紫色杆菌素的生物活性及其对草鱼的保鲜效果

郜彦彦，魏明珠，陈晨，赖运玲，熊建华，张凤英*

（1.江西农业大学食品科学与工程学院，江西 南昌 330045；
2.厦门海关技术中心，福建 厦门 361013）

草鱼生长迅速、肉质鲜嫩肥美、经济实惠，是中国“四大家鱼”之一，也是世界上养殖产量最大的水产养殖品种[1]。草鱼肉营养丰富，蛋白质和水分含量高，且含有多种不饱和脂肪酸[2]，在加工贮运过程中极易受腐败微生物的影响，发生蛋白质和脂肪氧化酸败[3]等问题，即使在冷藏条件下，鱼肉也极易腐败变质，因此对草鱼的保鲜进行研究尤为重要。传统的聚乙烯（polyethylene，PE）或聚丙烯塑料食品包装虽能在一定程度上阻隔空气达到保鲜的目的，但无法从源头阻止细菌滋生。通过在食品成膜基质中添加防腐剂、抗氧化剂等功能性物质赋予膜抑菌和抗氧化性能，用于延缓淡水鱼的腐败变质在国内外已有研究。杨福馨等[4]通过添加柚皮浆、植物精油到保鲜膜成膜基质中增强了对草鱼鱼肉的保鲜效果；
梅佳林[5]研究表明添加芳樟醇的复合保鲜膜可以有效抑制三文鱼源莓实假单胞菌的生长；
Webber等[6]研究指出，含 0.89 μg/cm2乳链球菌素的复合膜能够有效杀灭耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

紫色杆菌素（violacein，Vio）是微生物产生的一种天然蓝紫色素，以两个色氨酸分子氧化缩合而成，属于吲哚衍生物[7]，具有多种生物活性，包括抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗紫外线等，在食品、化妆品、医药、印染等领域有着广泛的应用前景。随着紫色杆菌素产量的上升，紫色杆菌素的高生物功能活性和低毒副作用的特性被众多研究者关注，并予以开发利用，如天然食用色素[8]、防腐剂[9]、抗菌性纺织品[10]、可降解蓝色油墨[11]、抗紫外线口红[12]、治疗痤疮的软膏[13]等。但是将紫色杆菌素作为防腐剂添加到成膜基质中制备具有抑菌和抗氧化功能的复合保鲜膜却鲜有报道。本试验研究紫色杆菌素的稳定性和生物活性，并以聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）为基础制备膜液，添加紫色杆菌素，制备聚乙烯醇/紫色杆菌素（PVA/Vio）复合保鲜膜，并测定膜的抑菌和抗氧化活性，以及其在4℃冷藏条件下对草鱼的保鲜效果，以期为紫色杆菌素进一步开发利用和水产品保鲜提供参考依据。

1.1 材料与试剂

草鱼：市售，约2 kg一尾；
紫色杆菌素（纯度85%以上）：美国GlpBio公司。

大肠杆菌ATCC 35218、沙门氏菌ATCC BAA708、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、化脓性链球菌ATCC 19615：江西农业大学食品微生物学实验室保存；
单增李斯特菌ATCC 19115、蜡样芽孢杆菌ATCC 14579：上海嘉楚生物工程有限公司。

聚乙烯醇、甲基纤维素、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸：麦克林试剂有限公司；
2，6-二叔丁基对甲酚（butylated hydroxytoluene，BHT）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2"-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 [2，2"-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、2，4，6-三吡啶基三嗪[2，4，6-tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ]、过硫酸钾：美国Sigma公司；
酵母粉、胰蛋白胨、氯化钠、琼脂粉、LB培养基：上海生工生物工程股份有限公司；
以上所有化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器和设备

Spcord200紫外可见分光光度计：德国耶拿分析仪器股份公司；
GL-21M高速冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；
SpectraMax M2多功能酶标仪：美国Molecular Devices公司；
BILON-08拍击式均质机：上海比朗仪器制造有限公司；
SW-CJ洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；
pHS-3E pH计：上海佑科仪器仪表有限公司；
SHP-160型生化培养箱：上海三发科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫色杆菌素的稳定性研究

