PPARδ激动剂GW501516对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响
时间：2023-04-15 21:15:02 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
李 咏，刘 立(武汉市第四医院药学部，武汉 430033；
通讯作者，E-mail:914057996@qq.com)
脑血管病是一种严重危害人类健康的常见病和多发病，其致残率和致死率均较高，其中缺血性脑血管病的发病率约占脑血管病的75%[1]。脑缺血后再灌注可进一步促进氧化应激和炎症所致的损伤，导致神经元继发性损伤，再灌注所引发的脑损伤即为脑缺血再灌注(ischemic stroke/reperfusion，I/R)损伤，其所致的脑损伤不可忽视，但其具体发病机制尚未完全阐明。自噬(autophagy)是真核细胞中一种重要的分解代谢途径，主要用于清除受损的细胞器和错误折叠的蛋白质。然而，自噬是一把双刃剑，适时上调细胞自噬水平具有神经细胞保护作用，而过度的及低水平的细胞自噬导致细胞死亡[2]。目前，自噬在脑I/R损伤中的作用众说纷纭，可能与复杂的病理环境、再灌注时间和治疗干预方式等有关系。
腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是在自噬过程中细胞能量感知和细胞信号调控的一个重要的激酶，可以感受ATP的变化，并通过mTOR、p53、PI3K等3条途径来调控细胞自噬，从而降解胞内物质产生能量[3]。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)是一类由配体激活的核转录因子，属于Ⅱ型核受体超家族成员，包含α、δ(或β)、γ等3个亚基。PPARs通过DNA结合域结合，激活靶基因的转录，PPARs活化后在调节脂质代谢、维持体内葡萄糖稳态、参与细胞增殖及分化、调控炎症和氧化应激等过程中发挥重要作用[4，5]。目前，PPARα和β研究的比较多，功能比较明确，而PPARδ研究的比较少。已有研究[6，7]显示，PPARδ可激活AMPK活性调控炎症反应、胰岛素抵抗、骨再生、肿瘤生长、细胞自噬等众多生理病理过程。然而，PPARδ在脑I/R损伤中的作用尚不清楚。为此，本研究通过建立大鼠脑I/R损伤模型，探讨GW501516激动PPARδ对大鼠脑I/R损伤的作用及其机制，为缺血性脑损伤的临床治疗以及新药的开发提供理论依据。
1.1 实验动物
48只SPF级SD大鼠，雄性，鼠龄8周，体质量210～230 g，购自湖北省医学实验动物中心，动物许可证号SCXK(鄂)2020-0018。大鼠被安置在无病原体环境条件下，环境温度为(24±2)℃，相对湿度为55%～60%，光照/黑暗周期为12 h，大鼠可自由食用水和鼠粮。动物实验方案均符合《实验动物管理条例》相关标准，并获得湖北省疾病预防控制中心动物委员会的批准【安评中心动(福)第202220224号】。
1.2 主要试剂与仪器
PPARδ激动剂GW501516(纯度≥98%)和AMPK抑制剂Dorsomorphin(纯度≥98%)均购自美国MCE公司；
兔抗PPARδ、兔抗AMPKα、兔抗p-AMPKα(Thr172)、兔抗Beclin-1、兔抗LC3、兔抗GAPDH和HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体均购自美国CST公司；
兔抗LC3Ⅱ购自美国PTG公司；
CoraLite488标记山羊抗兔IgG(H+L)购自武汉三鹰生物技术有限公司；
TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自瑞士Roche公司；
BCA蛋白质浓度测定试剂盒和ECL化学发光试剂盒均购自美国Aspen公司；
IX51型倒置白光/荧光拍照显微镜购自日本Olympus公司；
RM2016型切片机购自上海徕卡仪器有限公司；
AX-Ⅱ型暗匣购自广东粤华医疗器械厂有限公司；
LiDE110型扫描仪购自日本Canon公司。
1.3 动物模型制备与分组
