间充质干细胞治疗骨关节炎的研究进展
时间：2023-03-10 08:10:06 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
秦晶，吴敬智，刘馨，马波
骨关节炎（osteoarthritis，OA）指由多种因素引起关节软骨纤维化、皲裂、溃疡、脱失而导致的以关节疼痛为主要症状的退行性疾病，临床表现有关节疼痛及压痛、关节活动受限、关节畸形、骨摩擦音、肌肉萎缩等[1]。OA 的发病机制尚不明确，危险因素有肥胖、性别、年龄、遗传、既往的关节损伤以及代谢和内分泌疾病等[2]。
在传统的治疗方法中，早期 OA 采用非手术治疗，如运动治疗、物理治疗及药物治疗等，只能在一定程度上减轻疼痛、延缓病情；
终末期 OA 采用全关节置换术治疗，可以改善关节活动度，但是不能使关节恢复原始功能，并且术后并发症多。
随着再生医学的不断发展，越来越多的研究表明治疗 OA 的关键是阻止软骨和滑膜组织的免疫炎症以及软骨细胞过度凋亡的进程，促使软骨祖细胞再生、修复受损的软骨[3]。自体软骨细胞植入术（autologous chondrocyte implantation，ACI）[4]和自体骨软骨移植术（osteochondral autologous transplantation，OAT）被认为是关节软骨再生的有效疗法，但是有一些局限性：ACI 需要全身麻醉或局部麻醉（以收获软骨细胞和移植扩增细胞）进行两次膝关节手术、难以获得足够数量的软骨细胞、软骨细胞增殖速度慢等[4]；
OAT 受供体发病率、年龄等限制[5]。近年来，研究人员发现间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）没有以上局限性，不仅易于获取培养，而且治疗 OA 疗效显著，能缓解疼痛，改善功能，促进软骨恢复，提高患者生活质量。本文综述了各种来源的间充质干细胞治疗骨关节炎的临床前试验和临床研究进展。
MSCs 是具有自我更新和多向分化潜能的干细胞，主要存在于脂肪、骨髓、脐带、胎盘、牙髓、肌腱及其他组织中。国际细胞治疗学会给出 MSCs 的最低鉴定标准[6]：MSCs在标准培养条件下呈贴壁生长；
MSCs 表达 CD105、CD73和 CD90，不表达 CD45、CD34、CD14 或 CD11b、CD79a或 CD19、HLA II 表面标记；
在标准的体外分化条件下，MSCs 可以分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞。
MSCs 治疗 OA 的机制：①旁分泌：研究表明 MSCs参与组织修复的主要机制是通过旁分泌活性，产生多种具有各种特性的营养因子，减少组织损伤，增强组织修复[7]。Platas 等[8]研究发现脂肪来源的间充质干细胞（AD-MSCs）的条件培养基（CM）可能通过旁分泌作用对抗炎症应激诱导的 OA 软骨细胞的过早衰老，对退行性关节发挥保护作用。②降低炎症因子水平和趋化因子的浓度[9]。曹娟等[10]研究发现脐带间充质干细胞（UC-MSCs）治疗后兔血清炎性因子 IL-6、IL-8、MMP-3、MMP-13 水平较治疗前明显下降，证实了 UC-MSCs 对 OA 的软骨及滑膜具有保护作用，其与抑制炎症反应相关。③归巢调节：MSCs 会优先聚集在组织损伤和炎症部位。在治疗 OA 时，MSCs 能靶向传递到受损的关节软骨，抑制免疫介导的软骨破坏，并通过软骨分化和内在残余修复的旁分泌刺激促进软骨修复[11]。
