基于脂质代谢组学研究芪参益气滴丸保护高脂血症心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌损伤的机制*

赵聪娜，罗洋，冯利民

（1．天津市北辰区中医医院，天津 300400；
2．天津中医药大学第二附属医院，天津 300250）

随着人们生活方式和饮食习惯的变化，缺血性心脑血管疾病发病率呈逐年增高的趋势，其中急性心肌梗死的防治一直是医学研究领域的热点，虽然经皮冠状动脉介入治疗可迅速恢复心肌血氧供应，但常伴随着心肌缺血再灌注损伤[1]，目前尚无很好的治疗策略。芪参益气滴丸主要由黄芪、丹参、三七、降香油等组成，用于治疗气虚血瘀型胸痹，研究报道其对心肌梗死及其再灌注有明显疗效[2]，人们对其作用机制也进行了较为系统的研究[3]。然而冠心病常伴有高血脂状态，该状态下伴发的心肌组织脂质代谢异常与心肌缺血再灌注损伤密切相关[4]，目前尚缺少芪参益气滴丸对心肌缺血再灌注脂质代谢影响的相关研究。本研究拟利用高脂血症心肌缺血再灌注损伤大鼠模型，考察芪参益气滴丸对心肌缺血再灌注损伤大鼠脂质代谢的影响，以期为进一步明确芪参益气滴丸的药效特点及机制提供一定线索。

1.1 实验动物 雄性清洁级SD大鼠，体质量220～250 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号SCXK（京）2016-0002。

1.2 药物与试剂 芪参益气滴丸由天津天士力制药集团股份有限公司提供（批号：181110）；
高脂饲料购于北京华阜康生物科技股份有限公司（批号：H10060）；
CK、LDH、低密度脂蛋白（LDL）、总胆固醇（TC）以及高密度脂蛋白（HDL）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所（批号：20190604、20190528、20190528、20190610、20190605）。

1.3 实验仪器 Q-Exactive Plus质谱仪（Thermo Scientific）；
UHPLC Nexera LC-30A超高效液相色谱仪（SHIMADZU）；
色谱柱（Waters，ACQUITY UPLC CSH C18，1．7 μm，2．1 mm×100 mm）。

2.1 心肌缺血再灌注损伤模型的复制及动物分组给药 所有实验大鼠在适应性喂养3 d后，给予高脂饲料喂养以复制高血脂症大鼠模型，实验设置假手术组（Sham组）、模型组（Mod组）、芪参益气滴丸低、中、高（QSYQL 组 62．5mg/kg，QSYQM 组 135mg/kg，QSYQH组270 mg/kg）剂量组，其中中剂量为等效剂量系数折算法换算所得临床等效剂量。药物治疗组每日灌胃给予不同剂量芪参益气滴丸，假手术组和模型组灌胃等体积蒸馏水，高脂饲料喂养2周时开始给药干预，同时继续高脂饮食饲养1周后，采用结扎冠状动脉左前降支的方法复制心肌缺血再灌注模型：手术当日给药1 h后，麻醉并仰卧位固定，在胸骨左缘0．5 cm处横向剪开胸部皮肤，沿第四、五肋间开胸，钝性分离胸肌，在左心耳和动脉圆锥之间，左前降支起始部位以下3～4 mm处以7．0带线缝合针结扎冠状动脉左前降支，逐层缝合，术后5 min采用生理记录仪检测大鼠心电图，以ST段显著上升或降低确定模型成功。剔除不成模动物，每组保留8只，假手术组只穿线不结扎。于冠状动脉结扎1 h后再灌注，再灌注3 h后深度麻醉，取材。

2.2 血清心肌酶及血脂检测 再灌注3 h后，麻醉实验动物并腹主动脉取血，室温静置30 min后采用低温离心机（离心半径13．5 cm）3 000 rpm离心15 min，取上层血清，于-80℃保存备用。按照试剂盒说明书步骤，检测各组大鼠血清心肌损伤指标CK和 LDH 含量以及血脂（LDL、TC、HDL）水平。

2.3 心肌缺血面积检测 腹主动脉取血后，取心脏组织，生理盐水清洗，去除心房，于结扎线下沿心脏横轴将心脏平均切成5片，放入1% TTC，37℃避光孵育10 min左右染色，正常心肌颜色为红色，缺血心肌为白色，根据染色结果用图像分析软件计算心肌缺血面积占心肌总面积百分比，评价芪参益气滴丸对心肌缺血面积的影响。

