鸡PPARγ基因转录本5的两个上游开放阅读框功能分析

王 宁 ，娄钰琦 ，褚衍凯 ，黄佳新 ，徐海冬 ，罗昊玉 ，娄 明 ，牟 芳

（1.农业农村部鸡遗传育种重点实验室，哈尔滨 150030；
2.黑龙江省普通高等学校动物遗传育种与繁殖重点实验室，哈尔滨 150030；
3.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030）

过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）是配体激活型转录因子，被配体激活后，PPARγ 与RXRα结合形成异二聚体，特异性结合于靶基因调控区PPAR 反应元件，调控靶基因转录[1]。PPARγ是脂肪生成的重要调控因子，对维持正常胰岛素敏感性及葡萄糖、脂质稳态至关重要[2]。此外，PPARγ 与肥胖症、Ⅱ型糖尿病等代谢性疾病发生发展关系密切[3]。

真核生物基因5"非翻译区（5" untranslated region，5"UTR）在基因转录后调控中发挥重要作用，调控mRNA 稳定性、运输、定位及翻译效率等[4-5]。5"UTR 调控作用依赖于其所包含的顺式调控元件，目前已鉴定出的5"UTR顺式调控元件包括RNA G-四链体（G-quadruplexes，RG4）、内部核糖体进入位点（Internal ribosomal entry sites，IRES）、上游起始密码子（Upstream start codons，uAUG）及上游开放阅读框（Upstream open reading frames，uORF）等[6]。PPARγ基因受多个启动子调控，例如人和小鼠PPARγ基因分别存在4个和2个启动子[7-8]。由于多启动子使用和选择性拼接，导致人PPARγ基因至少产生7个5"UTR不同转录异构体[9]。PPARγ基因 mRNA 和蛋白半衰期均较短[10]，提示转录后调控在PPARγ基因表达中发挥重要作用。鸡PPARγ基因有3 个启动子，产生5 个5"UTR不同的PPARγ转录本（cPPARγs1-5）[11]。鸡PPARγ基因转录本 1（cPPARγ1）和PPARγ基因转录本 3（cPPARγ3）分别具有一个uORF，研究发现cPPARγ1 和cPPARγ3 的 uORF 均 抑 制 鸡PPARγ基 因 翻译[10,12]。鸡PPARγ转录本 5（cPPARγ5）的 5"UTR 具有两个 uORFs，但这两个 uORFs 对鸡PPARγ基因表达的影响尚不清楚。本研究采用报告基因和定点突变等技术，开展cPPARγ5 两个uORFs 功能分析。

1.1 试验材料

pcDNA3.1（+）真核表达载体（购自美国Invitrogen 公司）， pGL3-basic 荧光素酶报告基因载体（购自美国Promega 公司），海肾报告基因载体pGL3-TK（购自美国Promega 公司），5"UTR 转录后分析用报告基因载体psiCHECK2（本实验室保存）[12]。鸡永生化前脂肪细胞系ICP1（本实验室保存），鸡胚成纤维细胞系DF1（购自中国科学院上海生科院细胞资源中心）。

1.2 引物设计及合成

根据Promega公司提供的psiCHECK2报告基因载体序列信息，设计hRluc和hFluc基因qRT-PCR表达检测引物hRluc-F1/R1 和hFluc-F1/R1。根据已报道鸡PPARγ基因转录本序列（NM_0010 01460.1），设计全长编码区（CDS）克隆引物cPPARγ-F/R。根据已报道鸡cPPARγ5 mRNA 序列（GenBank 登录号：KP736525），设计 cPPARγ5 的5"UTR 区克隆引物 cPPARγ5-F1/R1 和 qRT-PCR 表达检测引物cPPARγ5-F2/R2。hRluc基因qRT-PCR表达检测选择hFluc基因作为内参基因；
鸡PPARγ基因qRT-PCR 表达检测选择NONO基因（TATA-binding protein gene）作为内参基因。利用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，使用NCBI数据库BLAST检测引物特异性，引物信息见表1。