近年来，越来越多的学者认为 MSCs 来源的外泌体是OA 的潜在治疗方案。细胞外囊泡（EV）是外泌体、微囊泡、逆转录病毒样颗粒（RHP）和凋亡体的混合群体[12]。外泌体是直径在 50～150 nm 之间的小脂质双层膜囊泡，它作为细胞间通讯载体，能够转移核酸（mRNA 和 miRNA）、蛋白质和生物活性脂质[13]。Tang 等[14]研究发现 hUC-MSCs衍生的外泌体和 hUC-MSCs 在抑制 OA 炎症反应和延缓OA 进展方面有着相似的作用。MSCs 来源的外泌体治疗OA 的机制[15]：①抑制炎症介质对软骨稳态的不良反应：抑制 OA 软骨细胞中 TNF-α 诱导的促炎性 NF-κB 信号传导；
②促进软骨再生：促进骨关节炎软骨细胞产生蛋白聚糖和 II 型胶原蛋白；
③减少软骨细胞凋亡：上调了 OA 软骨细胞中的 SOX9 和 WNT7A 表达。通过基因修饰可以提高外泌体治疗 OA 的疗效，研究表明源自 miR-140-5p、miR-155-5p 或 miR-92a-3p 过表达人 MSCs 的外泌体可以抑制骨关节炎鼠模型中的软骨细胞凋亡，增强软骨组织再生[16-19]；
Li 等[20]研究表明来自人 UC-MSCs 的外泌体通过 miR-100-5p/NOX4 轴抑制人关节软骨细胞中的活性氧（ROS）产生和细胞凋亡。
宋征和马璟[21]建议在进行临床前安全性评价时所选择的动物种属应该能对药物产生与人体类似的生物学反应，需考虑该种属动物与人体在生理和解剖学上的相似性。非人灵长类动物在生理学上与人类更接近，相比于其他模型提供的数据安全性更高，Zhao 等[22]报道了牙龈间充质干细胞（GMSC）体内输注对非人灵长类动物短期和长期毒性的数据，为后续临床试验的研究提供了参考。Chan 等[23]对同种异体 MSCs 进行常规毒性评价时发现静脉注射 MSCs 是安全的，不会引起治疗大鼠的血液学、生化和组织学发生显著变化。
2.1 生物分布
干细胞制剂作为新型治疗药物，与常规药物代谢不同，需考察其在体内的运输、归巢、扩增、分化以及存在于靶器官及非靶器官的持续能力[21]。目前评价干细胞制剂生物分布的方法有：实时荧光定量 PCR[24]、联合单光子发射 CT（SPECT）/CT[25]、磁共振成像（MRI）[25-26]、生物发光成像（BLI）[27]和基因转导 MSCs（编码绿色荧光蛋白eGFP）[28]等。Kraitchman 等[25]研究发现与 SPECT/CT 相比，MRI 的敏感性较低，且无创放射性核素成像非常适合动态跟踪 MSCs 到靶器官和非靶器官的生物分布和运输。
2.2 致瘤性
致瘤性评价是指临床前评价中药物引起动物形成（良性和恶性）肿瘤的风险[29]。冯波等[30]认为测试干细胞的端粒酶活性，分析结构特征，可以帮助了解细胞的遗传变异规律，并且通过克隆形成试验和动物成瘤试验，可以评估干细胞的致瘤风险。
Chow 等[31]发现犬诱导多能干细胞（iPSC）递送至免疫缺陷小鼠的侧腹，能观察到肿瘤生长；
而犬 iPSC 衍生的MSC（iMSC）在多次传代后保留了稳定的表型，在免疫缺陷小鼠中没有形成畸胎瘤，并且在全身注射后也没有诱导狗的肿瘤形成。Zhao 等[22]证明 GMSC 在用于治疗时不会导致遗传毒性和癌变。
冯波等[30]对裸鼠成瘤试验、克隆形成试验和端粒酶活性测定结果进行评估发现 hUC-MSCs 在裸鼠中不致瘤，克隆形成试验结果为阴性，端粒酶活性测定结果正常，具有良好的遗传稳定性。
胡宜等[32]认为移植骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）形成肿瘤的能力具有种属差异性。佟明华等[33]发现体外长时间培养大鼠 BM-MSCs 在 15 代以内移植入裸鼠体内没有成瘤性，但是体外培养传代次数的增多会增加成瘤性的风险。黄英华等[34]通过裸鼠体内成瘤性实验与 p53、Ki67 蛋白免疫组织化学染色得出结论：人 BM-MSCs 在体外可以有限传代，无显著恶性转化趋势。