2.4 心脏脂质组学研究 1）心肌组织处理：每样等量称取30 mg心脏组织，加入200 μL水和800 μL甲基叔丁基醚（MTBE）涡旋混合，14 000×g 10℃离心15 min，全部取出上层有机相，氮气吹干，质谱分析时加入 200 μL 90%异丙醇/乙腈溶液复溶，14 000×g 10℃离心15 min，取2 μL上清进样分析。2）色谱条件：样品采用 UHPLC Nexera LC-30A超高效液相色谱系统进行分离，柱温30℃，流速0．3 mL/min。流动相组成A：10 mM甲酸铵乙腈水溶液（乙腈∶水=6∶4，V/V）；
B：10 mmol/L 甲酸铵乙腈异丙醇溶液（乙腈∶异丙醇=1∶9，V/V），梯度洗脱。3）质谱条件：分别采用电喷雾电离（ESI）正离子和负离子模式进行检测，样品经UHPLC分离后采用Q Exactive plus质谱仪进行质谱分析。正离子MS1扫描 m/z范围：200～1 800 Da，加热温度：300℃，鞘气流速：45 arb，辅助气流：15 arb，吹扫气流：1 arb，透镜电压：50%，喷雾电压：3．0 kV。负离子MS1扫描m/z范围：250～1 800 Da，加热温度300℃，鞘气流速：45 arb，吹扫气流：1 arb，透镜电压：60%，喷雾电压2．5 kV。4）数据处理：采用 LipidSearch软件（Thermo Scientific，4．1版本）进行峰识别、脂质鉴定、峰提取、峰对齐以及定量等处理。提取得到的数据，删除RSD＞30%的脂质分子。对LipidSearch提取得到的数据，删除组内缺失值＞50%的脂质分子，对数据进行总峰面积归一化。将得到的包含保留时间、质荷比、样品名称和峰面积的数据矩阵输入SIMCA-P 13．0软件，进行最小二乘判别分析（PLSDA）的多元统计分析。

2.5 统计学方法 应用SPSS17．0统计软件进行处理，实验结果以均数±标椎差（±s）表示，采用单因素方差分析组间差异，P＜0．05为差异具有统计学意义。

3.1 芪参益气滴丸保护高脂血症心肌缺血再灌注大鼠心肌损伤 采用酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒检测了血清中心肌损伤相关酶CK和LDH含量，结果如表1所示，与Sham组相比，Mod组大鼠血清CK和 LDH 明显升高（P＜0．05），梗死面积较为明显。而与Mod组相比，QSYQL和QSYQM组大鼠血清中CK 水平显著降低（P＜0．05），LDH 有降低趋势（P＞0．05），QSYQM 组梗死面积显著减小（P＜0．05），提示芪参益气滴丸具有保护高脂血症缺血再灌注心肌损伤的作用。

表1 芪参益气滴丸对缺血再灌注大鼠心肌保护作用（±s）Tab.1 Protective effect of Qishen Yiqi Dropping Pills on myocardium in ischemia-reperfusion rats（±s）

表1 芪参益气滴丸对缺血再灌注大鼠心肌保护作用（±s）Tab.1 Protective effect of Qishen Yiqi Dropping Pills on myocardium in ischemia-reperfusion rats（±s）

注：与 Sham 组相比，*P＜0．05，与 Mod 组相比，#P＜0．05。

组别 动物数 C K（U/m L） L D H（m m o l/L） 梗塞面积（%）S h a m 组 8 2．1 3±0．2 0 8 0 4 1±1 6 8 3 -M o d 组 8 2．6 6±0．3 5* 9 9 1 7±1 1 8 4* 3 4．3± 7．4 Q S Y Q L 组 8 1．7 7±0．5 0# 9 1 8 4±1 9 2 7 3 3．3±1 0．7 Q S Y Q M 组 8 2．0 8±0．6 8# 9 3 1 8±1 8 4 4 2 0．2± 4．7#Q S Y S H 组 8 2．7 8±0．9 3 9 6 5 0±1 7 9 9 2 5．3±1 5．5

3.2 芪参益气滴丸对高脂血症心肌缺血再灌注大鼠血脂的影响 在明确芪参益气滴丸具有保护高脂血症心肌缺血再灌注大鼠心肌损伤作用的基础上，采用ELISA试剂盒考察了芪参益气滴丸对高脂血症心肌缺血再灌注大鼠血清LDL、HDL以及TC的影响，结果如表2所示，与Sham组相比，Mod组大鼠血清 LDL、TC 显著升高（P＜0．05），HDL 有降低趋势（P＞0．05）；
与 Mod组相比，QSYQ 组大鼠血清TC 显著降低，治疗各组 HDL 均显著升高（P＜0．05），提示芪参益气滴丸对高脂血症心肌缺血再灌注大鼠血脂具有一定调节作用。