将紫色杆菌素水溶液pH值调节至7，使用紫外可见分光光度计在300 nm～800 nm波长下进行扫描，使其在最佳吸收波长575 nm处的吸光值为0.4左右，即紫色杆菌素工作液。在热稳定性测试中，将紫色杆菌素工作液分别置于 0、20、40、60、80、100 ℃水浴中孵育2 h后，冰浴冷却，测定其在575 nm处吸光值，以0℃时的吸光值为起始吸光值。在pH值稳定性测试中，将紫色杆菌素工作液用HCl和NaOH调节pH值分别至1～10，30℃静置2 h，冰浴冷却，测定其在575 nm处吸光值，以pH7时的吸光值为起始吸光值。吸光值下降率[14]按下式计算。

吸光值下降率/%=（A0-A）/A0×100

式中：A0为紫色杆菌素的起始吸光值；
A为处理后的吸光值。

1.3.2 紫色杆菌素的最小抑菌浓度和最低杀菌浓度

参考Diao等[15]的方法，采用倍比稀释法测定最小抑菌浓度（minimal inhibition concentration，MIC），在无菌96孔板中采用二倍法将紫色杆菌素用生理盐水稀释成 100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78 mg/L的溶液，向各孔中同时加入1×107CFU/mL的指示菌100 μL，以 100 μL 生理盐水为阴性对照，摇匀，37 ℃培养24 h后对各孔进行检查，对照管中菌呈现浑浊状生长，溶液开始出现澄清的最低浓度确定为紫色杆菌素的MIC值，高于MIC值的进行平板菌落计数，菌落数小于5个的最低样品浓度确定为最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）。

1.3.3 紫色杆菌素的抗氧化活性

1.3.3.1 ABTS+自由基清除能力

ABTS+自由基清除率测定参照Erel[16]的方法并稍作改动。配制2.45 mmol/L过硫酸钾水溶液和7.0 mmol/L ABTS溶液，避光反应16 h，即ABTS母液。用去离子水稀释ABTS母液，使其在734 nm处的吸光值为0.70左右，即ABTS工作液。分别吸取200 μL浓度为1.00、2.50、5.00、12.50、25.00 mg/L 的紫色杆菌素溶液，加入2.0 mL ABTS工作液，混匀后25℃避光反应20 min，于734 nm处测定吸光值，以抗氧化剂BHT为对照，计算样品对ABTS+自由基的清除率。

ABTS+自由基清除率/%=[1-（A样品-A对照）/A空白]×100

式中：A样品为添加样品的反应体系的吸光值；
A对照为以去离子水替代ABTS溶液的反应体系的吸光值；
A空白为以去离子水替代样品的反应体系的吸光值。

1.3.3.2 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除率测定参照Sharma等[17]的方法并稍作改动。分别吸取2.0 mL浓度为2.50、5.00、12.50、25.00 mg/L的紫色杆菌素溶液，加入2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH-无水乙醇溶液中，混匀，25℃避光反应30 min，于517 nm处测定吸光值，以抗氧化剂BHT为对照，计算样品对DPPH自由基的清除率。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A样品-A对照）/A空白]×100

式中：A样品为添加样品的反应体系的吸光值；
A对照为以无水乙醇替代DPPH的反应体系的吸光值；
A空白为以无水乙醇替代样品的反应体系的吸光值。

1.3.3.3 总还原能力测定

总还原能力的测定采用Pulido等[18]的铁离子还原能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）方法并稍作改动。FRAP工作液配制：将2.5 mL 0.01 mol/L TPTZ溶液、25.0 mL 0.3 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液（pH3.6）与2.5 mL 0.02 mol/L FeCl3溶液混合，现用现配。

标准曲线制作：吸取0.5 mL浓度分别为0.025、0.100、0.150、0.200、0.400、0.500、0.800 mmol/L 的 FeSO4溶液与3.0 mL FRAP工作液混匀，37℃保温15 min后于593 nm处测定吸光值。以反应体系中FeSO4的浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程为 y=3.695x+0.006，R2=0.995。

样品总还原能力测定：分别吸取0.5mL浓度为2.50、5.00、12.50、25.00 mg/L紫色杆菌素样品加入3.0 mL FRAP工作液，37℃反应15 min后于593 nm处测定吸光值，记为A样品；
测定以去离子水替代样品的反应体系在593 nm处的吸光值，记为A空白；
测定以去离子水替代FRAP工作液的反应体系在593 nm处的吸光值，记为 A对照；
计算 A样品-A空白-A对照，并在标准曲线上获得相应的FeSO4浓度，评估总还原能力。

