褐藻寡糖及其锌络合物对暗纹东方鲀消化能力、血清生化指标及肠道菌群的影响

■张梦婷 李兆新 邢丽红 段 蕊 张俊杰 郑旭颖 朱盼盼 王学江

（1.中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛 266071；
2.江苏海洋大学，江苏连云港 222005；
3.五洲丰农业科技有限公司，山东烟台 264000）

暗纹东方鲀（Takifugu Obscurus），习称河鲀，是一种洄游性鱼类[1]，与鲥鱼、刀鱼并称“长江三鲜”[2]。河鲀肉味腴美，营养、药用价值高[3]，深受消费者喜爱[4]。人工养殖技术日渐成熟，经过合理驯食，可摄食人工配合饲料[5]。河鲀养殖业从沿海扩展到内地，成为出口、提高渔民收入的重要经济鱼类[6]。然而，人工养殖过程中易爆发细菌性疾病，产生寄生虫，易导致死亡率上升、生长缓慢。

寡糖又称低聚糖，是糖苷键聚合2～10 个单糖形成的，分为普通寡糖和功能性寡糖[7]。功能性寡糖具有抗菌、抗炎、抗病毒、提高机体免疫功能、降血压血脂等多种功效，且能有效刺激肠道蠕动，促进肠道健康[8]。褐藻寡糖（Alginate oligosaccharide, AOS）是褐藻酸钠降解产生的由甘露糖醛酸（M）和古洛糖醛酸（G）构成的一类阴离子寡糖[9-10]。褐藻酸钠，又称褐藻胶，存在于褐藻类植物细胞壁中[11]。褐藻寡糖安全无毒、稳定，有助于植物生长、抗氧化等生物活性，还具有抗病毒、保护神经等生理药理功能[12]。在动物养殖中，褐藻寡糖具有生长调节、免疫调节、抑菌作用。褐藻寡糖锌为褐藻寡糖与金属锌的络合物，锌可提高免疫力，保证胃肠道菌群平衡、肝脏代谢，维持肝脏中产生的免疫因子的正常生长发育，维持机体免疫系统，提高抵抗力[13]。寡糖与锌络合可有效增强抗菌活性[14]。

本实验在暗纹东方鲀饲料中分别添加褐藻寡糖、褐藻寡糖锌，进行60 d 的养殖实验，探究褐藻寡糖及其锌络合物对暗纹东方鲀的生长性能、肠道菌群、血清指标及消化酶活性的影响，为进一步研究功能性寡糖和拓宽其在水产养殖业中的应用、为开发天然经济的暗纹东方鲀绿色专用饲料添加剂提供理论参考。

1.1 材料

以鱼粉、小麦粉、豆粕等为原料，饲料原料经粉碎过40 目筛，混合均匀后用颗粒饲料压制机（合肥市穗联机械有限公司）加工、烘干成颗粒饲料备用，配成基础饲料，饲料配方及营养水平见表1。褐藻寡糖、褐藻寡糖锌由山东省烟台市五州丰农业有限公司提供，褐藻寡糖由海带（Laminaria japonica）细胞壁中海藻酸钠经酶降解制得，纯度≥95%，聚合度2～7（具体指标见表2）。褐藻寡糖锌是由褐藻寡糖与七水合硫酸锌[锌离子（Zn2＋）主要与藻酸原料中的羧基络合]，参考GB 5009.14—2017 中火焰原子吸收光谱法测得锌含量6.5%，以上均为该公司技术提供。由江苏南通龙洋水产有限公司海安基地提供试验暗纹东方鲀，试验所用暗纹东方鲀初始体重为（38.6±1.2）g，体长（9.50±0.05）cm。

表1 基础饲料成分配方及营养水平(%)

表2 褐藻寡糖的基础指标

1.2 实验仪器与试剂

KJELTEC2300全自动凯式定氮仪（瑞典福斯特卡托公司）；
Sotex2055 全自动脂肪测定仪（瑞典福斯特卡托公司）；
B180马弗炉（Nabertherm公司）；
UV-1780紫外分光光度计（岛津公司（日本））；
B-260恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）；
SpectraMax i3x 多功能酶标仪（美谷分子仪器有限公司）；
IS-RDS3叠加式恒温振荡器（Crystal（美国））；
SPX智能生化培养箱（宁波江南仪器厂）。

