验 取对照品溶液、混合对照品溶液各一份， 按相应的色谱条件重复进样6次， 测得二苯乙烯苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B峰面积的RSD值分别为0.55%、0.66%、0.67%、0.75%， 表明仪器精密度良好。
2.1 穴播根据树种的种粒大小，每穴均匀地播入数粒到数十粒种子。播后覆土镇压。操作简单、灵活、用工量少。
2.1.5.4 稳定性试验 取对照品溶液、混合对照品溶液各一份， 按相应的色谱条件分别在0， 2， 4， 8， 12， 24 h时进样， 测得二苯乙烯苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B峰面积的RSD值分别为0.62%、0.42%、0.47%、0.49%， 表明对照品溶液和混合对照品溶液在24 h内稳定性良好。
2.1.5.5 重复性试验 取同一份供试品， 根据“2.1.3”项下的供试品制备方法， 平行制备6份供试品溶液， 并按照相应的色谱条件测定各成分的含量， 测得二苯乙烯苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B的平均质量分数分别为35.23、19.70、7.12、11.20 mg/g，RSD分别为1.55%、0.48%、0.78%、0.77%。
2.1.5.6 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品(二苯乙烯苷35.78 mg/g、淫羊藿苷19.78 mg/g、朝藿定A 7.10 mg/g、朝藿定B 11.39 mg/g)0.025 g， 共6份， 分别置于50 mL锥形瓶中， 加入1 mL混合对照品溶液(二苯乙烯苷0.8931 mg/mL、淫羊藿苷1.648 mg/mL、朝藿定A 0.625 mg/mL、朝藿定B 1.060 mg/mL， 50%乙醇制)， 50%乙醇定容至20 mL。按“2.1.3”项下供试品的处理方法进行处理， 之后按相应的色谱条件测定， 测得二苯乙烯苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B的平均加样回收率分别为102.05%、99.40%、101.04%、99.14%，RSD值分别为1.80%、0.43%、0.41%、0.40%， 结果表明该方法回收率良好。
2.2 干膏得率测定 将藿乌粉提取液减压浓缩， 得生药质量浓度0.5 g/mL的浓缩液。精密吸取浓缩液100 mL， 置已干燥恒重的蒸发皿内， 60 ℃水浴蒸干， 于105 ℃干燥3 h， 取出置干燥器冷却0.5 h， 精密称定重量， 计算干膏得率。干膏得率=(m1-m0)/M×100%， m0为蒸发皿质量， m1为干浸膏与蒸发皿总质量， M为中药饮片的质量。
2.3 单因素试验 取处方量药材14份， 分别以乙醇浓度(A)、固液比(B)、提取时间(C)和提取次数(D)为自变量， 以二苯乙烯苷含量、三种黄酮之和以及干膏得率的综合评分为因变量， 进行提取， 提取液抽滤后照2.2项下方法得到干浸膏， 并计算干膏得率。将干浸膏粉碎， 照2.1项下的方法测定三种黄酮之和以及二苯乙烯苷的含量。
2.4 正交试验 在前期单因素实验的基础上， 以乙醇浓度(A)、固液比(B)、提取时间(C)和提取次数(D)为自变量， 以二苯乙烯苷、三种黄酮之和以及干膏得率的综合评分为因变量， 采用L9(34)正交试验优化提取工艺， 正交试验设计表见表2。综合评分Y=二苯乙烯苷含量/最高含量×权重系数+三种黄酮之和/最高含量×权重系数+干膏得率/最高得率×权重系数。
表2 正交因素水平L9(34) 表Tab 2 Factors and levels of L9(34) orthogonal test
2.5 指标权重的确定
2.5.1 AHP法 据藿乌粉中各指标对药理活性作用的强弱， 采用1 ～ 9标度法[6]对二苯乙烯苷、三种黄酮之和以及干膏得率三个权重指标进行量化， 各指标优先顺序如下：二苯乙烯苷>三种黄酮之和>干膏得率， 构建成对比较的优先判断矩阵， 见表3。根据矩阵评分情况利用SPSSAU软件进行AHP层次分析， 分析得二苯乙烯苷、三种黄酮之和以及干膏得率的权重系数分别为 0.5390、0.2972、0.1638。一致性比例因子(CR)=0.0089<0.10,因此判断矩阵评分具有良好的一致性， 求得的权重系数有效。
表3 判断矩阵评分Tab 3 Judgment matrix scoring
2.5.2 CRITIC法 CRITIC法是一种客观的权重赋值方法， 它通过数据的标准差和相关系数来体现评价指标之间的变异性和冲突性[7]。首先将正交中的数据进行归一化处理， 归一化的数据经SPSSAU软件分析， 得二苯乙烯苷、三种黄酮之和、干膏得率的权重系数分别为0.2969、0.4439、0.2592。
2.5.4 综合评价结果比较 分别采用AHP、CRITIC、AHP-CRITIC综合加权法对正交试验的数据进行综合评价， 结果见表4。使用SPSS 25软件对三种方法的评分结果进行相关系数分析。AHP法和AHP-CRITIC法、CRITIC法和AHP-CRITIC法、AHP法和CRITIC法评分的相关系数分别为0.9817、0.9212、0.8854， 三者相关性显著(P<0.01)。AHP和CRITIC法各指标权重系数的相关系数为0.0291， 接近于0， 且P>0.05， 说明AHP和CRITIC法确定的权重系数没有相关关系， 故选用AHP-CRITIC综合加权法来评价试验结果。