表1 引物信息Table 1 Primers used in this study

1.3 载体构建

1.3.1cPPARγ5 的 5"UTR 及其 uORF 突变的报告基因载体构建

cPPARγ5 野生型 5"UTR 片段及其 3 个 uORF 突变型5"UTR片段由苏州金唯智生物科技有限公司合成。uORF 突变是指uATG 突变为uTGA，这3 个uORF 突变型5"UTR 片段分别是两个uORFs 单独突变型5"UTR片段（M1和M2）及两个uORFs同时突变型5"UTR 片段（M12）。将这些合成的突变型5"UTR片段和野生型5"UTR 片段分别插入到psi-CHECK2M载体hRluc基因上游NheⅠ酶切位点，得到重组质粒psiCHECK2M-cPPARγ5-5"UTR-WT、psiCHECK2M-cPPARγ5-5"UTR-M12、psiCHECK-2M-cPPARγ5-5"UTR-M1和psiCHECK2M-cPPARγ5-5"UTR-M2，送至苏州金唯智生物科技有限公司测序，验证无误后用于后续研究。

1.3.2 野生型和uORF突变型cPPARγ5真核表达载体构建

利用引物cPPARγ-F/R，以ICP1 细胞cDNA 为模板扩增鸡PPARγ基因CDS片段（两端携带EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点），将其插入到pcDNA3.1 表达载体EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，将载体命名为pcDNA3.1-CDS。然后将合成的鸡cPPARγ5 转录本野生型 5"UTR 片段和 3 个 uORF 突变型 5"UTR 片段（两端携带NheⅠ和XhoⅠ酶切位点）分别插入到pcDNA3.1-CDS 载体NheⅠ和XhoⅠ酶切位点，得到重组质粒pcDNA3.1-cPPARγ5-WT、pcDNA3.1-cPPARγ5-M12、pcDNA3.1-cPPARγ5-M1 和 pcDNA3.1-cPPARγ5-M2，送至苏州金唯智生物科技有限公司测序，验证无误后用于后续研究。

1.3.3cPPARγ5 的 5"UTR 及其 uORF 突变的启动子报告基因载体构建

将合成的cPPARγ5 野生型 5"UTR 片段和 3 个uORF突变型5"UTR片段（两端携带XhoⅠ和HindⅢ酶切位点）分别插入到pGL3-basic 报告基因载体XhoⅠ和HindⅢ酶切位点，得到重组质粒pGL3-basic-cPPARγ5-WT、pGL3-basic-cPPARγ5-M12、pGL3-basic-cPPARγ5-M1 和 pGL3-basic-cPPARγ 5-M2，送至苏州金唯智生物科技有限公司测序，验证无误后用于后续研究。

1.4 细胞培养

ICP1 细胞培养在DMEM/F12 完全培养基中，DF1 细胞培养在DMEM High Glucose 完全培养基中，这两种培养基均含有1%青链霉素和10%胎牛血清。放置在含5% CO2的37 ℃细胞培养箱中培养，24～48 h传代一次。

1.5 双荧光素酶报告基因活性检测

将ICP1 和DF1 细胞分别接种于24 孔板中，待细胞生长至70%汇合度时，按照LipofectamineTM2000 Transfection Reagen（tInvitrogen，美国）说明书操作，将构建完成的报告基因载体分别转染细胞，转染48 h 时利用Dual-Luciferase®Reporter Assay System（Promega，美国）试剂盒，按照说明书检测报告基因活性。cPPARγ5 的 5"UTR 及其 uORF 突变报告基因载体和启动子报告基因载体分别利用萤火虫荧光素酶（hFluc）活性和海肾荧光素酶（hRluc）活性进行校正，其相对活性分别为hRluc/hFluc和hFluc/hRluc。