硫酸（分析纯，南京化学试剂有限公司）；
盐酸（分析纯，南京化学试剂有限公司）；
无水乙醚（分析纯，生工生物工程有限公司）；
无水乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；
氯化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；
Gene JET 胶回收试剂盒（Thermo Scientific 公司）；
NEB Next®UltraTM DNA Library Prep S0it for Illumina 建库试剂盒（New England Bolabs 公司）；
Phusion High-Fidelity PCR Master Mixwith GC Buffer缓冲液（New England Bolabs公司）。

1.3 实验设计

养殖实验在位于江苏省南通市海安市的中洋河豚庄园养殖基地进行。正式试验前，挑选350尾健康无伤的暗纹东方鲀，暂养7 d，使之逐渐适应环境和配合饲料。正式实验挑选270尾规格均一、体表无伤的暗纹东方鲀，随机分3组（A、B、C组），每组3个平行养殖桶，每桶30尾，养殖桶直径1.5 m，高0.8 m。A组为对照组，饲喂基础日粮，B 组为添加0.23%褐藻寡糖组，C 组为添加0.23%褐藻寡糖锌组（褐藻寡糖锌含量为6.5%，根据暗纹东方鲀饲料中锌含量为147.96 mg/kg计算[15]，褐藻寡糖锌的添加量为0.23%）。养殖实验为60 d，试验结束，禁食24 h，计数称重、取样。

1.4 养殖管理

实验期间，每天投喂两次(8：00和16：00)，日投喂量为体质量的3%～4%。实验期间投喂量根据暗纹东方鲀体质量和摄食情况适当加以调整。实验期间养殖用水为地下水，水温保持在（24±1）℃；
每2天换水1/3，24 h连续充气。养殖用水各项指标见表3。

表3 养殖用水指标

1.5 取样与测定方法

1.5.1 生长活性评价

养殖试验开始前、结束后，对每桶暗纹东方鲀鱼体进行称重，测定每桶暗纹东方鲀鱼的体重和尾数，计算特定生长率、增重率。

式中：m1——试验鱼初重量（g）；

m2——试验鱼末重量（g）；

t——养殖时间（d）。

1.5.2 组织营养成分测定

养殖结束，禁食24 h，每桶取6尾鱼，取肌肉冷冻保存，经匀浆后参考GB5009.6—2016、GB5009.5—2016测定组织中粗脂肪、粗蛋白含量。

1.5.3 血清生化指标

养殖结束，禁食24 h，每桶取6尾鱼，纱布擦干水分，一次性注射器尾静脉采血，血样于0～4 ℃的冰箱中静置8 h待分层，4 000 r/min、4 ℃离心10 min，提取血清，-80 ℃冰箱中保存。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）、溶菌酶（Lysozyme，LZM)、过氧化物酶（Peroxidase，POD）酶活性均采用南京建成生物工程研究所有限公司试剂盒测定。

1.5.4 消化酶活性

养殖结束，禁食24 h，每桶取6 尾鱼，取肠道，剥离附着的肠系膜，用去离子水清洗肠道内容物。按1∶9 量取一定量的生理盐水在冰水浴条件下匀浆，3 000 r/min离心10 min，吸取上清液以备用来分析其消化酶的活性。α-淀粉酶（α-Amylase，AMS）、脂肪酶（Lipase，LPS）、胃蛋白酶（Pepsint）、纤维素酶（Cellulase）酶活性均采用南京建成生物工程研究所有限公司试剂盒测定。

1.5.5 肠道微生物菌群

养殖结束，禁食24 h，每桶取1尾鱼，取肠道，剥离附着的肠系膜，用去离子水清洗肠道内容物，于-80 ℃保存。针对细菌的16S rRNA 基因V3～V4 区域的细菌进行扩增，利用引物341F 和806R，引物序列为，341F：5"-CCTAYGGGRBGCASCAG-3"，806R：5"-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3"，扩增产物经纯化，通过高通量测序来分析肠道微生物群的多样性[16]。

PCR扩增采用30 μL反应体系：2×Phusion Master Mix 15 μL，3 μL Primer，1 ng/μL g DNA 10 μL，2 μL H2O。反应程序：98 ℃预变性1 min；
30 个循环包括（98 ℃10 s；
50 ℃30 s；
72 ℃30 s）；
72 ℃，5min。

采用SDS 方法对样本的基因组DNA 进行提取，根据PCR 产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用1×TAE 浓度2%的琼脂糖电泳纯化PCR 产物，使用Gene JET 胶回收试剂盒（Thermo Scientific）胶回收PCR 产 物，使 用NEB Next®UltraTM DNA Library Prep Kit for Illumina 建库试剂盒（New England Bolabs）进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit 定量和文库检测，合格后使用Mi Seq 进行上机测序（北京诺禾致源科技股份有限公司）。