图1 芪参益气滴丸对模型大鼠梗塞面积的影响Fig.1 Effect of Qishen Yiqi Dropping Pills on the infarct area in model rats

表2 芪参益气滴丸对高脂血症心肌缺血再灌注大鼠血脂的影响（±s）Tab.2 Effect of Qishen Yiqi Dropping Pills on blood lipid of myocardial ischemia reperfusion in hyperlipidemia（±s）mmol/L

表2 芪参益气滴丸对高脂血症心肌缺血再灌注大鼠血脂的影响（±s）Tab.2 Effect of Qishen Yiqi Dropping Pills on blood lipid of myocardial ischemia reperfusion in hyperlipidemia（±s）mmol/L

注：与 Sham 组相比，*P＜0．05，与 Mod 组相比，#P＜0．05。

组别 动物数 LDL HDL TC Sham 组 8 0．54±0．23 1．25±0．20 2．82±1．14 Mod 组 8 0．63±0．31* 1．02±0．18 3．32±1．95*QSYQL 组 8 0．71±0．18 1．26±0．30# 2．75±0．41 QSYQM 组 8 0．66±0．17 1．19±0．35 2．44±0．59#QSYSH 组 8 0．59±0．20 1．44±0．65# 2．40±0．33

3.3 芪参益气滴丸对高脂血症心肌缺血再灌注大鼠心脏脂质成分及含量的影响 采用LipidSearch对正、负离子模式下得到的数据进行分析，共鉴定出脂质亚类32种，脂质分子1 141种（图2A）。脂质亚类相对含量分析结果显示，与Sham组相比，Mod组大鼠心脏中神经酰胺（Cer）、双糖基神经酰胺（CerG2）、糖基神经酰胺（CerG2GNAc1）、辅酶（Co）、甘油二酯（DG）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PIP）、鞘氨醇（So）等含量显著降低（P＜0．05），而脂肪酸（FA）、神经节苷脂（GM3）、溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）、溶血磷脂酰丝氨酸（LPS）以及硫代异鼠李糖甘油二酯（SQDG）等亚类的含量显著升高（P＜0．05）；
而与 Mod 组相比，QSYQM 组大鼠心脏中 Cer、CerG2GNAc1、Co、LPC 以及 So 等亚类的含量显著升高（P＜0．05）见图2B-C，初步揭示芪参益气滴丸具有改善高脂血症心肌缺血再灌注大鼠心脏脂质代谢紊乱的作用。

图2 芪参益气滴丸对心肌缺血再灌注大鼠心脏脂质代谢的影响Fig.2 Effects of Qishen Yiqi Dropping Pills on cardiac lipid metabolism in myocardial ischemia-reperfusion rats

3.4 芪参益气滴丸对高脂血症心肌缺血再灌注大鼠心脏脂质分子的影响 LS-DA分析显示，各组样本代谢谱分离度较高，提示组间脂质代谢谱差异明显（图3A，C）。为了确保模型的可靠性，经7次循环交互验证以获取模型的R2和Q2值。模型参数如下：R2Y（cum）=0．951，Q2（cum）=0．954，均大于0．5且接近于1，表明模型越稳定可靠，充分提取了组间的差异信息，具有良好的解释率和预测能力。为避免有监督模型在建模过程中发生过拟合，使用置换检验通过随机多次（n=200）改变分类变量Y的排列顺序对模型进行检验以保证模型的有效性，置换检验参数R2Y（cum）=0．0，0．91，Q2（cum）=0．0，0．063，表明模型不存在过拟合现象（图3B，D），模型可以很好地解释各组样本间的差异。

图3 各组PLS-DA得分图和置换检验拟合图Fig.3 PLS-DA score plots and displacement test fit plots for each group