1.6 总RNA 提取和qRT-PCR检测

利用RNeasy Plus Mini Kit（QIAGEN，德国）试剂盒，按照说明书提取总RNA。利用Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（购自宝日医生物技术（北京）有限公司）试剂盒，按照说明书进行反转录。使用ABI 7500实时荧光定量PCR 仪进行qRT-PCR 反应，反应体系为：cDNA模板（50 ng·μL-1）1 μL，Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）（2×）5 μL，上下游引 物（10 μmol·L-1）各 0.2 μL， 灭 菌 蒸 馏 水3.6 μL。反应条件为：95 ℃ 预变性 10 min；
95 ℃变性15 s，60 ℃复性延伸40 s，共40 个循环。分别以NONO和hFluc基因为内参基因，PPARγ和hFluc基因相对表达量计算方法为2-ΔΔCt。

1.7 Western blot分析

使用PBS 清洗3 遍细胞，加入含有PMSF（1 mmol·L-1）的RIPA 细胞裂解液（购自碧云天生物技术有限公司），吹打混匀后于冰上孵育15min，充分裂解细胞，12 000 r·min-1离心5 min，取上清，利用BCA法测定样品蛋白浓度。然后取20 μg样品蛋白进行12%SDS-PAGE电泳分离，结束后将样品转至NC 膜上，置于5%脱脂奶粉中室温封闭1 h；
将膜用 PBST 洗涤后加入 1∶1 000 稀释的鸡 PPARγ 一抗（购自北京中杉金桥生物技术有限公司），室温震荡孵育2 h；
将膜用PBST 洗涤后加入1∶5 000 稀释的HRP标记的二抗（山羊抗兔）（购自北京中杉金桥生物技术有限公司），室温震荡孵育1 h，将膜用PBST洗涤后进行ECL显色反应。

1.8 mRNA稳定性检测

将cPPARγ5 的野生型 5"UTR 及其 uORF 突变的报告基因载体分别转染细胞，转染24 h 后，加入放线菌素D 至终浓度为5 μg·mL-1，分别处理0（对照）、3、6、9 和12 h。收集细胞，提取细胞总RNA，利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（购自宝日医生物技术（北京）有限公司）试剂盒，按照说明书进行反转录。利用qRT-PCR 检测hRluc基因mRNA 表达，以hFluc基因为内参基因，以0 h的mRNA表达量作为标准，利用2-ΔΔCt分别计算各报告基因载体hRluc基因mRNA半衰期。

1.9 数据分析

本研究qRT-PCR 数据和荧光素酶相对活性试验数据均使用Graphpad Prism 7.0 软件分析显著性，数据表示为平均值（Mean）±标准误（SEM）。使用Student"st-test进行差异分析，*P＜0.05表示差异显著，**P＜0.01 表示差异极显著。使用线性回归分析法进行uORF对hRluc基因mRNA稳定性分析。

2.1 cPPARγ5 5"UTR区uORF分析

鸡cPPARγ5 的 5"UTR 序 列 长 度 为 252 nt（KP736525）。生物信息学分析发现，该5"UTR 存在两个uORFs，分别位于-213/-199 和-168/-139区，命名为uORF1和uORF2（见图1）。

图1 鸡PPARγ基因转录本5（cPPARγ5）5"UTR区的uORF分析Fig.1 uORF analysis of the 5"UTR of chicken PPARγ transcript variant 5(cPPARγ5)

2.2 cPPARγ5的uORF对报告基因表达的影响

为探索鸡cPPARγ5 两个uORFs 功能，分别构建野生型5"UTR（psi-CHECK2M-cPPARγ5-5"UTRWT）、两个uORFs单独突变（psiCHECK2M-cPPARγ 5-5"UTR-M1 和 psiCHECK2M-cPPARγ5-5"UTRM2）以及两者同时突变（psiCHECK2M-cPPARγ5-5"UTR-M12）的报告基因载体。将这些报告基因载体分别转染DF1 和ICP1 细胞，48 h 后检测报告基因活性。结果显示，在DF1和ICP1细胞中，uORF1 和uORF2 单独突变型（psiCHECK2M-cPPARγ 5-5"UTR-M1 和 psiCHECK2M-cPPARγ5-5"UTRM2）报告基因活性均显著或极显著高于野生型（psiCHECK2M-cPPARγ5-5"UTR-WT）报告基因活性；
uORFs 双突变型（psiCHECK2M-cPPARγ5-5"UTR-M12）报告基因活性极显著高于psiCHECK 2M-cPPARγ5-5"UTR-M1 和psiCHECK2M-cPPARγ 5-5"UTR-M2 报告基因活性，如图2A 所示。其中，在DF1 细胞中，uORFs 双突变型、uORF1 和uORF2 单独突变型报告基因活性分别为野生型报告基因活性的2.8、2.0 和1.4 倍。在ICP1 细胞中，uORFs 双突变型、uORF1 和uORF2 单独突变型报告基因活性分别为野生型报告基因活性的8.5、6.8 和2.8 倍，数据说明这两个uORFs 具有协同作用。

