应用分子对接技术预测氟伐他汀对胰腺癌细胞作用的关键靶点
时间：2023-02-27 11:55:05 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
朱秀贤，杨舜娟，林菁红，甘惠贞
胰腺癌是消化道系统恶性程度最高的肿瘤之一，具有发病隐匿、进展迅速、病死率高等特点，其1年和5年相对生存率分别为27%和7%[1]，预后极差。手术是胰腺癌有效的治疗手段，但只有15%～20%的患者在确诊时符合手术条件[2]。对于不适合手术或转移性胰腺癌患者，目前尚无有效治疗方式。
他汀类药物是一类羟甲基戊二酰辅酶A(3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A，HMG-CoA)还原酶抑制剂，广泛应用于调节胆固醇水平以及预防心血管疾病。近年来，越来越多的证据表明，他汀类药物能够通过抑制增殖、血管生成以及诱导凋亡或自噬等途径发挥抗肿瘤作用[3-5]。辛伐他汀能够通过降低线粒体电子载体辅酶Q的合成而干扰氧化还原稳态，进而导致胰腺导管腺癌的氧化应激和凋亡[6]；
氟伐他汀可通过抑制p21ras和rhoA蛋白的异戊二烯化，增强吉西他滨对MiaPaCa-2细胞的毒性作用[7]；
在多种转基因胰腺癌小鼠模型中，辛伐他汀能够延缓胰腺上皮内瘤变的进展，部分抑制胰腺癌的形成[8]。上述研究表明，他汀类药物在胰腺癌的治疗或预防方面具有应用前景，因此，探究他汀类药物对胰腺癌细胞或组织基因表达谱的影响具有重要意义。然而，关于氟伐他汀防治胰腺癌的研究较少，基于目前的研究结果，氟伐他汀对胰腺癌细胞基因表达谱的影响仍不清晰。
分子对接是药物筛选潜在靶点的不可缺少的手段之一，本研究选择氟伐他汀作为目标药物，通过生物信息学方法，分析氟伐他汀对胰腺癌细胞MiaPaCa-2和PANC-1基因表达谱的影响，筛选关键通路及核心靶点，将其与氟伐他汀进行分子对接打分，判断氟伐他汀与核心靶点的结合活性，为胰腺癌的药理学研究提供思路与参考。
1.1 数据库和软件 关键基因筛选涉及的数据库及软件包括：通过基因芯片公共数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)下载数据集，应用R语言(4.1.1版本)edgeR程序包筛选差异表达的基因、pheatmap程序包绘制热图、ggplot2程序包绘制火山图、VennDiagram程序包绘制共同的差异表达基因韦恩图、clusterProfiler R包结合ggplot2程序包进行GO(Gene Ontology)分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析，并绘制柱状图展示富集结果。应用Cytoscape软件(版本3.7.2)中的cytoHubba插件筛选Hub基因，通过Genecards数据库(https://www.genecards.org/)获取基因的基本信息。在分子对接分析中应用的数据库和软件包括：RCSB蛋白质数据库-RCSB PDB(https://www.rcsb.org/pdb/home/sitemap.do)结合UniProt 数据库查找蛋白质分子的三维结构、分辨率和种属，PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库查找并下载氟伐他汀化学结构，通过Chem3D 19.0 软件进行能量最小化处理并转换文件格式，通过Autodock Tools-1.5.6进行分子对接分析,结合Pymol V2.5.0 软件进行可视化展示。
1.2 芯片数据的来源 从基因芯片公共数据库GEO中下载数据集GSE149566(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE149566)。该基因数据集由Illumina HiSeq 2000(Homo sapiens)平台检测获得，共8 738个基因。该研究采用20 μM氟伐他汀处理胰腺癌细胞MiaPaCa-2和PANC-1，48 h后提取RNA，并进行mRNA表达谱测序分析。
1.3 差异表达基因的筛选和功能富集分析 根据|logFC|>1且P<0.05的筛选标准，利用R语言edgeR程序包分别筛选MiaPaCa-2和PANC-1经氟伐他汀处理后差异表达的基因。利用pheatmap和ggplot2程序包,分别绘制热图和火山图。将每种细胞的差异表达基因进行可视化展示，并利用韦恩图寻找两种胰腺癌细胞共同差异表达基因。利用clusterProfiler R包对筛选出的共同差异表达基因进行GO(Gene Ontology)分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析，并应用ggplot2程序包绘制柱状图以展示富集结果。