Froelich 等[35]证实在人脂肪干细胞（ASCs）的长期培养过程中，经过连续传代可能发生染色体畸变。同时建议在将人 ASCs 用于干细胞治疗之前，必须评估和考虑它们促进恶性转化的潜力，甚至在临床应用中应避免 ASCs 的体外扩增。
2.3 免疫原性
免疫原性在干细胞制剂的安全性评价中常常是重要且困难的，虽然 MSCs 的免疫原性较低，但是为了提高安全性还是应该做免疫原性评估。Zhao 等[22]通过检查血清组胺水平发现 GMSC 移植对小猎犬的全身性过敏反应和大鼠的被动性过敏反应没有影响，且 GMSC 输注不会对自身免疫性关节炎或红斑狼疮的动物模型造成显著的副作用。Wang 等[36]使用人源化小鼠模型，证实了 ENO1 是人脂肪间充质干细胞（AD-MSCs）中潜在的免疫原性分子。同时，宋征和马璟[21]研究表明在临床前试验中采用免疫抑制的小鼠动物模型进行实验不能反映干细胞制剂在体内实际情况，在进行免疫原性评价时，需要关注实验结果与临床应用之间的差异性。
为了探究 MSCs 对 OA 的治疗作用，研究人员已经对羊[37]、鼠[38]、狗[39]、兔[40]、马[41]等动物进行了大量的临床前研究。建立 OA 动物模型的方法有前交叉韧带横断术（ACLT）[37]、内侧半月板切除术（MM）[37]、碘乙酸单钠（MIA）诱导[38]、丙泊酚诱导[39]、木瓜蛋白酶诱导[42]等。根据以往的动物实验报道，局部关节内注射 MSCs[43]、MSC衍生的外泌体[44]、带有 MSCs 的支架植入物[45]以及带有载体介质的 MSCs 悬液[42]可以有效缓解 OA。近几年间充质干细胞骨关节炎动物模型临床前试验总结如表 1 所示。
表1 近几年间充质干细胞骨关节炎动物模型临床前试验总结
在 clinicaltrail.gov 查阅发现，AD-MSCs、BM-MSCs 和UC-MSCs 是被用来治疗 OA 最多的 MSCs 来源。Kern等[49]对以上三种来源的 MSCs 进行了比较，由表 2 可知，三种来源的 MSCs 各有优势，而现有的研究没有明确表示哪一种来源的 MSCs 最适合用于治疗 OA。若想确定最佳来源，则需要更多的临床研究。
表2 骨髓、脐带血和脂肪组织中 MSCs 的比较分析
4.1 AD-MSCs
AD-MSCs 具有易于获取且软骨再生能力强等特点，在治疗 OA 方面有着独特的优势。AD-MSCs 来源于髌下脂肪垫（IPFP）和皮下脂肪（SC），而髌下脂肪垫衍生 MSCs（IPFP-MSCs）的增殖和分化能力几乎不受年龄影响[50]，对于老年 OA 患者是一个不错的选择。
AD-MSCs 的安全性和有效性在早期的试验中已经得到证实，例如在一项概念验证临床试验中，Jo 等[51]将 1 ×107、5 × 107、1 × 108低中高三种剂量 AD-MSCs 用于治疗膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA），结果表明 1 × 108为有效剂量，改善了患者 KOA 功能和疼痛，并且通过透明状关节软骨的再生减少软骨缺损，无不良事件。在大型病例、长期随访研究中，AD-MSCs 治疗 OA 也取得了较好的结果，例如 Freitag 等[52]对 329 例KOA 患者接受关节内 AD-MSCs 治疗进行评估，报告了临床和统计学上显著的疼痛改善。研究表明，关节内注射脂肪来源的自体基质血管组分治疗 OA 可以有效缓解膝关节骨关节炎患者的疼痛，改善功能，修复软骨缺损[53-55]。近几年脂肪间充质干细胞关节内注射治疗骨关节炎总结如表 3 所示。
表3 近几年脂肪间充质干细胞关节内注射治疗骨关节炎总结
4.2 BM-MSCs