为进一步了解uORF抑制报告基因活性分子机制，采用qRT-PCR 检测各个报告基因载体转染细胞的hRluc基因mRNA 表达情况。结果发现，在DF1 细胞中，uORF1 突变型报告基因载体（psi-CHECK2M-cPPARγ5-5"UTR-M1）转染细胞的hRluc基因mRNA 表达水平显著高于野生型，uORF2 突变型报告基因载体（psiCHECK2M- cPPARγ5-5"UTR-M2）和uORFs 双突变型报告基因载体（psi-CHECK2M-cPPARγ5- 5"UTR-M12）转染细胞的hRluc基因mRNA表达水平无显著变化。在ICP1细胞中，uORF1突变型报告基因载体（psiCHECK2M-cPPARγ5-5"UTR-M1）和uORF2 突变型报告基因载体（psiCHECK2M-cPPARγ5-5"UTR-M2）转染细胞的hRluc基因mRNA 表达水平显著高于野生型，如图2B 所示，uORFs 双突变型报告基因载体（psi-CHECK2M-cPPARγ5-5"UTR-M12）转 染 细 胞 的hRluc基因mRNA 表达水平无显著变化。对比双荧光素酶报告基因活性检测结果（见图2A）和hRluc基因mRNA表达分析结果（见图2B），虽然uORF突变后hRluc基因mRNA表达在DF1和ICP1细胞中均升高，但mRNA 表达升高幅度远小于报告基因活性。与野生型相比，在DF1 细胞中，uORF1 突变型转染细胞的hRluc基因mRNA 表达仅是野生型的1.2倍；
在ICP1细胞中，uORF2突变型和uORFs双突变型转染细胞的hRluc基因mRNA 表达仅是野生型的1.15 倍。综上，这两个uORFs 突变主要抑制下游主阅读框（Main open reading frame，mORF）翻译。

图2 uORF突变对报告基因活性和报告基因mRNA表达的影响Fig.2 Effects of uORF mutation on activity and mRNA expression of reporter gene

2.3 cPPARγ5 的 uORF 对 mRNA 稳定性调控分析

在ICP1 细胞中，uORF1 单突变以及uORF1 和uORF2 双突变导致hRluc基因mRNA 表达水平升高（见图2B），推测cPPARγ5的uORF可能影响mRNA稳定性。为验证这一推测，分别检测3 种uORF 突变型对hRluc基因mRNA 稳定性的影响。半衰期测定结果显示，野生型报告基因载体（psiCHECK2M-cPPARγ5-5"UTR-WT）转 染 细 胞 的hRluc基 因mRNA 半衰期为7.20 h，uORFs 双突变型报告基因载体（psiCHECK2M-cPPARγ5-5"UTR-M12）转染细胞的hRluc基因 mRNA 半衰期为 7.43 h（见图 3A），uORF1 突变型报告基因载体（psiCHECK2M-cPPARγ5-5"UTR-M1）转染细胞的hRluc基因mRNA半衰期为6.15 h（见图3B），uORF2突变型报告基因载体（psiCHECK2M-cPPARγ5-5"UTR-M2）转染细胞的hRluc基因 mRNA 的半衰期为 8.35 h（见图 3C）。与野生型相比，这3 种uORF 突变型报告基因载体转染细胞的hRluc基因mRNA 降解速率均无显著差异，说明cPPARγ5 的两个 uORFs 对 mRNA 稳定性无显著影响。

