活血生肌方外用对大鼠压力性损伤组织金属蛋白酶-9及其抑制因子-1,表达的影响
时间：2023-03-26 22:50:03 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
苏玉娟 潘孙峰 熊 烈 胡衍泽 单云岗 于恩光
压力性损伤，俗称压疮，是由于皮下组织受长时间的压力作用导致组织缺血缺氧的结果，若创面累及深部皮下组织、肌肉及骨骼，可导致严重感染甚至死亡[1]。压疮是常见的难愈性溃疡之一，属中医“疮疡”范畴，历代医家多主张“祛腐”“活血”“生肌”等法来进行治疗。本研究旨在通过检测压力性损伤组织中金属蛋白酶-9（MMP-9）及组织抑制因子-1（TIMP-1）表达水平及Ⅰ型胶原表达量的变化，了解MMP-9 及TIMP-1 与压力性损伤创面病理变化的关系，进而探讨活血生肌方对压力性损伤的治疗机制。
1.1 动 物 60 只SPF 级成年雄性SD 大鼠，体质量180～200 g，购买于浙江维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（浙）2019-0001，委托饲养于本院附属某医学院动物实验中心。通风环境，室温（25±2）℃，湿度（55±5）%。实验人员均持有动物实验许可证，动物福利完全按照国际相关实验动物法规实施。本研究通过浙江省嘉兴市中医医院伦理委员会审核，伦理批件号：2019KY0454。
1.2 药 物 黄凡士林（性状：膏剂，规格：500 g/罐，由南昌白云药企有限公司生产，生产批号20211002）。活血生肌方（由当归、丹参、红花、黄芪、乳香、没药、白芨、白芷、重楼、甘草组成）（配置比例为2∶2∶1∶1.5∶1∶1∶1∶1∶1∶1），粉碎过40 目。药粉与黄凡士林1∶3 配比，加热混合制成膏剂，均匀涂抹于纱条上制成膏剂厚度为2 mm 活血生肌纱条，同时制作厚度为2 mm 凡士林纱条。以上均由浙江省嘉兴市中医医院药剂科提供并制备。
1.3 试剂与仪器 MMP-9、TIMP-1 二抗DAB 免疫组化试剂盒（批号PV8000D，北京中杉有限公司），一抗ABD-0030 稀释液（批号211216S963c，福州迈新生物科技开发有限公司）。荧光正置显微镜（Zeiss，Axio Scope A1），凝胶成像仪（Tanon 5200 Multi）、蛋白质电泳系统（Bio.Rad），组织均质器（宁波新芝，Scientz-48）。
2.1 造 模 大鼠实验前适应性喂养1 周，应用缺血-再灌注磁片循环压迫的方式，在大鼠背部建立上下两个压疮模型，通过皮层切口分离肌层，将无菌铁片植入皮下。大鼠如无感染现象，进行磁铁施压。施压24 h 后，使用无菌刀片划破受压皮肤至真皮层，继续施压24 h。见图1。
图1 大鼠背部建立压疮模型示意图
2.2 分组与给药 将造模成功的60 只压疮模型大鼠背部创面编号，按随机数表法分为治疗组和对照组，每组30 只，治疗组大鼠创面常规处理，予活血生肌纱条外敷后用无菌纱布覆盖，1 次/d，直至实验结束。对照组大鼠创面常规处理，予凡士林纱条外敷后用灭菌纱布覆盖，1 次/d，直至实验结束。
2.3 观察指标
2.3.1 压疮组织MMP-9 及其TIMP-1 表达 分别在换药第1、3、5、7、9 天各组随机抽取6 只压疮模型大鼠（12 个创面）用腹腔注射100 g/L 水合氯醛（300 mg/kg）的方法麻醉后切取背部创面中心部位处大小为0.3 cm×0.3 cm 的全层皮肤组织。取材后，予大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g 处死。根据所购试剂盒步骤，采用免疫组化法及Image J 图像软件分析测定创面组织中MMP-9 及其TIMP-1 蛋白表达量。