1.6 统计分析方法

实验数据利用EXCEL 2010整理，采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，差异显著水平为P＜0.05。统计数据以“平均值±标准差（X±SD）”的形式表示。

2.1 生长活性评价

已有研究表明，水产动物饲料中添加功能性寡糖可提高营养吸收率，具有抑制病原菌、增殖有益菌、维持肠道健康的作用，从而促进生长[17]。寡糖影响蛋白质的合成，调节代谢水平，达到促生长效果[18]。本实验中经过60 d的养殖，每组增加率、特定生长率均为：褐藻寡糖组＞基础饲料组＞褐藻寡糖锌组。与基础饲料相比，添加0.23%褐藻寡糖组的增重率、特定生长率分别为43.44%、0.64%，高于对照组。说明褐藻寡糖有一定的促生长效果。而添加0.23%褐藻寡糖锌组的增重率、特定生长率分别为37.02%、0.56%，低于对照组，均无显著性差异。

阎桂玲等[19]发现褐藻寡糖对肉鸡的促生长效果不显著。霍圃宇等[20]向大菱鲆日粮中补充褐藻寡糖（200、500、2 000 mg/kg 和5 000 mg/kg），发现生长差异不显著（P＞0.05）。张艺等[21]的试验也显示，壳寡糖并不能显著影响大菱鲆生长。寡糖增加了肠道上皮与营养分子之间的接触面积，以增强营养物质的吸收，营养物质可用性的改善将使能量有效转移，能够增强非特异性免疫力并促进生长。导致生长差异的因素极多，如鱼体大小、环境等，水环境的pH、溶解氧、氨氮及养殖规模等都是潜在的作用因子。同时寡糖通过增加有益菌，抑制大肠杆菌、乳酸杆菌等埃希式杆菌属的生长，调节肠道微生物状态，促进营养物质的吸收，起到促生长效果[22]。而本实验中褐藻寡糖对暗纹东方鲀的促生长效果不显著，可能是饲料中寡糖水平过低，达不到引起变化的剂量[18]。而褐藻寡糖锌对暗纹东方鲀的生长并无积极作用，其中锌元素对鱼类的作用机制待进一步考究。

2.2 组织营养成分测定

寡糖不被胃肠道消化，可被有益菌利用，调整肠道状态，升高营养物质的利用率。蛋白质、脂肪等含量是评价鱼肉品质的重要指标，肉质食用的体验占据消费者对其评价的主要部分。对照组暗纹东方鲀肌肉粗蛋白含量为19.09%，饲料中添加0.23%褐藻寡糖对暗纹东方鲀肌肉蛋白含量无显著影响（P＞0.05），可提高暗纹东方鲀鱼肌肉中粗蛋白含量。对照组暗纹东方鲀肌肉粗脂肪含量为2.78%，饲料中添加0.23%褐藻寡糖锌对暗纹东方鲀肌肉脂肪含量无显著影响（P＞0.05），均降低暗纹东方鲀鱼肌肉中脂肪含量。蔡胜昌等[23]发现壳寡糖对大菱鲆体成分无明显效果，与本研究结果相似。

表4 生长指标(n=3)

表5 肌肉组织成分（%）

2.3 血清生化指标

研究显示，功能性寡糖具有调节动物血清中生化指标、刺激非特异性免疫的功能[24]。鱼类的血液是反应鱼类代谢状况、营养的重要部分，测定血液中相关免疫酶活性可有效评估鱼类的生理健康状况。超氧化物歧化酶能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，催化过氧阴离子发生歧化反应，可以抗衰老、抗肿瘤、调节人体内分泌系统，提高免疫力[25]。本试验中褐藻寡糖组、褐藻寡糖锌组的超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶活性与对照组相比无显著性差异（P＞0.05）。过氧化物酶具有消除过氧化氢和酚类、胺类、醛类、苯类毒性的双重作用，使毒性物质失活，减少毒害[26]。本实验中褐藻寡糖组、褐藻寡糖锌组的过氧化物酶活性显著低于对照组（P＜0.05）。溶菌酶分解致病菌细胞中多糖类，令细胞壁破裂，细菌细胞溶解，是免疫防御机制的重要部分，具有消炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等作用[27]。本实验中与对照组相比，褐藻寡糖组、褐藻寡糖锌组血清溶菌酶活性分别提高了201.761、51.235 U/mL，且存在显著性差异（P＜0.05），褐藻寡糖在鱼类血清特异性免疫能力方面研究较少。苏鹏[28]在红鳍东方鲀饲料中添加褐藻寡糖（0%、0.05%、0.1%、0.2%）饲养56 d 后，部分试验组血清中LZM、POD、SOD 活性得到显著提高（P＜0.05）。Miandare等[29]研究发现，0.5%，1%和2%低聚半乳糖均显著升高银鲫LZM活性（P＜0.05）。Ji等[30]在幼年中华绒螯蟹饲料中添加不同梯度甘露聚糖（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%），发现与对照组相比，喂食0.1%和0.3%甘露聚糖中华绒螯蟹肠道中的LZM 活性更高。这与本试验结果相似。