1.3.4 PVA/Vio膜的制备

参考杨萍萍等[19]的方法并稍作改动，将3 g PVA和1 g甲基纤维素溶于100 mL去离子水中，并在90℃水浴搅拌1 h，随后向该溶液中加入1 g甘油，90℃水浴加热搅拌均匀，即得PVA基础膜液，在基础膜液中加入1 mL紫色杆菌素，使其终浓度为15.00 mg/L，超声去泡，将膜液倒至平整的玻璃板上流延均匀，置于60℃烘箱12 h成膜，揭膜后保存，即得PVA/Vio膜，未添加紫色杆菌素的为PVA膜。

1.3.5 PVA/Vio膜的抑菌和抗氧化活性

参考郑燕等[20]的方法，将75 mg膜样品过夜溶解于6 mL离子水中，按照1.3.3的方法测定PVA膜和PVA/Vio膜的抗氧化活性。采用杨萍萍等[19]的PVA复合膜抑菌圈试验测定膜对金黄色葡萄球菌的抑菌效果。具体方法：用打孔器制作直径为9 mm的膜片，紫外杀菌后备用。活化后的菌液经稀释（约103CFU/mL）后均匀涂布至LB培养基上，夹取PVA和PVA/Vio膜片置于培养基平板上，37℃培养24 h，测量抑菌圈的直径。

1.3.6 PVA/Vio膜对草鱼的保鲜评价

将鲜活草鱼致死后去头、尾、鳞和内脏，剔除鱼骨并均匀切割成每块100 g，用PVA膜和PVA/Vio膜全包裹鱼肉，放置于无菌袋中，空白（CK）组为普通的PE保鲜膜包裹，置于（4±2）℃冰箱，分别于 0、2、4、6、8、10 d取样测定相关指标。

1.3.6.1 菌落总数的测定

按照GB/T 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数的测定》测定，将鱼肉样品用量修改为10.0 g，按照水产品培养要求在（30±1）℃条件下培养（72±3）h后进行菌落计数，单位为lg（CFU/g）。

1.3.6.2 硫代巴比妥酸反应物 （thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值的测定

按照白婵等[21]的方法测定TBARS值。称取5.0 g鱼肉样品加入25 mL质量浓度为7.5%的三氯乙酸，均质1 min，双层滤纸过滤，取5 mL上清液加入5 mL 0.02 mol/L的2-硫代巴比妥酸溶液，100℃水浴30 min后，冷却至室温。取5 mL溶液，加入5 mL氯仿摇匀静置分层，然后取上清液测定532、600 nm处吸光值，TBARS值以1 kg鱼肉样品中所含丙二醛质量（mg）表示。TBARS值计算公式如下。

TBARS值/（mg/kg）=（A532-A600）×9.24/w

式中：A532、A600为样品在 532、600 nm 处的吸光值；
w为鱼肉样品质量，g；
9.24为常数。

1.4 数据处理和统计分析

所有试验均进行3次平行，通过SPSS Statistics 20.0软件对所得数据进行统计分析，并计算自由基清除能力的IC50值，使用Origin 8.0软件作图。

2.1 紫色杆菌素稳定性研究

2.1.1 热稳定性

温度对紫色杆菌素稳定性的影响见图1。

图1 温度对紫色杆菌素稳定性的影响Fig.1 Effect of temperature on the stability of violacein

由图1可知，温度升高对紫色杆菌素的影响并不明显，在温度≤80℃时紫色杆菌素吸光值变化不显著，下降率不足5%，但是当温度为100℃时，吸光值下降了12%，说明紫色杆菌素在0℃～80℃条件下性质稳定。因此，在加工利用过程中，应尽量避免100℃高温处理对紫色杆菌素稳定性带来的不利影响。

2.1.2 pH值稳定性

pH值对紫色杆菌素稳定性的影响见图2。

图2 pH值对紫色杆菌素稳定性的影响Fig.2 Effect of pH value on the stability of violacein

由图2可知，pH值为1～9时，紫色杆菌素吸光值变化不显著；
pH值为10时，吸光值略有下降，但是下降率不足5%，说明酸碱环境对紫色杆菌素的影响较小。这可能是由于紫色杆菌素结构较简单，在酸碱条件下不易发生不可逆的转变。因此，在利用紫色杆菌素开发产品时，pH值的条件可以适当放宽。