骨髓是第一个被报道含有 MSCs 的来源，含有各种生长因子和细胞因子，具有旁分泌和免疫调节作用，在软骨和骨骼再生领域备受关注，但是在临床使用上具有局限性，因为它的获取具有高度侵入性以及分化能力受年龄影响较大[49]。自体 BM-MSCs 更易于获取，成本低，没有免疫排斥和疾病传播的风险，老年患者建议使用同种异体BM-MSCs。Gupta 等[60]证明关节内给予 Stempeucel®（成人骨髓来源、培养、混合、同种异体间充质基质细胞）是安全的，2500 万个细胞的剂量可能是最有效的，VAS、WOMAC 和 ICOAP 评分有所改善。在获取 BM-MSCs 的过程中需要关注：进行骨髓抽吸术麻醉剂的选择、注射器的型号、骨髓穿刺针类型、抗凝剂的选择；
离体后理想的离心速度和时间等对细胞产量的影响[61]。近几年骨髓间充质干细胞关节内注射治疗骨关节炎总结如表 4 所示。
表4 近几年骨髓间充质干细胞关节内注射治疗骨关节炎总结
4.3 UC-MSCs
UC-MSCs 具有易于获取、侵入性低、增殖速度快、体内外免疫原性低等优点，被广泛用于临床治疗各种疾病。在以往的研究中，UC-MSCs 治疗 OA 通常会联合其他方法，例如截骨术、微骨折或加入透明质酸钠（HA）等。对于 UC-MSCs 的研究也相对比较成熟，在韩国已有含UC-MSCs 的干细胞药物产品——Cartitem，它的主要成分是 hUC-MSCs 和透明质酸，治疗剂量为 500 μl/cm2（细胞浓度为 0.5 × 107个细胞/ml），在临床应用中其疗效和安全性也都得到了验证。Park 等[67]将 Cartitem 移植到缺损区域之后在 12 周的关节镜评估中观察到软骨修复，VAS 和IKDC 评分在 24 周时有所改善，在长达 7 年的随访中没有报道成骨或肿瘤发生的病例。Song 等[68]用 Cartitem 治疗患者KOA，术后 1 年和 2 年的 VAS、WOMAC 和IKDC 评分显著改善，病变部位差异有统计学意义。大量的临床前和临床试验将 HA 作为 MSCs 的载体，有研究人员认为 HA 可能会使 UC-MSCs 停留在关节表面[69]，从而提高疗效。与微骨折相比，植入 UC-MSCs 联合透明质酸复合物是治疗老年患者大面积全层软骨缺损的可行的再生治疗选择[70]。多项研究表明，对于年轻患者，hUC-MSCs 的植入联合高胫骨截骨术（HTO）是内侧隔室骨关节炎和内翻畸形患者的有效治疗方法[71-73]。
对于 MSCs 治疗 OA，可以通过生物支架、载体、联合手术或基因修饰等方法改进。Morille 等[45]研究发现植入释放软骨诱导因子的支架上的 hMSCs 可以原位分化并形成软骨样新组织，可以避免重复注射生物活性因子。Qiao等[74]报道了关节内注射人脂肪来源间充质祖细胞（haMPCs）加微骨折和 HA 可以改善患者膝关节软骨缺损。对于内侧隔室骨关节炎和内翻畸形的年轻患者可以采用高胫骨截骨术和 MSCs 联合治疗的方法，可以延缓进行全关节置换术的时间，减轻患者疼痛，改善患者生活质量。对MSCs 进行基因修饰来提升治疗效果的研究大部分还处在临床前阶段，需要更多的试验来证实长期安全性。
近年来，MSCs 治疗 OA 的临床前和临床研究已经取得了较大进展。在 MSCs 治疗 OA 的临床试验中，短期安全性已经得到验证，但是长期安全性报道的较少，在未来的工作中还需要进行更大样本长期随访试验。同时，还要解决细胞移植后的一些问题，例如细胞存活、细胞分化差以及与宿主组织整合等。虽然大部分研究显示 MSCs 治疗 OA 可以改善主观疼痛和功能评分，但很少有研究显示软骨信号和MRI 形态学改善，因此需要增加对生成软骨体积测量的研究。对于 MSCs 治疗 OA，需要确定注射次数、最佳治疗剂量、最佳来源和佐剂的添加量，在今后的工作中需要有相关的标准来规范和引领这一领域的研究，解决临床转化的安全性和有效性问题。
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