南京地区簸箕柳雌、雄花序建成动态观察

向 丽，尹佟明，陈赢男

(南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室，南京林业大学林学院，南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037)

花是被子植物的繁殖器官，在传粉、授精和结实等过程及植物生活史中发挥着关键作用[1-2]，影响植物在自然界中的生存能力以及经济应用价值。植物开花需从营养生长阶段向生殖生长阶段跨越，启动营养芽原基向花芽原基的分化，称之为花芽分化过程[3]。对拟南芥(Arabiodopsisthaliana)等植物花发育的分子调控研究揭示，植物由营养生长向生殖生长的转变主要由6种途径(自主、赤霉素、年龄、光周期、温度、春化)调控，它们相互形成一个复杂多变的调控网络[3]。花原基形成后，花器官的不同部分按不同的时序开始发育，完成花器官的发育过程。林木花芽分化过程是每年新稍处顶端分生组织中分化出叶及腋芽的生长点后，再转变分化出花器官，分为生理分化和形态分化两种过程[4]。有研究表明植物花芽发育过程中，花芽的外部形态和内部解剖结构两者之间存在一定的相关性[5-8]。韩明慧等[9]对薄壳山核桃(Caryaillinoensis)雌、雄花芽分化外部形态与内部结构的关系进行研究，发现花芽外部形态与内部结构有一定的对应关系，能从花芽外部形态的特征进一步判断其内部细胞的发育动态。洑香香等[10]对青钱柳(Cyclocaryapaliurus)雌、雄花芽分化进程的形态解剖特征进行研究，为培育优质的青钱柳(如人工授粉)提供可靠的理论基础，同时也能为相关研究确定适时采样时间提供依据。宋兴舜等[11]根据白桦(Betulaplatyphylla)雌花发育的内外部形态相关性来判断雌花发育过程，为开展花、雌蕊和胚胎发育分子机理研究的适时取样提供了参考依据。

杨柳科植物不仅是重要的能源和工业原料树种，也是重要的城市和园林绿化树种。杨柳科植物多为葇荑花序，雌雄异株，其雌株在达到性成熟后会产生大量飞絮，持续期长达1～2个月，飞絮问题已成为限制杨柳产业发展和绿化种植的瓶颈。解析控制杨柳花芽分化和发育的分子机制是解决飞絮问题的关键，而对其花芽分化的全过程进行详细研究，是开展花芽分化和发育分子机制研究的前提和基础。目前利用石蜡切片技术，已有多种杨柳科树种花器官的分化和发育过程研究被相继报道，包括毛果杨(Populustrichocarpa)[12]、香脂杨(P.balsamifera)[13]、美洲黑杨(P.deltoides)[14]、蒿柳(Salixviminalis)[15]以及旱柳(S.matsudana)[16]，不同杨柳科树种花芽分化的起始时间差异不大，基本都在6月。彭向永[15]通过对蒿柳不同阶段芽进行形态组织学观察，明确了蒿柳雌株和雄株1年生枝条均于6月初进入花芽生理分化期；
张明照[16]观察了旱柳雌、雄花芽外部形态和解剖结构变化过程的特征，发现雄花芽外形稍大于雌花芽，雌、雄花的花序原基在6月下旬已完全形成且出现小花原基突起。

柳树广泛分布于南北半球的温带地区，除澳洲和南极洲之外，各大洲都有天然分布。在我国除青藏高原个别地区外，柳树几乎遍布全国。柳树多样性丰富，适应性强，树形优美。簸箕柳(S.suchowensis)是第1个完成全基因组测序的柳属树种[17]，同时也已完成高密度遗传图谱的构建[18]。簸箕柳个体较小，幼年期相对较短，是研究柳树花芽分化和花序建成的理想材料。本研究以簸箕柳为研究对象，利用石蜡切片技术系统观察了其雌、雄花芽分化和花序建成的完成过程，以期找出簸箕柳雌、雄花芽分化以及雌蕊和雄蕊发育的关键时期，为后续性别分化分子机制研究提供花序发育的关键信息。