2.2 紫色杆菌素的抑菌活性

紫色杆菌素的抑菌活性如表1所示。

表1 紫色杆菌素的抑菌活性Table 1 Antibacterial activities of violacein

由表1可知，紫色杆菌素对金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌有较好的抑菌效果，最小抑菌浓度分别为 3.13、6.25、12.50、6.25 mg/L，最低杀菌浓度分别为 12.50、12.50、25.00、25.00 mg/L，对革兰氏阴性菌（沙门氏菌、大肠杆菌）没有抑菌活性。试验结果与Cazoto等[22]和Dodou等[23]的研究结果相一致，紫色杆菌素对革兰氏阳性菌抑菌效果良好，对革兰氏阴性菌影响较小。另外，Sasidharan等[24]的研究还发现紫色杆菌素也可以有效地抑制致病真菌以及酵母的增殖，如扩展青霉、黄曲霉、白色念珠菌、红色毛藓菌、尖镰孢菌、立枯丝核菌。

2.3 紫色杆菌素的体外抗氧化活性

2.3.1 ABTS+自由基清除能力

ABTS是一种水溶性的自由基引发剂，经氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基，当遇到具有抗氧化活性的物质时，ABTS+自由基会被还原，溶液颜色变浅[25]。紫色杆菌素和对照BHT对ABTS+自由基的清除作用测定结果见图3。

图3 紫色杆菌素和BHT对ABTS+自由基的清除作用Fig.3 ABTS+radical scavenging activities of violacein and butylated hydroxytoluene

由图3可知，当浓度大于5.00 mg/L时，紫色杆菌素和BHT的ABTS+自由基清除率均大于95%，两者的抗氧化能力相当，进行线性拟合可得紫色杆菌素清除ABTS+自由基的IC50为1.64 mg/L，由此可见紫色杆菌素具有极强的ABTS+自由基清除能力。

2.3.2 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一种稳定的顺磁化合物，其结构中含有1个孤对电子，若自由基清除剂存在时，DPPH自由基接受一个电子，配对形成稳定的DPPH-H化合物，使其颜色由深紫色褪至黄色，目前已被广泛应用于物质的抗氧化特性评价中[25]。紫色杆菌素和BHT对DPPH自由基的清除作用测定结果见图4。

图4 紫色杆菌素和BHT对DPPH自由基的清除作用Fig.4 DPPH radical scavenging activity of violacein and butylated hydroxytoluene

如图4所示，随着浓度的增大两种抗氧化剂对DPPH自由基的清除能力均成上升趋势，且紫色杆菌素的DPPH自由基清除能力高于BHT。紫色杆菌素浓度为12.50 mg/L时DPPH自由基清除率为46.35%，是BHT的DPPH自由基清除率的2.44倍，紫色杆菌素清除DPPH自由基的IC50为14.72 mg/L，由此可见紫色杆菌素具有极强的DPPH自由基清除能力。

2.3.3 总还原能力

FRAP法测定总还原能力的原理是Fe3+被具有抗氧化活性的物质还原成Fe2+，与TPTZ形成蓝色复合物，从而使吸光值发生变化[25]。紫色杆菌素和阳性对照BHT的总还原能力测定结果见图5。

图5 紫色杆菌素和BHT的总还原能力Fig.5 Total reduction ability of violacein and butylated hydroxytoluene

由图5可知，紫色杆菌素和BHT总还原能力随着浓度的增大而增强，且紫色杆菌素的总还原能力优于BHT。当浓度为12.50 mg/L时，紫色杆菌素的总还原能力（88.49 μmol/L）是 BHT（56.47 μmol/L）的 1.57 倍，说明紫色杆菌素具有良好的总还原能力。

2.4 PVA/Vio膜抑菌和抗氧化活性

微生物的生长以及脂质氧化是引起食物腐败变质的重要原因，在食品包装材料中添加防腐剂和抗氧化剂有望成为抑制食品中细菌过度繁殖和脂质氧化的重要手段之一[26]。添加15.00 mg/L紫色杆菌素的PVA/Vio膜的抑菌和抗氧化活性见表2。

