2019—2021年我国部分地区PRRSV,ORF5,基因遗传变异分析
时间：2023-04-11 13:50:04 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
何晓明，王东东，田小艳，刘桂武，李春梅，欧阳海平，叶敏慧
（温氏食品集团股份有限公司，广东云浮 527400）
猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是属于动脉炎病毒科的RNA 病毒，主要引起母猪群流产、产死胎等特征的繁殖障碍以及仔猪的发烧、呼吸困难、气喘等症状[1]。
PRRSV 基因组全长15 kb 左右，包含ORF7、ORF6、ORF5、ORF4、ORF3、ORF2b、ORF2a、ORF1b、ORF1a 和5"端非编码区。其中：ORF1a和 ORF1b 主要编码 RNA 聚合酶和转录相关酶等与病毒复制相关的酶类，ORF2—ORF5 依次编码糖蛋白GP2—GP5，ORF6 编码膜基质蛋白GP6（又称 M 蛋白），ORF7 编码核衣壳蛋白GP7（又称N 蛋白），部分相邻的读码框存在重叠部位[2-3]。
GP5 蛋白变异是结构蛋白中最为显著的，此外GP5 蛋白含有糖基化位点，因而有助于识别细胞受体和中和病毒，GP5 也是促进体内产生中和抗体的主要蛋白，因此GP5 蛋白已成为PRRSV 鉴定和分析的重要指标[4-5]。
为了解近年PRRSV 的流行变异情况，本研究在2019—2021年收集了我国南方区域部分省份疑似PRRSV 感染的临床病例样品进行RT-PCR 检测，并对部分阳性样品进行病毒分离及ORF5 基因测序分析。
1.1 样品收集
可疑样品收集自广东、广西、湖南、江西4个省份不同猪场的流产母猪和有呼吸道症状育肥猪群，包括血清、肺脏、淋巴结、口腔液。
1.2 样品处理
肺脏和淋巴结先在无菌条件下研磨，研磨液以及血清、口腔液均在离心后取上清进行核酸抽提、RT-PCR 检测。检测阳性的样品接种PAM 细胞进行病毒分离，对分离到的毒株进行测序。
1.3 病毒RNA 提取
研磨液和培养上清取样后加到天隆病毒DNA/RNA 提取试剂盒，加样完毕后放入天隆核酸自动提取仪，所有操作按仪器设备和试剂盒操作说明书进行。
1.4 RT-PCR 检测
按照《猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测方法》（GB/T 35912—2018）中规定的方法，合成引物、探针（由上海生工合成），使用HiScript III U+One Step qRT-PCR Probe Kit（诺唯赞）配置反应体系，在ABI QuantStudio6 荧光定量PCR 仪进行检测，Ct ≤38 且扩增曲线为典型的S曲线，为PRRSV 核酸阳性。
1.5 ORF5 基因测序
对分离的病毒进行ORF5 基因扩增，扩增产物经电泳鉴定后送上海生工测序。测序引物序列见表1。
表1 测序引物序列
1.6 ORF5 基因进化分析
ORF5 基因测序结果经处理后，使用MEGA11软件绘制进化树，参考毒株来自NCBI，进化树绘制采用Neighbor-Joining 模型，Bootstrap 设置为1 000。
1.7 重组分析
对其中1 株命名为GX-C4CG6 的毒株进行基因组全长扩增，并与其他参考毒株进行比对，比对结果使用RDP 4 和SimPlot 3.5.1 软件分析评估毒株重组情况。
2.1 样品检测
2019—2021年，共收集25 个种猪场、22 个育肥场2 163 份各类样品，其中565 份样品检测为阳性，样品阳性检出率为26.12%；
种猪场场阳性检出率为52.00%，育肥场为86.36%。不同省份和不同场检测情况详见表2。
表2 2019—2021年4 省份不同类型猪场PRRSV 场阳性检出率 单位：%
2.2 ORF5 基因进化分析
共成功分离到97 株病毒并对其进行了ORF5基因测序和进化分析。结果（图1）显示：50株属于Sublineage 1.8（51.55%），13 株属于Sublineage 1.5（13.40%），9 株属于Lineage 3（9.28%），10株属于Lineage 8（10.31%），15株属于Lineage 5（15.46%）。
图1 ORF5 基因进化树
2019—2021年4 省份临床流行的PRRSV 毒株包括类NADC30 毒株、经典株、类NADC34 毒株、变异株和类QYYZ 毒株，其中类NADC30 毒株占比最高，是临床上主要流行毒株。