1.1 试验材料

以栽植于江苏省南京市南京林业大学白马实验基地的簸箕柳雌株和雄株无性系为材料，树高3～4 m，花芽着生于枝条中上部。选取立地条件一致，生长健壮且无病虫害的簸箕柳雌株和雄株各10株，于2020年6月16日(样品编号T1)至2021年2月16日(样品编号T17)，每月1日和16日各采集1次雌、雄花芽或花序，共计17次(样品依次编号为T1—T17)。

1.2 试验方法

观察各阶段簸箕柳雌、雄花芽或花序的外观特征，并利用游标卡尺测量花芽或花序长度，每个时期15个重复，将数据录入Excel表格中，对不同时期雌、雄花序的长度差异进行单因素方差分析，以P<0.05作为显著性差异的标准[19]。

用石蜡切片技术进行簸箕柳雌雄花芽分化的细胞学动态观察。不同时期的雌、雄花芽或花序分别放入含3%(体积分数，下同)巯基乙醇的FAA固定液[70%酒精 90 mL，冰醋酸、38%甲醛和丙三醇各 5 mL]中进行固定，用注射器进行抽真空处理，固定48 h后，置于4 ℃冰箱进行长期保存。石蜡切片的制作参考付盼等[20]的方法，先将花芽或花序进行乙醇脱水、浸蜡包埋、切片烘片、脱蜡复水处理，后用番红固绿双重染色，乙醇脱色、二甲苯梯度透明处理、封片烘干。用ZEISS Axio Imager 2型光学显微镜对切片进行观察和拍照记录。

2.1 簸箕柳雌、雄花序外观形态变化与生长节律特征

雌、雄花序鳞片颜色变化整个过程见图1A。江苏省南京地区，每年6月中旬在簸箕柳枝条中上部可以看到鳞片包裹的花芽，此时簸箕柳营养生长旺盛、枝叶繁茂，花芽和叶芽均着生于叶腋处，大小相近、外观上难以区分，须用解剖刀切开进行辨别；
7月初雌、雄花芽开始膨大，此后营养芽和花芽较易于分辨。6月中旬雌花序小而瘪、外披嫩绿色鳞片，7月中旬至8月逐渐伸长膨大，9—10月中旬趋于饱满，花序鳞片颜色变成黄绿色，11月中旬至12月初，鳞片变为黄褐色，休眠期花序鳞片呈褐色，质地保持软而滑(图1 T2—T14)。第2年2月中旬，随着气温逐渐升高，花序体积迅速变大，挣脱鳞片(图1 T17)。雄花序比雌花序长而大，6—10月雄花序鳞片颜色与雌花序相近，到12月随气温下降，鳞片逐渐呈现淡红色，休眠期变成褐色。次年2月中旬，花序快速伸长，葇荑花序逐渐露出。

图1 簸箕柳不同发育时期的雌、雄花序形态变化Fig.1 The morphological changes of male and female inflorescence at different developmental stages for Salix suchowensis

对不同时期雌、雄花序长度进行测量，结果显示：雌、雄花序生长趋势都呈现“S”形。花序在6月中旬至10月中旬(T1—T8)生长速度较快；
在10月底至次年2月初期(T9—T16)，随气温降低，生长速度逐渐变慢，直至进入休眠期；
次年2月中旬(T17)，花序逐渐打破休眠，长度增长迅速，芽鳞出现较大幅度的松动，进入开花期(图2)。结合图1可知，在簸箕柳雌、雄花序生长发育的整个过程中，其外部形态的变化主要体现在芽鳞颜色和花序长度上。

*.P<0.05,**.P<0.01.图2 雌、雄花序长度参数变化Fig.2 The length change of female and male inflorescence of S. suchowensis

根据对簸箕柳雌、雄花序建成的动态观察，可以将簸箕柳在1年内的生长周期划分为5个阶段(图3)，即营养生长期(5月中旬至6月中旬)、花序原基分化与小花发育期(6月中旬至10月)、休眠期(11月至次年1月)、开花期(2—3月)、结实期(4月至5月中旬)。