表4 3种赋权方法综合评分Tab 4 Synthetical scores of three weighting methods
2.6 提取工艺的验证 精密称取粗粉过的混合药材3份， 每份100 g， 以筛选出的最优工艺条件进行试验， 测定各项指标。
3.1 单因素试验 试验结果见表5(序号1～5、6～10、11～14依次为乙醇浓度、固液比、提取时间的单因素试验)。由序号1～5的结果可知， 随着提取溶剂中乙醇浓度的增加， 评分先增加后减少， 并在浓度为60%时评分最高， 因此将正交试验中乙醇的浓度水平设置为60%、70%、80%；
由序号6～10的结果可知， 随着固液比的增加， 评分先增加后减少， 并在固液比为1∶12时达到最高， 因此将正交试验中固液比的水平定为1∶8、1∶12、1∶16；
由序号11～14的结果可知， 随着提取时间的增加， 评分先增加后减少， 并在1.5 h时达到最高， 因此将提取时间的水平设置为0.5 h、1 h、1.5 h；
前期预试验结果表明提取次数也对提取效果有一定的影响， 为此增加了提取次数因素， 并将水平设置为1、2、3次。
表5 单因素试验设计与结果Tab 5 Single factor test design and results
3.2 正交试验 根据AHP-CRITIC法确定的权重系数对正交试验结果进行综合评分， 正交试验设计与结果见表6， 方差分析见表7。根据表6极值(R)的大小， 可知各因素主次关系为C>D>B>A。由表7可知， 四个因素对提取效果均无显著性影响， 因此取各因素较高水平的组合， 得最佳工艺为A2B2C3D2。考虑到乙醇浓度(A因素)K1和K2的值相差不大， 且对提取效果的影响最小， 故选用成本更低的A1， 最终确定提取工艺为A1B2C3D2， 即12倍量60%的乙醇加热回流2次， 每次1.5 h。
表6 正交试验设计与结果Tab 6 Orthogonal test design and results
表7 方差分析Tab 7 Analysis of variance
3.3 提取工艺的验证 提取工艺的验证结果见表8。由表8可知， 各指标成分和综合评分的RSD值均小于2%， 且平均综合评分大于之前所有的单因素试验。结果表明优选出的工艺稳定， 主要活性成分的提取率高， 可用于藿乌粉的制备。
表8 提取工艺的验证结果/(mg·g- 1)Tab 8 Results of extraction process verification experiment/(mg·g- 1)
本研究在查阅淫羊藿、制何首乌提取工艺相关文献后， 选择了二苯乙烯苷作为评价藿乌粉中制何首乌提取效果的指标[9-10], 淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B三种黄酮成分作为评价淫羊藿提取效果的指标[11-12]。二苯乙烯苷是制何首乌中的主要活性成分， YANG等的研究表明二苯乙烯苷类成分能增强D-半乳糖致衰老小鼠肝脏的抗氧化能力从而延缓小鼠衰老[13]。淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B是淫羊藿总黄酮的评价指标。淫羊藿总黄酮是淫羊藿的主要活性成分， 具有促进蛋鸡生殖系统发育的作用， GUO等的研究表明淫羊藿总黄酮能显著提高蛋鸡颗粒细胞的增殖、分化， 并促进初级卵泡向层前卵泡的转化[14]。
在选择藿乌粉中二苯乙烯苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B四种成分的含量测定方法时， 曾借鉴了江勋等人的思路[15]， 尝试建立一种一测多评四种成分的HPLC方法。但最终的效果并不理想， 为此选择了分开测定二苯乙烯苷和淫羊藿三种黄酮成分的含量。二苯乙烯苷含量的测定方法参照了《中国药典》2020版一部何首乌项下的方法[16]， 该方法重复性好， 且阴性无干扰， 故使用该方法作为测定藿乌粉中二苯乙烯苷含量的方法。淫羊藿三种黄酮成分含量的测定方法主要参照了《中国药典》2020版一部淫羊藿项下的方法[16]， 但该方法用时较长， 需要近35 min才能完全出峰， 因此适当提升了流动相中乙腈的比例， 将三种物质的出峰时间压缩至20 min内。
在选择多指标权重方法时， 本文提到的AHP法虽能在一定程度上体现复方中药君臣佐使的配伍规律， 但容易受主观判断的影响， 忽略数据本身的客观属性。CRITIC法虽能体现数据波动性和数据间相关关系等客观属性， 但它没有考虑到指标间的轻重关系。AHP-CRITIC综合加权法则结合了上述两种方法的优点， 在考虑各指标轻重关系的同时又兼顾了数据本身的客观属性， 因此选用AHP-CRITIC综合加权法对正交试验的结果进行分析。
采用AHP-CRITIC综合加权法结合正交试验优选出的提取工艺经验证稳定、可行重复性好， 可用于藿乌粉的制备。
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