2.3 ORF5 测序结果统计
按年份进行的统计结果（图2-A）显示：类NADC30 毒株在各年份占比均为最高，2021年首次检测到类NADC34 毒株，且当年占比达13.40%；
类QYZZ 毒株、变异株和经典株在各年份仍有流行。
按地区进行的统计结果（图2-B）显示：广东的类NADC30 毒株和经典株占比最高，广西、湖南的类NADC30 和类NADC34 毒株占比最高，江西的类NADC30 毒株和变异株占比最高；
除江西外，其他3 个省份均有类NADC34 毒株被检出。
图2 不同年份和不同地区毒株占比
2.4 ORF5 基因推导氨基酸位点突变分析
因GP5 蛋白的R13和R151被认为与毒力有关[6-8]，本研究对97 株分离株GP5 蛋白推导氨基酸与参考序列使用DNAstar 软件进行比对。结果显示：20 株由Q13变为R13，其中3 株为Sublineage 1.8，1 株为Lineage 5，10 株为Lineage 8，6 株为Lineage 3；
23株由K151变为R151，其中10株为Sublineage 1.8，3 株为Lineage 5，10 株为Lineage 8。
本研究发现，有24 株Sublineage 1.8、4 株Sublineage 1.5、15 株Lineage 5、10 株Lineage 8和3 株Lineage 3 毒株在36～52 位的中和表位区均发生了突变（图3）。这些突变可能导致病毒逃避疫苗免疫诱导的中和作用，从而有可能会降低疫苗保护效果。
图3 ORF5 序列推导氨基酸比对结果
图3 ORF5 序列推导氨基酸比对结果（续）
2.5 GX-C4CG6 毒株重组分析
通过RDP4 软件确定了重组事件和重组分界点，同时使用Simplot 进行了结果验证。重组分析结果显示：GX-C4CG6 基因组主要以类NADC30毒株基因序列为骨架，并与JXA1 和IA2014 毒株发生了重组；
通过RDP4 和Simplot 软件分析确定了4 处重组（表3），重组位置分别位于5 302～6 500、6 880～8 074、12 121～13 347 和13 724～14 542。全基因组进化分析结果显示，GXC4CG6 属于类NADC30 毒株（Sublineage 1.8）；
但重组区域进化分析显示，其中两处（5 302～6 500、6 880～8 074）与JXA1 毒株（Lineage 8）位于同一分支，另两处（12 121～13 347、13 724～14 542）与IA2014 毒株（Sublineage 1.5）位于同一分支（图4）。
图4 重组分析结果
表3 GX-C4CG6 毒株RDP4 软件重组分析信息
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）在国内出现后，对国内养猪业持续造成巨大影响。PRRSV 是RNA病毒，变异快，新毒株层出不穷[9]，这给PRRS 防控工作带来了巨大挑战。
本研究从广东、广西、湖南、江西4 个省份的种猪场和育肥场采集疑似PRRSV 感染样品进行检测，结果发现PRRSV 总阳性检出率为26.12%，其中育肥场的场阳性检出率高于种猪场，表明PRRSV 在育肥猪群流行更为普遍。
对分离株进行ORF5 基因测序发现，2019—2021年类NADC30 毒株是4 省份的主要流行毒株，占比高达51.55%。
类NADC34 毒株2017年在辽宁省首次被发现[10]，之后在多个省份陆续出现[11]。本研究发现，广东、广西、湖南2021年首次出现类NADC34毒株，但在江西未发现，这可能受采样面和覆盖猪场数量影响，相关情况待进一步调查。类NADC34 毒株流行区域较为广泛，需引起高度重视。养殖场需持续对场内PRRSV 流行情况进行监测，评估场内毒株流行变异情况。
GP5 蛋白分析显示，PRRSV 毒力位点及中和表位突变较为普遍，特别是类NADC30 和类QYYZ 毒株，这可能是该类毒株疫苗保护效果不佳的一个原因。
GX-C4CG6 毒株基因组全长重组分析结果显示，该毒株以NADC30 毒株为主要亲本，并重组了包括高致病毒株JXA1 和类NADC34 毒株IA2014 在内的基因组片段。PRRSV 在流行过程中发生重组可能导致病毒致病性等发生变化，该重组毒株的致病性以及现有疫苗对其免疫保护的效果有待进一步研究。
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