图3 簸箕柳年生长节律Fig.3 Annual growth rhythm of Salix suchowensis

2.2 簸箕柳雌、雄花序内部解剖结构

簸箕柳雌花序中每朵小花有1枚雌蕊，柱头2裂；
雄花序中每朵小花有2枚雄蕊、4枚花药。通过观察花序内部解剖特征，发现雌、雄花序的分化均呈现由下而上向顶式分化，即花序不同部位小花的发育进程是按基部到顶部的顺序依次进行的。簸箕柳花发育过程大致可分为5个阶段：花序建成初期、小花原基分化期、雌/雄蕊分化期、休眠期、大/小孢子发生及雌/雄配子体发育期(表1)。

表1 簸箕柳雌、雄花不同发育阶段Table 1 Developmental stages of male and female flowers of Salix suchowensis

1)雌花序发育的动态解剖特征。

花序建成初期(Stage Ⅰ)。6月中旬至7月初，花序开始快速分化，长苞片腋部细胞密集，小花原基开始出现雏形，苞片持续生长(图4 T1、T2)。

小花原基分化期(Stage Ⅱ)及雌蕊分化期(Stage Ⅲ)。7月中旬至8月初，伴随着苞片不断伸长，小花原基不断增大，顶部开始出现轻微凹陷，形成雌蕊原基(图4 T3、T4)。8—10月，雌蕊原基不断发育分化，原基上部快速向内分两叉凹陷并发育形成两心皮，原基基部膨大，逐渐发育成圆锥形子房；
胚珠逐渐凸起、分化，侧膜胎座；
胚珠基部分化出珠被，珠被不断发育直至将胚珠完全包裹在内，同时两心皮不断伸长，形成2裂柱头雏形(图4 T5—T10)。

休眠期 (Stage Ⅳ)、大孢子发生及雌配子体发育期(Stage Ⅴ)。随着气温下降，花芽分化逐渐停滞(图4 T16)，植株进入冬季休眠期。第2年春季，气温逐渐回升，花芽打破休眠，子房继续发育不断增大，在这一时期孢原细胞经平周分裂和减数分裂形成大孢子，大孢子进一步分化形成胚囊，子房一侧有一个较长腺体(图4 T17)。此后，雌花进入开花期。

2)雄花序发育的动态解剖特征。

花序建成初期(Stage Ⅰ)。苞片形成，雄花序快速分化，小花原基逐渐呈穹窿形凸起(图5 T1、T2)。这一阶段雄花芽与雌花芽的解剖结构较为相似，尚难以区分。

小花原基分化期(Stage Ⅱ)及雄蕊分化期(Stage Ⅲ)。苞片继续伸长，苞片叶腋内细胞密集分化，小花原基进一步分化膨大，形成雄蕊原基(图5 T5)。8月中旬，雄蕊原基开始分化；
9—10月，雄蕊原基出现具有高度分裂能力的薄壁细胞(图5 T7)，4个角隅处细胞分裂后，形成四棱形的花药雏体，花药原始体不断分裂发育(图5 T8—T9)，至11月初，开始分裂出具有4个小花粉囊的蝶形花药及中央形成药隔(图5 T10)。每一个花粉囊室里的孢原细胞经多次平周分裂形成药室内壁及花粉母细胞。

休眠期(Stage Ⅳ)、小孢子发生及雄配子体发育期(Stage Ⅴ)。11月中旬后，随着温度降低，雄蕊发育变慢直至停滞(图5 T11—T16)。第2年春季，雄花序打破休眠，小孢子母细胞继续分化，迅速增大，分裂形成大量小孢子即花粉粒 (图5 T17)，花粉囊壁分层明显，大量圆而饱满的花粉粒在每个药室内松散密布，从该时期可看出一条花丝上有两枚花药，花丝侧边腺体较大(图5 T17)。随后3月，雄花进入开花期。在花粉粒成熟后，纤维层细胞失水过程中的机械力，使得花药裂开，花粉粒从裂缝处散出，从而利于雌株的传粉。

