2-苯基噻唑衍生物的合成、表征及其抗肿瘤活性*

钱晶晶，武文龙，吉 敬,b，徐誉芯，邹靖培，刘珊鸣，董常娥,史大华,c

(江苏海洋大学 a.药学院；
b.江苏省海洋药物活性分子筛选重点实验室；
c.江苏省海洋生物资源与环境重点实验室，江苏 连云港 222005)

癌症细胞具有无限增殖、向正常组织或器官浸润扩散等特性，这使治愈癌症变得极为困难[1]。2020年，全球约有1 929万新癌症病例(不包括非黑色素瘤皮肤癌)和近1 000万癌症死亡病例(不包括非黑色素瘤皮肤癌)，癌症已成为世界公共问题之一，严重影响着人们的健康，其防治已经成为全球卫生战略的核心内容[2]。目前乳腺癌造成的死亡人数仅次于肺癌，是女性罹患的最常见癌症[3]。乳腺癌最常用的疗法包括化学疗法、免疫疗法、激素治疗、外科手术和放射疗法。其中，化学疗法在乳腺癌治疗中具有较好疗效，但会出现严重的耐药问题[4]。因此，开发新型的抗乳腺癌化学治疗药物非常重要。

噻唑衍生物是一类非常重要的杂环化合物，具有广泛的生物学活性。很多重要的化合物中都含有噻唑环结构。噻唑衍生物常常被用来合成高效低毒且具有较好药物代谢特征的化合物[5]。噻唑环是一些抗肿瘤药物如达沙替尼、达拉非尼和伊沙匹隆等的基本组成部分[6]。近年来一些新型高效低毒的抗肿瘤噻唑衍生物被合成出来[7-9]。在前期的研究中，多个具有抗肿瘤活性的2-苯基噻唑衍生物被设计合成出来，这些化合物对乳腺癌细胞具有很好的细胞毒活性[10-11]。2-苯基噻唑相关的衍生物2-噻唑甲酰胺类化合物对Akt有明显的抑制作用，可抑制其下游MDM2和GSK3β蛋白的磷酸化[6]。Mahapatra等[12]设计通过改变噻唑取代基合成墨兰素-希夫碱衍生物，并研究发现其抗肿瘤活性是通过EGFR抑制机制产生的细胞毒性结果。Salem等[13]合成了一系列新的1，3-噻唑类化合物，这类化合物表现出较好的抗肿瘤活性，研究发现化合物2-[5-(4-氯苯基)-1，3-噻唑-2-基)]-1-乙酰肼抗肿瘤活性的机理是其对血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)具有明显的抑制活性，能诱导细胞停滞在G1阶段，诱导线粒体去极化。Sabry等[14]合成一系列新的咪唑并噻唑类衍生物，其中化合物N′-乙酰基-5-(4-溴苯基)咪唑并[2,1-b]噻唑-3-甲酰肼和5-(4-甲氧基苯基)-6-(吗啉甲基)咪唑并[2,1-b]噻唑-3-甲酰肼具有双重 EGFR/HER2 激酶抑制作用，诱导细胞在G1/S期和G1期停滞，建模研究结果表明噻唑部分具有抗肿瘤活性。

近期有文献报道双噻唑衍生物可以诱导肿瘤细胞的凋亡[15]。在本课题组前期研究工作的基础上，本文在常温条件下通过酰胺连接2个2-苯基-1，3-噻唑基团合成了4个新型的双2-苯基噻唑衍生物，并利用MTT法检测了目标化合物对MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖的抑制活性，为乳腺癌化学治疗药物的开发提供新的研究思路。

1.1 主要仪器与试剂

高分辨质谱仪(UPLC G2-XS，Waters公司)；
红外光谱仪(Tensor 27，Bruker公司)；
核磁共振波谱仪(Avance 500 MHz，Bruker公司)；
熔点仪(SWG X-4B，上海申光仪器仪表有限公司)；
荧光显微镜(XD-20,南京瑞元光学仪器有限公司)；
多功能酶标仪(Synergy Neo2,BioTek公司)；
离心机(SCILOGEX S1010E,上海青牧生物科技有限公司)；
微型涡旋混合仪(Mixer 4K,生工生物工程股份有限公司)。

4-羟基硫代苯甲酰胺(纯度98%，阿拉丁试剂)，3-溴丙酮酸乙酯(纯度80%，阿拉丁试剂)，4-三氟甲基硫代苯甲酰胺(纯度98%，阿拉丁试剂)，4-氯硫代苯甲酰胺(纯度98%，麦克林试剂)，4-(氨甲基)哌啶(纯度98%，麦克林试剂)，无水哌嗪(纯度99%，阿拉丁试剂)，氯化亚砜(纯度99%，麦克林试剂)。其余试剂均为分析纯，购自国药集团试剂有限公司。癌细胞株：MDA-MB-231乳腺癌细胞(实验室保存)。DMEM 细胞培养液(Gibco公司)；
胎牛血清(FBS-PN500，上海煊翎生物科技有限公司)；
胰蛋白酶(Gibco公司)；
MTT试剂(碧云天生物技术有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 目标化合物的合成路线 目标化合物的合成路线如图1所示。