2.3.2 压疮组织Ⅰ型胶原蛋白及胶原纤维表达 取各组大鼠创面组织切片，常规脱蜡脱水，Masson 染色，组织胶原纤维呈蓝色。显微镜下观察胶原纤维表达情况。采用Image J 图像分析软件分析每平方毫米组织中的Ⅰ型胶原及胶原纤维表达量。
2.4 统计学方法 应用SPSS 17.0 统计软件，正态分布计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析；
非正态分布计量资料以中位数（P25-P75）表示，组间比较采用Wilcoxon 秩和检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。
3.1 两组大鼠疮面组织MMP-9 表达量比较 换药第1 天，两组大鼠创面组织MMP-9 表达差异无统计学意义（P＞0.05）；
换药第3 天开始，治疗组大鼠创面组织MMP-9 表达量较对照组降低（P 均＜0.01），见表1、图2。
图2 免疫组化法检测不同方法处理大鼠背部压力性损伤组织MMP-9（棕黄色）表达（二氨基联苯胺-苏木素染色，×100）注：a、b、c、d 分别为凡士林纱布换药第3、5、7、9 天创面组织MMP-9 镜下表达情况；
A、B、C、D 分别为活血生肌方纱条换药第3、5、7、9 天创面组织MMP-9 镜下表达情况；
MMP-9 为金属蛋白酶-9
表1 两组大鼠创面组织各时间点MMP-9 表达量比较（）
表1 两组大鼠创面组织各时间点MMP-9 表达量比较（）
注：治疗组常规创面处理基础上给予活血生肌纱条换药；
对照组常规创面处理基础上给予凡士林纱条外敷；
MMP-9 为金属蛋白酶-9；
与对照组比较，aP＜0.01
3.2 两组大鼠疮面组织TIMP-1 表达量比较 换药第1 天，两组大鼠创面组织TIMP-1 表达差异无统计学意义（P＞0.05）；
换药第3 天开始，治疗组大鼠创面组织TIMP-1 含量较对照组升高明显（P 均＜0.05），见表2、图3。
图3 免疫组化法检测不同方法处理大鼠背部压力性损伤组织TIMP-1（棕黄色）表达（二氨基联苯胺-苏木素染色，×100）注：a、b、c、d 分别为凡士林纱布换药第3、5、7、9 天创面组织TIMP-1 镜下表达情况；
A、B、C、D 分别为活血生肌方纱条换药第3、5、7、9 天创面组织TIMP-1 镜下表达情况；
TIMP-1 为组织抑制因子-1
表2 两组大鼠创面各时间点TIMP-1 含量比较（）
表2 两组大鼠创面各时间点TIMP-1 含量比较（）
注：治疗组常规创面处理基础上给予活血生肌纱条换药；
对照组常规创面处理基础上给予凡士林纱条外敷；
TIMP-1 为组织抑制因子-1；
与对照组比较，aP＜0.05
3.3 两组大鼠疮面组织Ⅰ型胶原蛋白表达量比较换药第1 天，两组大鼠创面组织Ⅰ型胶原蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）；
换药第3 天，两组大鼠创面组织均可见Ⅰ型胶原蛋白的形成，治疗组高于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；
换药第5、7、9 天，治疗组Ⅰ型胶原蛋白表达较对照组明显增多（P 均＜0.05），胶原蛋白结构致密，成熟度较高。见表3、图4。
表3 两组大鼠创面组织各时间点Ⅰ型胶原蛋白表达量比较（）
注：治疗组常规创面处理基础上给予活血生肌纱条换药；
对照组常规创面处理基础上给予凡士林纱条外敷；
与对照组比较，aP＜0.05
图4 不同方法处理大鼠背部压力性损伤组织中Ⅰ型胶原（蓝色）表达（Masson 染色，×100）
3.4 两组大鼠疮面组织胶原纤维表达量比较 两组大鼠在换药前压疮皮肤组织胶原纤维排列紊乱，表达量少，差异无统计学意义（P＞0.05）；
与对照组比较，治疗组胶原纤维表达量从第3 天开始增多，但差异无统计学意义（P＞0.05）；