筛选差异性脂质分子：根据PLS-DA模型得到的VIP来衡量各脂质的表达模式对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，挖掘具有生物学意义的差异脂质。Mod组和Sham组筛选的差异性脂质分子（P＜0．05，且 VIP＞1．0）共有 44 种，其中 4 种脂质分子显著升高[LPE（16∶0）、LPE（18∶1）、LPE（18∶0）、FA（22∶6），P＜0．05]，显著降低的脂质分子有 40 种，主要包括 15种 PE、4种 LPC、2种 Cer、14种 PC、3种SM、Co以及DG；
QSYQM组和Mod组有差异脂质分子 13种，包括 5种 PC、2种 LPC、3种 PE、Cer、LPE以及TG。其中芪参益气滴丸治疗后与Mod组出现显著相反趋势的脂质分子有6种（P＜0．05，且VIP＞1．0），分别为 Cer（d18∶1/18∶0）+H、PE（16∶0p/22∶4）+H、PE（18∶2p/18∶2）+H、LPC（18∶0）+H、LPC（18∶0）+Na 以及 PC（16∶0/18∶1）+HCOO，提示芪参益气滴丸通过调节心脏Cer、PE、LPC等脂质分子发挥保护高脂血症心肌缺血再灌注大鼠的心肌损伤。见图4。

图4 芪参益气滴丸对高脂血症心肌缺血再灌注大鼠心脏脂质分子的影响Fig.4 Effect of Qishen Yiqi Dropping Pills on lipid molecules in cardiac ischemia reperfusion in rats with hyperlipidemia

近年大量研究表明心肌组织脂质代谢异常与心肌缺血再灌注损伤密切相关，急性心肌缺血缺氧状态下导致心肌能量代谢由脂肪酸代谢而转化为以葡萄糖代谢为主，从而加速了糖酵解，降低了细胞 pH 值、钾（K+）外排、钙（Ca2+）积累、腺苷形成、细胞肿胀和破裂、细胞凋亡和死亡[5]。再灌注复氧期间，当血流恢复时，氧气水平也随着再灌注而恢复，脂肪酸β-氧化迅速恢复，并成为线粒体氧化代谢的主要途径[5-6]，葡萄糖氧化率的大幅降低。心脏脂肪酸β-氧化率总体增加，导致脂质代谢异常，启动并诱发各种代谢通路激活，加重心肌损伤[7]。芪参益气滴丸是临床常用于治疗心肌梗死的有效药物[8-10]，但缺少芪参益气滴丸对心肌缺血再灌注脂质代谢影响的相关研究。本研究模拟临床高血脂状态，从脂质代谢调节角度进一步丰富完善了芪参益气滴丸的现代作用机制，有利于更好的指导其临床应用。

本研究在证实芪参益气滴丸改善心肌缺血再灌注损伤作用的基础上，采用基于UPLC-Orbitrap质谱系统的非靶向脂质组学分析平台对心肌缺血再灌注模型大鼠进行了心脏脂质代谢谱及脂质代谢标志物动态变化规律研究。通过脂质亚类结果分析，初步明确了芪参益气滴丸具有改善高脂血症心肌缺血再灌注损伤大鼠心脏脂质代谢的作用。进一步差异脂质分子筛选结果显示，芪参益气滴丸可以降低模型组大鼠心肌组织脂肪酸FA（22∶6）-H水平，提示在心肌组织中脂肪酸氧化降低，脂质堆积，而芪参益气滴丸能够减低心肌组织脂肪堆积。PC是细胞膜脂质双层结构的主要成分，本实验结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠心肌组织4种LPC、14种PC含量显著降低，其原因可能是在心肌缺血再灌注过程中，心肌细胞膜磷脂酰胆碱发生降解。而与模型组比较，芪参益气滴丸治疗组大鼠心脏中 LPC（18∶0）+H、LPC（18∶0）+Na、PC（39∶4）+H、PC（16∶0/18∶1）+HCOO 含量显著升高，提示芪参益气滴丸对心肌细胞膜脂质降解具有改善作用。另外，与假手术组相比，模型组大鼠心肌组织2种神经酰胺以及辅酶 Co（Q9）+H、DG（34∶2p）+H 含量显著降低，提示在心肌缺血再灌注过程中脂质代谢障碍不仅使脂肪酸进入β氧化减少，而且转化成神经酰胺及甘油二酯也出现障碍。与模型组比较芪参益气滴丸治疗组大鼠心脏 Co（Q9）+H、Cer（d18∶1/18∶0）+H 显著升高，提示芪参益气滴丸具有改善心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织中脂质分子向神经酰胺及甘油二酯转化的作用。

综上所述，本研究模拟临床高血脂病理状态，在明确芪参益气滴丸改善心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌损伤作用的基础上，采用脂质代谢组学技术阐明了芪参益气滴丸对心肌缺血再灌注损伤大鼠心脏脂质代谢的影响，发现了芪参益气滴丸通过改善心肌细胞膜脂质降解以及脂质分子向神经酰胺及甘油二酯转化的作用机制，进一步丰富了其保护心肌损伤的作用机制，同时为其临床应用提供了新依据。

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