图1 目标化合物的合成路线

1.2.2 目标化合物的合成方法

(1)5-(4-氯苯基)噻唑-2-羧酸乙酯(2a)的合成。4-氯硫代苯甲酰胺5 g(29.1 mmol)溶解在30 mL无水乙醇中，然后加入3-溴丙酮酸乙酯6.82 g(35.0 mmol)，在80 ℃下反应6 h。反应结束后加入80 mL冰水，过滤，得到6.25 g浅黄色固体2-(4-氯苯基)噻唑-4-甲酸乙酯,产率约为80%。

(2)5-(4-(三氟甲基)苯基)噻唑-2-羧酸乙酯(2b)的合成。4-三氟甲基硫代苯甲酰胺5 g(24.4 mmol)溶解在30 mL无水乙醇中，然后加入3-溴丙酮酸乙酯5.70 g(29.2 mmol)，80 ℃下反应6 h。反应结束后加入80 mL冰水，过滤，得到5.58 g黄色固体2-(4-(三氟甲基)苯基)噻唑-4-甲酸乙酯,产率约为76%。

(3)5-(4-氯苯基)噻唑-2-碳酰氯(3a)的合成。将1.0 g(3.74 mmol)5-(4-氯苯基)噻唑-2-羧酸乙酯溶解于40 mL乙醇中，然后加入0.25 g(4.48 mmol)KOH，混合物在50 ℃下反应2 h。反应结束后，蒸干溶剂，用乙酸乙酯和蒸馏水进行萃取，保留水相，用质量分数10%的稀HCl调节水相pH至5～6，析出固体抽滤，得到中间产物2-(4-氯苯基)噻唑-4-甲酸。将得到的底物2-(4-氯苯基)噻唑-4-甲酸溶解到15 mL二氯甲烷中，加入1 mL(过量5倍)氯化亚砜，反应液于50 ℃回流反应6 h。反应结束后，反应体系蒸干得到白色固体2-(4-氯苯基)噻唑-2-碳酰氯0.8 g,产率约为80%。

(4)5-(4-(三氟甲基)苯基)噻唑-2-碳酰氯(3b)的合成。将1.0 g(3.32 mmol)5-(4-(三氟甲基)苯基)噻唑-2-羧酸乙酯溶解于40 mL乙醇中，然后加入0.22 g(3.98 mmol)KOH，混合物在50 ℃下反应2 h。反应结束后，蒸干溶剂，用乙酸乙酯和蒸馏水进行萃取，保留水相，用质量分数10%的稀HCl调节水相pH至5～6，析出固体抽滤，得到中间产物5-(4-(三氟甲基)苯基)噻唑-2-羧酸。将得到的底物5-(4-(三氟甲基)苯基)噻唑-2-羧酸溶解到15 mL二氯甲烷中，加入1 mL(过量5倍)氯化亚砜[13]，反应液于50 ℃回流反应6 h。反应结束后，反应体系蒸干得到黄色固体5-(4-(三氟甲基)苯基)噻唑-2-碳酰氯0.76 g,产率约为78%。

(5)哌嗪-1,4-二基双((5-(4-氯苯基)噻唑-2-基)甲酮)(6a)的合成。将上述得到的3a溶于二氯甲烷溶液中，惰性气体保护，按体积比例取0.155 4 g(0.602 mmol)。将0.062 2 g(0.723 mmol)无水哌嗪溶解于10 mL二氯甲烷中，加入3a溶液，室温反应30 min结束。将反应体系旋干，柱层析后得到白色固体0.221 3 g,产率为93.52%。熔点为295.1～295.2 ℃；
IR(KBr)，σ(cm-1)：3 441,2 923,1 590,1 438,1 365,1 070;1H NMR(CDCl3,500 MHz)，δ：8.04(s,2H),7.97～7.82(m,4H),7.47(dd,J=3.3,1.6 Hz,4H),4.24～4.11(m,4H),3.98(s,4H);13C NMR(CDCl3,126 MHz)，δ：182.9,166.2,162.6,136.7,131.5,129.4,127.8,125.4,29.7;ESI-MS：m/z[M+H]+Calcd for C24H19Cl2N4O2S2+,理论值：529.032 1,实测值：529.032 4。