第5、7、9 天，治疗组胶原纤维表达量较对照组明显增多（P 均＜0.05），含量丰富，排列有序。见表4、图5。
图5 不同方法处理大鼠背部压力性损伤组织中胶原纤维（蓝色）表达（Masson 染色，×100）
表4 两组大鼠创面组织各时间点胶原纤维表达量比较（）
表4 两组大鼠创面组织各时间点胶原纤维表达量比较（）
注：治疗组常规创面处理基础上给予活血生肌纱条换药；
对照组常规创面处理基础上给予凡士林纱条外敷；
与对照组比较，aP＜0.05
在压疮愈合进程中，以胶原纤维为主要成分的细胞外基质（ECM）的过度降解是创面难愈的重要因素。而MMP-9 是参与ECM 降解的蛋白酶，其过度表达可影响胶原沉积过程，导致组织液化，其活性受金属蛋白酶抑制剂（TIMP-1）的影响。研究表明，MMP-9 参与压疮[2-3]病理过程，其在创面组织表达增高是溃疡愈合不良的预测因素；
慢性创面TIMP-1 缺如或显著低于正常愈合伤口，且MMP/TIMP 比例的失衡可能与伤口愈合延迟有关[4]。以上均提示MMP-9 不利于创面愈合，而TIMP-1 上调可能中和过强MMP-9的活性，因此MMP-9、TIMP-1 的表达失调与创面不愈合密切相关。
压疮为临床典型的慢性皮肤溃疡。课题组根据压疮的病因病机，采用活血生肌方治疗12 年，应用活血生肌中药灌洗联合封闭式负压引流治疗压疮等难治性创面[5-6]，疗效显著。其中黄芪具有益气升阳、托毒生肌之效，方中重用为君药；
当归、丹参化瘀通络，白芷辛温通窍、溃脓止痛，白及活血生肌，共为臣药；
辅以红花、乳香、没药为佐药，增活血化瘀之功；
甘草调和诸药，滋润肌肤，诸药合用，共奏活血行气、化瘀生肌之效。研究表明，活血生肌方的方药组份黄芪、当归、丹参等具有调节MMP-9、TIMP-1 表达，促进血管新生作用[7-8]。本实验结果显示，治疗组在使用活血生肌方外用3 d 后，压疮组织中MMP-9 含量明显降低，同时TIMP-1 的含量提高；
使用活血生肌方外用5 d 后，胶原蛋白及胶原纤维的表达也均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。
综上所述，活血生肌方对压力性损伤的良性影响，可能是通过调节创面MMP-9 及TIMP-1 表达水平，以减少胶原蛋白的降解，进而促进压疮组织的愈合。但肉芽组织由细胞及细胞外基质组成，此实验只表明其能阻止ECM 过度降解，但活血生肌方能否促进组织中细胞生长还有待于进一步深入研究。
猜你喜欢 凡士林纱条生肌 牵伸对纱条条干不匀影响的模拟研究纺织学报(2021年6期)2021-06-30Advances in the Study on "Simmering Pus and Forming Flesh" in Treating Anorectal Diseases by External Treatment in Traditional Chinese MedicineWorld Journal of Integrated Traditional and Western Medicine(2020年8期)2020-12-28宫腔纱条填塞法治疗中央型前置胎盘剖宫产术中大出血西南国防医药(2016年7期)2016-12-01细辛纱条在痔疮术后换药的应用中国民间疗法(2016年6期)2016-01-30自制生肌玉红膏联合中药坐浴治疗肛裂临床疗效观察中外医疗(2015年16期)2016-01-04凡士林10个意想不到的妙用伴侣(2015年2期)2015-09-10象皮对体外培养成纤维细胞作用研究中国中医基础医学杂志(2015年9期)2015-04-14双极电凝联合五黄油纱条鼻腔填塞治疗鼻出血的效果中国当代医药(2015年32期)2015-03-01好用不过凡士林孩子(2014年3期)2014-03-13复方生肌玉红膏外敷促进混合痔术后创面愈合140例中医研究(2013年11期)2013-03-11