将48只SD大鼠按随机数字法分成：sham组、model组、GW组和GW+Dor组，每组12只。除sham组外，其余各组大鼠均采用双侧颈总动脉夹闭合并低血压法建立脑I/R损伤模型[8]：采用4%水合氯醛(1 ml/100 g)麻醉大鼠后，切口前皮下注射5 mg/kg卡洛芬用于镇痛作用，取颈正中切口2 cm并向右延伸1 cm，分离右侧颈总静脉和双侧颈总动脉，结扎右侧颈总静脉远心端，夹闭近心端后剪“V”型切口，插管入右心房，输入肝素2 ml(25 U/ml)抗凝，抽取总血容量30%的血液，夹闭双侧颈总动脉，缺血20 min后去除双侧动脉夹并将血液回输，结扎右侧颈总静脉，缝合切口。除不夹闭左右颈总动脉和抽取血液外，sham组大鼠手术步骤同model组。参照文献[9]方法于造模前30 mim，GW组大鼠经侧脑室注射0.05 mg/kg GW501516，GW+Dor组大鼠经侧脑室注射0.05 mg/kg GW501516+0.25 mg/kg Dorsomorphin，注射体积为5 μl，而sham组和model组大鼠经侧脑室注射等量媒介。I/R 24 h后对大鼠进行神经功能评分，然后处死大鼠并取脑缺血半暗带区组织进行检测。
1.4 Zea-Longa评分法评估各组大鼠神经功能损伤情况
采用Zea-Longa评分法[10]对各组大鼠进行神经功能缺损评估。0分：正常行走(无神经功能缺损)；
1分：提尾时左前爪不能完全伸直(轻度神经功能缺损)；
2分：行走时不能直行，向左侧绕圈(中度神经功能缺损)；
3分：行走时向左侧倾倒(重度神经功能缺损)；
4分：不能自主行走或失去意识。评分越高说明大鼠神经功能损伤越严重。
1.5 HE染色观察各组大鼠脑缺血半暗带区病理学变化
将大鼠脑缺血半暗带区组织用4%多聚甲醛固定，脱水包埋，使用切片机切成2～3 μm的薄片，脱蜡至水，进行苏木精-伊红染色，中性树胶封片后置于显微镜下观察大鼠脑缺血半暗带区病理学变化。
1.6 TUNEL染色检测大鼠脑缺血半暗带区细胞凋亡情况
脑缺血半暗带区组织切片(同HE染色)脱蜡至水，加入蛋白酶K工作液，37 ℃水浴锅中孵育30 min，再加入破膜液，室温孵育10 min，然后加入TUNEL孵育液，37 ℃避光孵育1 h，最后加入DAPI染核，室温避光孵育30 min，抗荧光淬灭封片剂封片后置于显微镜下观察拍照。凋亡细胞呈绿色，DAPI染色细胞核呈蓝色，每张切片随机选取5个视野统计凋亡细胞所占百分比，计算其平均值。
1.7 免疫荧光观察各组大鼠脑缺血半暗带区LC3Ⅱ阳性表达情况
脑缺血半暗带区组织切片(同HE染色)放置柠檬酸钠抗原修复液中微波炉加热10 min，待冷却后用PBS洗涤3次，每次5 min，然后用山羊血清封闭切片15 min，4 ℃下与LC3Ⅱ一抗(1 ∶200)孵育过夜，次日，在切片中加入CoraLite488标记的山羊抗兔IgG(1 ∶100)，室温避光孵育1 h，然后加入PI溶液进行核复染，封片后置于荧光显微镜下观察染色情况。LC3Ⅱ阳性细胞呈绿色，PI染色细胞核呈橙红色。每张切片随机选取5个视野统计LC3Ⅱ阳性细胞所占百分比，计算其平均值。
1.8 Western blot检测各组大鼠脑缺血半暗带区PPARδ、AMPKα、p-AMPKα、Beclin-1和LC3等蛋白表达水平
使用RIPA裂解液提取大鼠脑缺血半暗带区组织中的总蛋白，BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定提取物的蛋白浓度，采用10% SDS-PAGE电泳分离蛋白并转移到PVDF膜上，将膜浸泡在5%脱脂奶粉中，室温下封闭1 h，分别加入以下一抗：PPARδ(1 ∶1 000)、AMPKα(1 ∶1 000)、p-AMPKα(1 ∶1 000)、Beclin-1(1 ∶1 000)、LC3(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶2 000)，4 ℃孵育过夜，然后加入HRP标记山羊抗兔IgG二抗(1 ∶10 000)，室温孵育1 h，最后采用ECL试剂盒检测蛋白条带，暗匣中显影后将胶片进行扫描存档，并用AlphaEaseFC软件分析光密度值。蛋白相对表达水平=目的蛋白光密度值/GAPDH光密度值。
1.9 统计学处理
2.1 GW501516对脑I/R损伤大鼠神经功能的影响
sham组大鼠神经功能无损伤，而model组大鼠神经功能损伤严重。与model组比较，GW组大鼠神经功能评分显著降低(P<0.05)；