(6)哌嗪-1,4-二基双((5-(4-(三氟甲基)苯基)噻唑-2-基)甲酮)(6b)的合成。将上述得到的3b溶于二氯甲烷溶液中，惰性气体保护，按体积比例取0.122 5 g(0.475 mmol)。将0.049 0 g(0.570 mmol)无水哌嗪溶解于10 mL的二氯甲烷中，加入3b溶液，室温反应30 min结束。将反应体系旋干，柱层析后得到白色固体0.239 5 g,产率为95.62%。熔点为233.3～233.6 ℃；
IR(KBr)，σ(cm-1)：3 435,2 935,1 597,1 437,1 069;1H-NMR(CDCl3,500 MHz)，δ：8.11(s,2H),8.08(s,4H),7.74(s,4H),4.19(d,J=18.3 Hz,4H),3.99(s,4H)；
13C-NMR(CDCl3,126 MHz)，δ：162.4,151.4,136.0,132.4,132.0,126.8,126.2,126.1,126.0,53.4;ESI-MS:m/z[M+H]+Calcd for C26H19F6N4O2S2+,理论值：597.084 8,实测值：597.085 2。

(7)5-(4-氯苯基)-N-((1-(5-(4-氯苯基)噻唑-2-羰基)哌啶-4-基)甲基)噻唑-2-甲酰胺(7a)的合成。将上述得到的3a溶于二氯甲烷溶液中，按体积比例取0.115 8 g(0.449 mmol)。将0.061 5 g(0.538 mmol)4-氨甲基哌啶溶解于10 mL的二氯甲烷中，加入3a溶液，室温反应30 min结束。将反应体系旋干柱层析，得到白色固体0.228 7 g,则其产率为91.40%。熔点为295.1～295.2 ℃；
IR(KBr)，σ(cm-1)：3 441,2 923,1 590,1 438,1 365,1 070;1H NMR(CDCl3,500 MHz)，δ：8.04(s,2H),7.97～7.82(m,4H),7.47(dd,J=3.3,1.6 Hz,4H),4.24～4.11(m,4H),3.98(s,4H);13C NMR(CDCl3,126 MHz)，δ：182.9,166.2,162.6,136.7,131.5,129.4,127.8,125.4,29.7;ESI-MS:m/z[M+H]+Calcd for C24H19Cl2N4O2S2+,理论值：529.032 1,实测值：529.032 4。

(8)5-(4-(三氟甲基)苯基)-N-((1-(5-(4-(三氟甲基)苯基)噻唑-2-羰基)哌啶-4-基)甲基)噻唑-2-甲酰胺(7b)的合成。将上述得到的3b溶于二氯甲烷溶液中，按体积比例取0.113 7 g(0.390 mmol)。将0.053 4 g(0.468 mmol)4-氨甲基哌啶溶解于10 mL的二氯甲烷中，加入3b溶液，室温反应30 min结束。将反应体系旋干柱层析，得到白色固体0.225 1 g,则其产率为92.48%。熔点为127.8～128.2 ℃；
IR(KBr)，σ(cm-1)：3 431,2 929,1 597,1 439,1 068;1H NMR(CDCl3,500 MHz)，δ：8.20(s,1H),8.15～8.05(m,4H),7.96(s,1H),7.74(t,J=7.4 Hz,4H),7.60(t,J=5.6 Hz,1H),4.80(d,J=11.8 Hz,1H),4.64(d,J=12.5 Hz,1H),3.49(d,J=26.0 Hz,2H),3.20(t,J=12.4 Hz,1H),2.88(t,J=11.8 Hz,1H),2.13～2.02(m,1H),1.95(dd,J=36.5,11.9 Hz,2H),1.71(s,1H),1.28(s,1H);13C NMR(CDCl3,126 MHz)，δ：166.4,165.3,162.5,161.1,152.1,151.2,136.2,135.8,132.5,132.2,131.9,126.9,126.8,126.1,126.0,124.7,124.0,44.6,36.8;ESI-MS:m/z[M+H]+Calcd for C28H23F6N4O2S2+,理论值：625.116 1，实测值：625.116 3。

1.3 抗肿瘤活性

用MTT细胞活力法测定化合物对MDA-MB-231细胞的细胞毒性。选取对数生长期的肿瘤细胞，经胰酶消化后，用含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基配成细胞悬液(1×105个/mL)，接种至96孔培养板(每孔100 μL)后放入细胞培养箱中37 ℃恒温培养24 h。将原培养基更换为含有特定浓度化合物的培养基(化合物终浓度梯度为200 μmol/L,100 μmol/L，50 μmol/L，25 μmol/L，12.5 μmol/L，6.25 μmol/L)，空白对照孔加入含等体积溶媒的培养基，放入恒温培养箱中培养24 h(每个药物浓度设置3个复孔)，之后用移液器吸弃培养基，每孔加入10 μL MTT溶液，继续培养4 h，吸弃MTT溶液后，每孔加入100 μL DMSO进行显色。将96孔板放在摇床上低速振荡10 min，使用酶标仪在490 nm下检测各孔的光吸收值，记录数据并计算化合物半数抑制浓度(IC50)。