2.4 消化酶活性

消化酶可催化分解食物，鱼类消化酶的研究一直是鱼类消化生理的重要研究内容。消化酶活性的提高，可以促进鱼类对营养物质的消化吸收，从而提高鱼的生长发育水平[31]。鱼类肠道消化酶活性对生长至关重要，鱼类消化酶活性高低受多种因素影响，饲料添加剂是影响鱼类消化酶活性的其中因素之一[32-33]。

表6 褐藻寡糖及其锌络合物对暗纹东方鲀血清生化指标的影响

功能性寡糖可提高动物肠道消化酶活性，从而促进营养的消化吸收，进而促进生长。张诗雨等[34]研究表明，在饲料中添加不同含量的壳寡糖可不同程度提高肠道脂肪酶、胰蛋白酶活性及肝胰腺淀粉酶、脂肪酶活性。苏鹏[28]在红鳍东方鲀饲料中添加褐藻寡糖（0%、0.05%、0.1%和0.2%），发现红鳍东方鲀肠道淀粉酶活性无显著影响（P＞0.05），蛋白酶和脂肪酶活性增高，且差异显著（P＜0.05）。本实验发现，饲料中添加0.23%褐藻寡糖、褐藻寡糖锌均可以提高河鲀肠道中的胃蛋白酶和纤维素酶活性，但和对照组相比无差异显著性（P＞0.05）。0.23%褐藻寡糖提高了α-淀粉酶活性，0.23%褐藻寡糖锌降低了α-淀粉酶活性，0.23%褐藻寡糖、褐藻寡糖锌降低了脂肪酶活性，均无显著性差异（P＞0.05）。褐藻寡糖提高肠道消化酶活性可能原因是寡糖被实验鱼摄取后经口腔、胃，再进入肠道调节肠道微生态平衡，推测肠内的有益菌群在良好的微环境中更能发挥分泌淀粉酶的作用，对碳水化合物的利用率提高，从而使起到间接提高消化酶活性的作用[35]。潘金露[36]在大菱鲆饲料中补充褐藻寡糖（0%、0.02%、0.05%、0.20%和0.50%），结果显示蛋白酶和淀粉酶活性变化不显著（P＞0.05），添加量为0.02%和0.05%时，脂肪酶活性变化显著（P＜0.05）。饲料中添加的酶活性变化不显著可能是由于肠道消化酶掺杂胰液和胃液中消化酶成分[37]，而并无研究表明寡糖对胰液和胃液有明显影响。同种鱼中消化酶差异主要受饲料成分、环境干扰[38]。

表7 褐藻寡糖及其锌络合物对暗纹东方鲀肠道消化酶活性的影响

2.5 肠道微生物菌群

肠道菌群的改善和稳定对鱼类生长性能、免疫功能至关重要[39]。高通量技术作为一种新型方法，利用测序，探究菌群的类别及数目[40]，拓宽了测定肠道菌群的方向[41]。

2.5.1 肠道微生物群的多样性和相似性比较

通过样品测序序列计算各样品中细菌多样性指数。Coverage 指数表示样品的测序深度，也表明样品的覆盖率，3 个处理组中的Coverage 指数均在0.99 以上，表明样品中未被检测到的可能性较低。

功能性寡糖可调节肠道功能，丰富肠道乳酸杆菌等有益菌，抑制大肠杆菌等病原菌生长，增加肠道中乳酸菌的数量、种类[22]。通过测序计算样品中丰富度指数（表8），Shannon（Shannon-Wiener index）、Chao1和ACE（Abundance-based Coverage Estimator）是衡量菌落菌种均匀度、丰富度、多样性的常见指标[42]，其中Shannon指数表明群落的丰富度、均匀度，数值越大说明种群多样性越高，ACE 默认将序列量10 以下的OTU定义为稀有并单独计算，从而估计群落中实际存在的物种数。Chao1、ACE 是估计样品所含OTU（Operational Taxonomic Unit）数目的指数，指数越大说明样本物种数越多、丰富度越高。结果显示，对照组中的Chao1和ACE指数高于褐藻寡糖添加组，但差异不显著（P＞0.05）。表明添加褐藻寡糖组、褐藻寡糖锌试验组的肠道细菌多样性高于对照组。