与GW比较，GW+Dor组大鼠神经功能评分显著升高(P<0.05，见图1)。
与sham组比较，*P<0.05；
与model组比较，#P<0.05；
与GW组比较，△P<0.05图1 各组大鼠神经功能评分Figure 1 Neurological function score of rats in each group
2.2 GW501516对脑I/R损伤大鼠脑缺血半暗带区病理学变化的影响
sham组大鼠脑缺血半暗带区细胞结构完整，无炎性细胞浸润；
model组和GW+Dor组细胞核固缩，神经元结构严重受损，胞质分布不均匀，形成空泡，
并出现凝集，其中model组最为严重；
GW组大部分脑结构恢复正常，绝大部分神经元出现整合，空泡明显减少(见图2)。
蓝色为细胞核，红色为细胞质图2 脑缺血半暗带区HE染色 (×400)Figure 2 HE staining of cerebral ischemic penumbra (×400)
2.3 GW501516对脑I/R损伤大鼠脑缺血半暗带区细胞凋亡的影响
与sham组比较，model组大鼠脑缺血半暗带区细胞凋亡水平显著升高(P<0.05)；
与model组比较，GW组大鼠细胞凋亡水平显著降低(P<0.05)；
与GW比较，GW+Dor组大鼠细胞凋亡水平显著升高(P<0.05，见图3)。
图3 各组大鼠脑缺血半暗带区细胞凋亡率 (×200)Figure 3 Apoptosis rates of cerebral ischemic penumbra in each group (×200)
2.4 GW501516对脑I/R损伤大鼠脑缺血半暗带区LC3Ⅱ阳性表达的影响
与sham组比较，model组大鼠脑缺血半暗带区LC3Ⅱ阳性细胞数量明显升高(P<0.05)；
与model组比较，GW组大鼠LC3Ⅱ阳性细胞数量明显升高(P<0.05)。与GW比较，GW+Dor组大鼠LC3Ⅱ阳性细胞数量明显降低(P<0.05，见图4)。
图4 各组大鼠脑缺血半暗带区LC3Ⅱ阳性细胞数量 (×200)Figure 4 Numbers of LC3Ⅱ positive cells in cerebral ischemic penumbra of rats in each group (×200)
2.5 GW501516对I/R损伤大鼠脑缺血半暗带区PPARδ、AMPKα、p-AMPKα、Beclin-1和LC3等蛋白表达水平的影响
与sham组比较，model组大鼠脑缺血半暗带区Beclin-1蛋白及p-AMPKα/AMPKα、LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白比值水平均显著升高(P<0.05)，而PPARδ蛋白表达水平显著降低(P<0.05，见图5)。与model组比较，GW组大鼠PPARδ、Beclin-1蛋白及p-AMPKα/AMPKα、LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白比值水平均显著升高(P<0.05，见图5)。与GW比较，GW+Dor组大鼠Beclin-1蛋白及p-AMPKα/AMPKα、LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白比值水平均显著降低(P<0.05)，而PPARδ蛋白表达水平无明显变化(P>0.05，见图5)。
与sham组比较，*P<0.05；
与model组比较，#P<0.05；
与GW组比较，△P<0.05图5 各组大鼠脑缺血半暗带区PPARδ、AMPKα、p-AMPKα、Beclin-1和LC3蛋白表达水平Figure 5 Protein expression levels of PPARδ， AMPKα， P-AMPKα， Beclin-1 and LC3 in cerebral ischemic penumbra of rats in each group
脑缺血是一种常见的脑血管疾病，严重危害人类健康。目前临床上治疗缺血性脑血管病中最有效的方法是通过溶栓尽早恢复供血，但溶栓后再灌注会导致一系列病理过程，包括氧化应激、细胞凋亡和炎症反应的激活，进一步加重脑组织损伤，即脑I/R损伤[11]。I/R损伤以多种类型的细胞死亡为特征，如自噬、凋亡等。由于脑I/R损伤的病理生理机制的复杂性，其临床治疗具有一定的局限性。因此，深入研究脑I/R损伤的具体机制可为治疗缺血性脑血管病提供重要的理论依据。