T1—T2.纵切面，花序分化，花序轴形成，出现小花原基longitudinal section,inflorescence primordium differentiation,inflorescence axis formation,floret primordium appearance；
T3.纵切面，小花原基分化发育，雌蕊原基形成longitudinal section,floret primordium differentiation and development,pistil primordium formation；
T4—T8.纵切面，雌蕊原基上部向内分两叉凹陷，子房膨大开始发育，形成多个胚珠原基longitudinal section,that the upper part of the pistil primordium is bifurcated inwardly,and the ovary expands and develops,forming multiple ovule primordia；
T9—T10.纵切面，子房逐渐膨大，胚珠渐渐成熟longitudinal section,that the ovary gradually expands,and the ovule gradually matures；
T12、T16.纵切面，雌蕊分化缓慢，进入休眠期longitudinal section,that the pistil differentiates slowly and enters the dormant period；
T17.纵切面，花序打破休眠，雌蕊继续快速分化，胚珠成熟形成胚囊longitudinal section,that the flower bud breaks dormancy,the pistil continues to differentiate rapidly,and the ovule matures to form an embryo sac.Br.小苞片 bracteoles；
Fp.小花原基 floret primordium；
Pp.雌蕊原基 pistil primordium；
Ov.子房 ovary；
Olp.胚珠原基 ovule primordium；
Ol.胚珠 ovule；
Sty.花柱 style；
Ovw.子房壁 ovary wall；
Gl.腺体 gland.图4 簸箕柳雌花发育过程的解剖结构观察Fig.4 Anatomical observation of pistillate flower development in S. suchowensis

T1—T2.纵切面，花序分化，花序轴形成，出现小花原基 longitudinal section,inflorescence primordium differentiation,inflorescence axis formation,floret primordium appearance；
T3—T4.纵切面，小花原基不断分化发育并增大，形成雄蕊原基longitudinal section,floret primordium continuously differentiated and enlarged,forming stamen primordium；
T5—T10.纵切面，雄蕊原基增大发育，分化出花药原始体，分裂形成4个角隅小花粉囊的花药longitudinal section,the stamen primordium enlarges and develops,differentiates into anther primitives,and splits to form anthers of four corner small pollen sacs；
T11—T16.纵切面，雄蕊发育缓慢，进入休眠期，小孢子紧密排列在花粉囊longitudinal section that the stamens develop slowly and enter the dormant period,and the microspores are tightly arranged in the pollen sac；
T17.纵切面，雄蕊饱满圆润的花粉粒松散密布花粉囊内longitudinal section,that the stamens are full and round pollen grains are loose and densely packed in the pollen sac.Sp.雄蕊原基 stamen primordium；
St.雄蕊 stamen；
Anp.花药原基 anther primordia；
Pos.花粉囊 pollen sac；
Pog.花粉粒 pollen grain；
Fi.花丝 filament；
Gl.腺体gland；
En.药室内壁 endothecium.图5 簸箕柳雄花发育过程的解剖结构观察Fig.5 Anatomical observation of staminate flower development in S. suchowensis

2.3 簸箕柳花序发育的外部形态与内部解剖结构的对应关系

进一步对簸箕柳雌、雄花序外部形态与内部解剖结构的动态特征进行比较分析发现，不同时期花序形态学变化与解剖结构表现出一定的对应关系(表2)，可以根据易于观察的形态学特征推测花序内部结构的发育阶段。

表2 不同时期簸箕柳雌、雄花序外部形态变化和内部解剖结构的比较Table 2 Comparison between morphological and anatomical characters of inflorescence of Salix suchowensis