图3 uORF突变对报告基因mRNA稳定性的影响Fig.3 Effects of uORF mutation on mRNA stability of reporter gene

2.4 cPPARγ5 的 uORF 对 PPARγ 基因的转录后调控

为排除uORF 仅在报告基因表达中发挥作用，进一步分析这两个uORFs 对PPARγ基因表达的影响。将构建的真核表达载体pcDNA3.1-cPPARγ5-WT、 pcDNA3.1-cPPARγ5-M12、 pcDNA3.1-cPPARγ5-M1 和 pcDNA3.1-cPPARγ5-M2 分别转染DF1和ICP1细胞，采用qRT-PCR和Western blot 分别检测鸡PPARγ基因mRNA 和蛋白表达。qRTPCR 结果显示，在ICP1 细胞中，与野生型相比，uORF1 突变型表达载体（pcDNA3.1-cPPARγ5-M1）转染细胞的PPARγ基因mRNA 表达水平显著增加（P＜0.05），但上调幅度较小；
uORF2突变型表达载体（pcDNA3.1-cPPARγ5-M2）和uORFs 双突变型表达载体（pcDNA3.1-cPPARγ5-M12）转染细胞的PPARγ基因mRNA 表达呈上调趋势，但无显著统计学变化（见图4A）。在DF1 细胞中，uORF1 突变型表达载体（pcDNA3.1-cPPARγ5-M1）和uORFs双突变型表达载体（pcDNA3.1-cPPARγ5-M12）转染细胞的PPARγ基因mRNA 表达显著升高，但上调幅度较小；
uORF2 突变型表达载体（pcDNA3.1-cPPARγ5-M2）转染细胞的PPARγ基因mRNA 表达无显著统计学变化（见图4A）。Western blot 结果显示，在ICP1 和DF1 细胞中，与野生型相比，3 个uORF突变型的PPARγ蛋白表达均极显著升高，其中uORFs双突变型表达载体（pcDNA3.1-cPPARγ5-M12）的 PPARγ 蛋白表达最高，分别上调约 1.7 倍（ICP1细胞）和1.3倍（DF1细胞），如图4B所示。以上结果表明，cPPARγ5 的两个uORFs 均抑制下游PPARγ mORF翻译。

图4 uORF突变对cPPARγ5 mRNA和蛋白表达的影响Fig.4 Effects of uORF mutation on the expression of cPPARγ5 mRNA and protein

2.5 5"UTR区启动子活性检测

5"UTR 在基因组中相应DNA 序列通常是启动子一部分。在前述研究中所使用5"UTR报告基因载体和表达载体中，uORF 突变可能影响5"UTR 启动子活性，导致报告基因和PPARγ基因表达发生变化。为验证这一推测，将构建的启动子报告基因载 体 pGL3- basic、 pGL3- basic- cPPARγ5- WT、pGL3-basic-cPPARγ5-M1、pGL3-basic-cPPARγ 5-M2 和 pGL3-basic-cPPARγ5-M12 分别转染 ICP1细胞。报告基因活性结果显示，pGL3-basic-cPPARγ5-WT、pGL3-basic-cPPARγ5-M1、pGL3-basic-cPPARγ5-M2 和 pGL3-basic-cPPARγ5-M12报告基因活性均极显著高于pGL3-basic 空载体报告基因活性（P＜0.01），约是pGL3-basic 空载体报告基因活性5～6倍（见图5）。