自噬是真核细胞中高度保守的分解代谢过程，是生物医学研究的热点之一。当受损细胞器数量增加、外部病原体入侵或发生蛋白质异常堆积时，细胞内容物被囊泡膜结构包裹形成自噬小体，自噬小体进一步与溶酶体结合，将细胞内容物降解为小分子物质[12]。Beclin-1和LC3是自噬的典型生物标志物。Beclin-1是Beclin-1/PI3K-Ⅲ复合物的核心成分，参与自噬激活[13]。在自噬过程中，LC3I被转化为LC3Ⅱ，因此，LC3 Ⅱ/Ⅰ表示自噬的程度[14]。众多研究[15-17]显示，脑I/R损伤与自噬密切相关，自噬在脑I/R损伤中有促生存或促死亡的潜能，被认为是一把双刃剑。本研究建立大鼠脑I/R损伤模型，结果显示，model组大鼠神经元空泡化，神经功能评分、细胞凋亡率、LC3Ⅱ阳性细胞数量及Beclin-1蛋白和LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白比值水平均显著升高，说明model组大鼠脑I/R损伤严重，且自噬水平升高，可能原因是在正常状态下，细胞中自噬水平较低，但在脑I/R损伤的应激条件下，大鼠脑缺血半暗带区细胞自噬被激活。
PPARs是一种核受体转录因子，主要存在于人体肝脏、肾脏、褐色脂肪组织中。PPARs包含了α、δ(或β)、γ等3个亚基，其中关于PPARδ的研究最少。PPARδ在脑I/R损伤的作用目前未见报道。本研究结果显示，PPARδ激动剂GW501516干预后，PPARδ蛋白表达水平和自噬水平均明显升高，且大鼠脑I/R损伤明显减轻。Zhang等[18]研究发现，黄芪甲苷治疗通过促进自噬对大鼠脑I/R损伤产生神经保护作用。lncRNA SNHG12诱导的自噬激活可以缓解小鼠脑I/R损伤，而自噬抑制剂3-MA可以部分逆转这一损伤[19]。这些研究揭示了自噬在脑I/R损伤后具有神经保护作用。本研究结果说明GW501516可激活自噬，从而减轻大鼠脑I/R损伤。
AMPK是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其由AMPKα(催化亚基)和AMPKβ/AMPKγ(调节亚基)组成。AMPK信号通路是调控自噬的关键通路。AMPK作为代谢和能量调节因子，被证实为自噬的启动子[20]，同时，AMPK介导的自噬激活是缺血性脑卒的一种保护机制[21]。本研究结果显示，model组大鼠p-AMPKα/AMPKα水平和自噬水平均显著升高，说明在脑I/R损伤的应激条件下，AMPKα磷酸化被激活，其可作为应激信号，激活大鼠脑缺血半暗带区细胞自噬[22]。GW501516干预后，PPARδ蛋白表达水平、AMPKα磷酸化水平和自噬水平均明显升高，且大鼠脑I/R损伤明显减轻。PPARδ与AMPK相互作用可调节糖代谢、血管内皮功能障碍、胰岛素抵抗和炎症。有研究[23]发现，PPARδ激动剂GW501516可通过激活AMPK信号通路预防骨骼肌细胞炎症和胰岛素抵抗。此外，GW501516可通过激活AMPK信号通路介导的自噬减轻肥胖小鼠肝脏脂肪变性[24]。本研究结果说明GW501516减轻大鼠脑I/R损伤可能与激活AMPK介导的自噬有关。为了进一步验证GW501516调控细胞自噬的分子机制，采用AMPK抑制剂Dorsomorphin干预后，AMPK信号通路被抑制，自噬水平降低，同时GW501516对大鼠脑I/R损伤的改善作用被抑制，Dorsomorphin的作用靶点是AMPK，而PPARδ作为AMPK的上游调控蛋白，其表达水平不变，说明GW501516改善大鼠脑I/R损伤与激活AMPK信号通路介导的细胞自噬有关。
综上所述，PPARδ激动剂GW501516干预可通过激活AMPK信号通路介导的细胞自噬改善大鼠脑I/R损伤。因此，GW501516激动PPARδ可能是一种有效的缺血性脑血管疾病治疗干预措施。然而，本研究也有一些局限性。首先，需要确定GW501516是否还可以通过其他相关信号通路调控细胞自噬。其次，GW501516是否能通过兴奋毒性、氧化应激或神经元炎症等机制减轻脑I/R损伤有待进一步研究。
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