1.4 数据统计分析

化合物抗癌活性以及对乳腺癌细胞的IC50值设置3个平行实验，数据值为3个平行样品的平均值，用误差线表示标准偏差。

2.1 终产物合成条件的选择

在化合物3a和3b与哌嗪和4-氨甲基哌啶反应生成终产物6a，6b和7a，7b的过程中，化合物3a和3b与哌嗪和4-氨甲基哌啶的比例影响双取代化合物的产率。随着哌嗪和4-氨甲基哌啶的比例的提高，双2-苯基噻唑衍生物的收率会降低。以化合物6a的合成为例(见表1)，当化合物4与化合物3a的投料比(物质的量之比)为1.2∶1时，终产物的产率达到98%。随着哌嗪比例的提高，化合物6a的产率会逐渐降低。当化合物4与3a的投料比达到30.0∶1时，化合物6a的产率仅有45%。这时会产生大量的一取代的2-苯基噻唑衍生物。

表1 投料比对终产物产率的影响

2.2 抗肿瘤活性

测试所得数据使用Excel软件进行分析处理，以时间为横轴，吸光值OD为纵轴绘制生长曲线，计算细胞存活率及抑制率。

细胞存活率=(As-Ab)/(Ac-Ab)×100%；

抑制率=(Ac-As)/(Ac-Ab)×100%。

式中：As为实验组OD值，Ab为空白组OD值，Ac为阴性对照组OD值。

化合物抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的效果如图2所示。合成的4个化合物在100 μmol/L浓度下对MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖均具有抑制作用。其中化合物6b和化合物7b的抑制活性较好，对MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖的抑制率分别为57%和68%。这两个化合物对MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖具有剂量依赖关系，随着化合物浓度的增加，两个化合物对MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖的抑制作用增加(见图3)。化合物6b和7b抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖的IC50分别为(81.71±2.43)μmol/L和(24.63±3.57)μmol/L。化合物7b的活性略高于阳性对照阿西贝利(IC50=(45.5±0.09)μmol/L)，说明该化合物具有较好的乳腺癌细胞抑制活性。Radwan等[15]报道的双噻唑衍生物中对乳腺癌细胞MCF7具有最好抑制活性的化合物1,3-双(2-(2-(4-(苯并[d]噻唑-2-基)噻唑-2-基)肼)甲基)苯氧基)丙烷的IC50值为7.31 μmol/L，低于其阳性对照阿霉素(IC50=5.23 μmol/L)。化合物7b的活性与文献报道的双噻唑衍生物1,3-双(2-(2-(4-(苯并[d]噻唑-2-基)噻唑-2-基)肼)甲基)苯氧基)丙烷相当。从构效关系分析，目标化合物中R取代基对化合物的抗肿瘤活性具有一定的影响，当取代基为三氟甲基时，化合物6b和7b具有较好的抗肿瘤活性。

图2 化合物在100 μmol/L 浓度下的抗癌活性初筛结果

a 化合物6b

噻唑类化合物具有广泛的抗肿瘤活性。文献报道，该类化合物可以与多种抗肿瘤靶点相互作用[16]。一些噻唑衍生物通过抑制EGFR激酶、芳香化酶、单酰甘油脂肪酶、RSK2等靶标相互作用，起到抗乳腺癌的作用[6]。Radwan等[15]报道的双噻唑衍生物具有磷脂酰肌醇-3-激酶抑制活性。考虑到本文合成的化合物与文献报道的双噻唑衍生物具有一定的结构相似性，因此，预测本文合成的化合物可能也具有一定的磷脂酰肌醇-3-激酶抑制活性。下一步研究将以化合物7b为先导化合物，对化合物的结构进一步优化，对化合物的药理学活性进行深入评价。

以对位取代的硫代苯甲酰胺为原料，依次通过环合、水解、酰化、取代反应合成了4个新型的双2-苯基噻唑衍生物。所有化合物都经过1H NMR,13C NMR,IR,ESI-MS表征，并研究了这些化合物对MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖的抑制活性。所有双2-苯基噻唑衍生物在100 μmol/L浓度下对MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖都具有抑制作用。双2-苯基噻唑的生物学活性与其R取代基的结构有关，当R取代基位为三氟甲基时，化合物抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖的活性较好。化合物7b抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖的活性优于阳性对照阿贝西利，可以作为乳腺癌治疗药物开发的先导化合物。未来将对化合物7b的结构进行优化，以期得到高效低毒的抗乳腺癌化合物。

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