图5 cPPARγ5 5"UTR区启动子活性分析Fig.5 Promoter activity analysis of the 5"UTR of cPPARγ5

与野生 型 pGL3-basic-cPPARγ5-WT 相比，pGL3-basic-cPPARγ5-M12 启动子活性显著升高，但升高幅度较小；
pGL3-basic-cPPARγ5-M1 和pGL3-basic-cPPARγ5-M2 启动子活性无显著变化（见图5）。上述结果表明，cPPARγ5 的5"UTR 区具有启动子活性，uORFs双突变增强启动子活性，但uORF1或uORF2单独突变对启动子活性影响较小。

uORF 普遍存在于真核生物基因mRNA，是真核生物基因表达转录后调控重要元件之一[6,13]。大量研究证实，多数uORF 主要抑制基因翻译[14-15]，但也有部分uORF 促进基因翻译[16]。除翻译调控外，研究发现uORF还可调节mRNA稳定性，例如TPO基因 uORF 可导致其 mRNA 降解[17]，而GCN4和YAP1 基因 uORF 可增强其 mRNA 稳定性[18]。本研究采用报告基因、qRT-PCR、Western blot 及定点突变等技术分析发现，cPPARγ5 的uORFs（uORF1 和uORF2）并不影响mRNA 稳定性，但抑制下游mORF翻译。

前期研究表明，uORF 对下游mORF 翻译的抑制作用受uORF 数量、长度、uORF 距下游CDS 起始密码子距离及uORF起始密码子及其上下游序列影响，uORF 抑制作用可累加，即同一转录本中uORF 数量越多，对下游基因抑制作用越强[19]。Zhang 等在果蝇中发现，基因含有一个uORF 时，其翻译效率降低8.38%～30.40%，而基因含有多个uORF 时，其翻译效率降低18.4%～60.7%[20]。Chew等对人、鼠和斑马鱼转录本中uORF的生物信息学分析显示，uORF 数量与翻译效率呈负相关[21]。本研究结果与上述报道相似，uORF1 和uORF2 双突变对报告基因活性和PPARγ 蛋白表达的抑制作用显著高于这两个uORF 单独突变的抑制作用（见图4A 和 4B），说明 uORF1 和 uORF2 对下游 mORF 的翻译抑制具有协同作用。

本研究发现，uORF 突变导致hRluc和PPARγ基因mRNA 表达升高（见图2A 和图4A），进一步mRNA 稳定性分析显示，uORF 突变对hRluc基因mRNA 稳定性无显著影响，如图3 所示，这表明uORF 突变促进基因转录。许多基因5"UTR 相应DNA 序列具有启动子活性，例如Nomura 等发现V（1b）加压素受体基因5"UTR 的相应DNA 序列具有启动子活性，uORF 抑制5"UTR 启动子活性，抑制该 基因转 录[22]；

Li 等发 现WNK8 基 因 5"UTR 相应DNA序列具有启动子活性，uORF突变可增强该基因启动子活性，促进基因转录[23]。本试验证明cPPARγ5 的 5"UTR 相应 DNA 序列确实具有启动子活性，且uORF突变一定程度上增强启动子活性，如图5 所示，这一结果表明uORF 突变导致hRluc和PPARγ基因mRNA表达升高，原因是uORF突变引起5"UTR启动子活性增强。

鸡和哺乳动物脂肪生成和代谢不同，例如，鸡仅有白色脂肪组织且具有天然高血糖和胰岛素抗性，鸡脂肪细胞脂肪分解受胰高血糖素调节[24]；
鸡脂肪细胞分化不需要胰岛素，但需要脂肪酸[25]。McClelland 等研究表明人、鼠和鸡PPARγ基因5"UTR序列相似性较低，长度也存在较大差异，且人和鼠PPARγ基因5"UTR中不存在uORF[9-10]。这些数据提示，哺乳动物和鸡PPARγ基因转录后调控不同，本研究及cPPARγ1和cPPARγ3的uORF研究均发现，uORF在鸡PPARγ基因表达转录后调控中发挥作用[10,12]，uORF 介导的转录后调控可能是哺乳动物和鸡脂肪生成、脂肪发育和胰岛素敏感性表现差异的一个重要原因。本研究不足之处是缺乏体内研究，未来有必要利用CRISPR/Cas9 技术分析uORFs 在体内PPARγ基因表达调控、鸡脂肪生成、脂肪细胞表型维持、胰岛素抵抗以及鸡体脂过度沉积中作用和机制。

cPPARγ5 两个 uORF 不影响 mRNA 稳定性，但抑制下游PPARγ基因mORF的翻译。

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