表8 基于16SRNA基因序列的细菌多样性指数

式中：Sobs—观测到的OTU数；

n1—只有1条序列的OTU数目；

n2—只有2条序列的OTU数目。

对照组中与褐藻寡糖、褐藻寡糖锌组中肠道菌群共有2 304 个OTU，对照组占80.21%，添加褐藻寡糖组占77.30%，添加褐藻寡糖锌组占53.91%（见图1）。各组微生物群的相似度高。说明添加褐藻寡糖、褐藻寡糖锌后，没有破坏肠道内原有的土著菌群，实验组检测到的菌群种类单元更多。

图1 肠道微生物群OTU分析

2.5.2 肠道微生物群的组成

菌群组成在Phylum（门）的水平上共鉴定出9 个门，以Proteobacteria（变形杆菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）、Spirochaetota（螺旋体门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）和Actinobacteria（放线菌门）等5 个菌门为主。变形菌门在对照组中相对比例最高，占对照组肠道菌群的25.4%。厚壁菌门的许多成员都是有益菌，其中乳酸杆菌是一种常见于酸奶和其他发酵乳制品中的益生菌[43]，这些微生物产生乙酸盐、乳酸盐和抗菌物质，可防止病原体干扰健康[44]。A 组、B 组、C 组肠道中厚壁菌门相对丰度分别为0.172、0.191、0.225，饲料中添加0.23%褐藻寡糖、0.23%褐藻寡糖可提高肠道中厚壁菌门相对丰度。王发明等[45]在仔猪饲料中加入功能性寡糖，发现肠道中乳酸菌的数量、种类有效增加。放线菌门中的有益菌双歧杆菌是人和动物肠道的重要生理菌群，有助于改善消化能力，提高免疫力。A组、B组、C组肠道中放线菌门相对丰度分别为0.118、0.124、0.095，饲料中添加0.23%褐藻寡糖可提高肠道中放线菌门相对丰度。Wang 等[46]发现果寡糖和大豆寡糖可提高猪源植物乳杆菌的存活率。

图2 肠道微生物门水平上的物种相对丰度柱形图

饲料中添加褐藻寡糖投喂56 d 可提高暗纹东方鲀增重率、特定生长率，说明褐藻寡糖有一定的促生长效果，但不显著（P＞0.05）。相比于对照组，褐藻寡糖组、褐藻寡糖锌组暗纹东方鲀血清溶菌酶活力分别提高了201.761、51.235 U/mL，且存在显著性差异（P＜0.05），褐藻寡糖、褐藻寡糖锌对暗纹东方鲀的免疫能力具有促进作用，提高抵抗病原微生物的功能。饲料中添加褐藻寡糖和褐藻寡糖锌均可以提高暗纹东方鲀肠道中的胃蛋白酶和纤维素酶活性，提高肠道消化能力，褐藻寡糖提高了α-淀粉酶活性，均无差异显著性（P＞0.05）。饲料中添加褐藻寡糖、褐藻寡糖锌可维持暗纹东方鲀肠道菌群，提高细菌多样性。

猜你喜欢暗纹褐藻消化酶浅析暗纹东方鲀的引进及养殖技术渔业致富指南(2022年9期)2022-11-05洞庭青鲫肠道消化酶活力的测定当代水产(2021年9期)2021-12-02三角帆蚌肠道消化酶活力研究当代水产(2021年8期)2021-11-04褐藻中岩藻多糖检测方法的研究食品安全导刊(2021年20期)2021-08-30消化酶制剂治疗消化不良的疗效观察医学前沿(2021年18期)2021-04-14暗纹东方鲀鱼皮胶原蛋白肽脱苦前后苦味物质的变化食品与发酵工业(2021年4期)2021-03-01繁花世界睿士(2020年12期)2020-01-03褐藻酸裂解酶的研究进展中国酿造(2017年3期)2017-04-07褐藻胶提取及制备可食性膜工艺研究广东石油化工学院学报(2016年3期)2016-05-17响应面法优化海洋弧菌产褐藻胶裂解酶发酵培养基中国酿造(2016年12期)2016-03-01