表2 PVA膜和PVA/Vio膜的抑菌和抗氧化活性Table 2 Antibacterial and antioxidant activities of the PVA film and PVA/Vio film

由表2可知，PVA/Vio膜的抑菌活性和抗氧化活性显著优于PVA膜，ABTS+自由基和DPPH自由基清除率分别达到72.04%和31.97%，总还原能力为44.20μmol/L，对金黄色葡萄球菌的抑制效果显著。试验中制备的PVA/Vio膜和谭瑞心等[27]制备的牛至精油羧甲基纤维素膜的抗氧化和抑菌活性结果相似，这说明紫色杆菌素的添加增强了PVA膜的抑菌和抗氧化活性。

2.5 PVA/Vio膜包裹草鱼TBARS值的变化

在水产品贮藏过程中，TBARS值表示脂质氧化形成次级产物的程度，可作为水产品脂肪氧化程度的评价指标[21]。一般当鱼肉TBARS值超过1.0 mg/kg时，脂质氧化程度加剧，产生的丙二醛和胺类物质增多，严重影响水产品感官品质和肉质，不建议食用[3]。4℃冷藏条件下不同膜包裹草鱼TBARS值的变化见图6。

图6 4℃冷藏条件下草鱼TBARS值的变化Fig.6 The variation in TBARS value of grass carp stored at 4℃

从图6可以看出，随着冷藏时间的延长，3组鱼肉的TBARS值均呈上升趋势，但PVA/Vio膜包裹的鱼肉TBARS值始终低于CK组（普通PE保鲜膜）和PVA组。冷藏第4天时，CK组和PVA组TBARS值分别达到1.12 mg/kg和1.06 mg/kg，超过建议食用限量值；
而PVA/Vio膜包裹的鱼肉冷藏第8天，其TBARS值为1.15 mg/kg，超过建议食用限量值。说明PVA/Vio膜处理能有效减缓鱼肉中的脂肪氧化速率，有利于草鱼的冷藏保鲜。

2.6 PVA/Vio膜包裹对冷藏草鱼菌落总数的影响

菌落总数是判定鱼类等水产品品质优劣和腐败程度的一个非常重要的指标，通常当菌落总数值超过6 lg（CFU/g）时，鱼肉腐败严重，无法食用[28]。4 ℃冷藏条件下不同膜包裹草鱼菌落总数的变化见图7。

图7 4℃冷藏条件下草鱼菌落总数的变化Fig.7 The variation in total viable count of grass carp stored at 4℃

从图7可以看出，草鱼在4℃冷藏条件下的初始菌落总数值为3.95 lg（CFU/g），与文献中报道的草鱼初始菌落总数较为一致[28]，说明草鱼在贮藏初期品质良好。随着贮藏时间的延长，不同膜包裹的鱼肉菌落总数均有所升高，但是PVA/Vio组的菌落总数值均低于CK组和PVA组。CK组和PVA组的草鱼菌落总数值在4℃下贮藏4 d后接近新鲜鱼片的菌落总数可接受限度值6 lg（CFU/g），而PVA/Vio组在贮藏8 d后接近6 lg（CFU/g），延长了4 d的货架期。可见添加紫色杆菌素的复合保鲜膜对草鱼冷藏过程中微生物的生长繁殖起到较好的抑制作用，有利于草鱼的冷藏保鲜。

紫色杆菌素是一种具有抑菌和抗氧化活性的天然色素，在pH1～10、0℃～80℃条件下性质稳定，具有很好的抑制革兰氏阳性菌和抗氧化的作用，对金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌的最小抑菌浓度分别为 3.13、6.25、12.50、6.25 mg/L，清除ABTS+自由基和DPPH自由基的IC50分别为1.64 mg/L和14.72 mg/L，浓度为12.50 mg/L时总还原力为88.49 μmol/L。以PVA为基础膜液，加入15.00 mg/L的紫色杆菌素制成的PVA/Vio膜具有较好的抑菌和抗氧化活性。PVA/Vio膜包裹的草鱼在4℃冷藏条件下的菌落总数和TBARS值均大幅低于PVA膜和普通的PE保鲜膜，延缓了草鱼的腐败变质，保鲜效果明显。

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