植物花芽分化是其生命周期中一个重要的发育转变，是植物成功繁殖的关键。花发育过程涉及植物细胞的分化、器官发育、基因表达调控等方面，也会受到遗传因素和环境因子的影响[21]。花的发育过程包含开花转换和花器官的发育，其中开花转换是从营养生长向生殖生长转变，营养芽转变成花芽；
花器官的发育是花芽的分化发育。据花发育特点可分为3个阶段：成花诱导、花的发端、花器官发育至成熟阶段[22-24]。尽管杨树被广泛用作木本植物遗传研究的模式树种，但其童期较长，通常需要7～10 a才会开花[25]。而簸箕柳实生苗通常1 a就能开花，是研究柳树花发育的理想材料。彭向永[15]对雌、雄蒿柳生长发育物候期进行了研究，提出蒿柳1年生枝条的3个时期生长动态：①营养生长期，5月上旬枝条上着生少量芽和叶片，未出现花芽；
②花芽生理分化期，枝条上着生大量的芽和叶片，未出现花芽；
③花芽形态分化期，6月初，枝条上出现肉眼可见花芽。本研究于6月中旬开始采集雌、雄簸箕柳花芽，发现该时期花芽内部解剖结构花序开始分化，即为花器官分化阶段，可以推测其成花诱导和花的发端阶段在6月之前就已完成。虽然T1时期的雌、雄花芽和营养芽在外形上相似，但该时期已经处于花芽形态分化期。与雌雄同株植物的完全花(花柄、花托、花萼、花冠、雄蕊群和雌蕊群)不同，杨柳科植物是雌雄异株的典型代表，葇荑花序，其小花是仅由雌蕊或雄蕊、苞片和腺体组成的单性花，杨柳科植物小花花器官的高度退化，有利于传粉和受精[26]。

系统深入观察植物花芽分化进程不仅是揭示花发育分子机理的重要前提和基础，还可以为开展植物遗传育种研究和制定栽培管理措施的选择提供基础资料。目前在组织水平上研究植物花芽分化过程，主要是通过石蜡切片技术观察内部解剖结构的变化。林树燕等[27]利用石蜡切片技术研究‘霞早’绿竹(Bambusaoldhami‘Xia Zao’ ZSX) 的花药发育过程，揭示了花粉发育异常是该品种不结实的主要原因。王星等[28]利用该技术明确了黄条金刚竹(Sasaellakogasensis‘Aureostriatus’)花序建成以及雌雄配子体发育过程，为后续研究竹类植物花发育分子机理奠定了基础。陈斌等[29]采用石蜡切片方法研究了绵枣儿(Barnardiajaponica)花芽分化各时期的解剖结构，为绵枣儿新品种选育和园林栽培应用提供了理论依据。胡雨逸等[30]用石蜡切片技术对绦柳(S.matsudanaf．pendula)雌株花芽前期分化过程进行了研究，结果显示绦柳雌花芽5月底开始分化，6月初至7月初完成分化，为抑制绦柳花芽分化、控制飞絮提供了科学依据。

本研究利用石蜡切片技术观察了簸箕柳雌、雄花芽分化和花序建成过程的解剖结构特征，将簸箕柳花发育进程分为5个阶段：花序建成初期、小花原基分化期、雌/雄蕊分化期、休眠期、大/小孢子发生及雌/雄配子体发育期。结合簸箕柳年生长发育节律发现，在南京地区簸箕柳6月中旬形成肉眼可见的花芽，6月中旬至7月初花序已分化，7月中旬至8月下旬小花原基分化期，9月上旬至11月初雌/雄蕊分化期，11月中旬至翌年2月初花序进入休眠期，翌年2月中旬至3月完成大/小孢子发生及雌/雄配子发育期，随后雌雄花序开放，4—5月为果实期。簸箕柳花序生长趋势总体呈“S”形上升趋势，且花序外部形态与内部解剖结构变化具有一定相关性，通过观察外部形态特征可以推测花序发育的关键时期。通过对簸箕柳花原基的分化和花器官形成过程的研究，为准确判断其花序发育关键时期、研究柳树花发育的分子调控机理奠定了重要基础。

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