1.4 关键基因筛选 将本研究筛选得到的共同差异表达基因导入String数据库(https://string-db.org/)，进行蛋白-蛋白相互作用(Protein-protein interaction,PPI)分析，筛选条件：互作最大值(Maximum number of interactors)=0，最小互作得分(Minimum required interaction score)≥0.40。将String分析得到的PPI网络计算结果导入Cytoscape软件(版本3.7.2)，利用cytoHubba插件筛选出处于网络中关键位置的Top10 Hub基因，并从Genecards数据库(https://www.genecards.org/)获取这10个Hub基因的基本信息。
1.5 蛋白受体和小分子配体结构准备 在RCSB蛋白质数据库-RCSB PDB(https://www.rcsb.org/pdb/home/sitemap.do)查找蛋白质大分子，结合UniProt 数据库查找蛋白三维结构的分辨率和种属，在PDB数据库筛选适合的蛋白质大分子，并下载.pdb格式文件。通过PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)查找氟伐他汀的基本信息，并保存其三维化学结构的sdf格式文件。通过Chem3D 19.0 软件进行能量最小化处理，保存小分子配体为mol2格式。
1.6 分子对接研究 通过Autodock Tools-1.5.6 对氟伐他汀与预测到的潜在重要作用靶点进行分子对接分析。将从PDB 数据库下载的靶点蛋白的复合晶体结构(pdb格式)，导入AutodockTools-1.5.6，对靶蛋白进行去水、加氢和电荷，以及对不完整的残基进行修饰。进行口袋搜索预测对接口袋，设置受体、配体分子以及对接盒子(Grid Box)大小。将氟伐他汀的3D 结构与靶点蛋白依次进行Autogrid 4.0、Autodock 4.0对接计算分析,通过计算结合能评价结合作用，结合能<-7 kcal/mol表明结合作用良好。大分子蛋白质与小分子药物对接的最优构象的复合物以PDBQT 格式导出。最后，通过Pymol V2.5.0 进行可视化处理。
2.1 氟伐他汀处理MiaPaCa-2和PANC-1后差异表达基因的筛选 经过统计分析发现，20 μM氟伐他汀处理胰腺癌细胞MiaPaCa-2和PANC-1 48 h后，MiaPaCa-2细胞共筛选出74个差异表达基因，其中47个mRNA上调，27个mRNA下调(图1A)；
PANC-1细胞共筛选出95个差异表达基因，其中70个mRNA上调，25个mRNA下调(图1B)。利用火山图观察两种细胞基因的总体表达情况，用节点的大小和颜色来表征-log10(pvalue)数值的大小(见图1)。
图1 胰腺癌细胞MiaPaCa-2和PANC-1暴露于氟伐他汀48 h后差异表达基因火山图注：A.MiaPaCa-2;B.PANC-1
进一步将两种细胞的差异基因的表达变化利用热图(heatmap)分别进行可视化展示(图2A、图2B)，其中红色代表表达量高，蓝色代表表达量低。韦恩图筛选出两种胰腺癌细胞共同差异表达基因共27个，其中3个mRNA上调，24个mRNA下调。
图2 胰腺癌细胞MiaPaCa-2(A)和PANC-1(B)暴露于氟伐他汀48 h后差异表达基因的聚类热图和韦恩图注：A.MiaPaCa-2细胞；
B.PANC-1细胞；
C.差异表达基因韦恩图
2.2 功能富集分析和关键靶点筛选 利用clusterProfiler R包对筛选出的共同差异表达基因进行GO分析和KEGG分析，并应用ggplot2程序包绘制柱状图以展示富集结果。如图3所示，20 μM氟伐他汀处理48 h后，两种细胞共同差异基因的生物学途径(Biological process，BP)主要涉及DNA复制、染色体分离等，说明氟伐他汀可能抑制促癌基因的合成；
KEGG通路富集分析显示，27个共同差异基因主要与嘧啶代谢、p53信号通路、核苷酸代谢和细胞周期等相关(见图3)，说明氟伐他汀可能通过这些通路抑制胰腺癌的发生发展。利用String数据库和Cytoscape软件(版本3.8.2)对27个共有的差异基因进行PPI分析(图3B)；
应用Cytoscape软件中的cytoHubba插件筛选出的Top 10 hub基因如图3C所示，即MCM10、KIF14、CDC45、NCAPH、EXO1、DLGAP5、NUF2、PBK、MKI67和RRM2，图中颜色的深浅代表该蛋白在网络中的作用关键程度。应用Genecards数据库获取这10个Hub基因的基本信息(见表1)，发现这10个关键基因涉及DNA复制、DNA错配修复与重组、染色体凝缩、胞质分裂等细胞周期与细胞增殖的作用。
图3 差异表达基因的功能富集分析和关键靶点筛选注：A.KEGG和BP分析；
B.蛋白互作网络图；
C.Top 10关键基因
表1 Top 10 Hub基因的基本信息
2.3 分子对接结果 上述筛选出的10个关键靶点与氟伐他汀对接的构象结果见图4，由于DLGAP5无蛋白晶体结构，NCAPH为单链线性结构，无法形成活性口袋，故未纳入对接。结果显示，大部分蛋白靶点与氟伐他汀主要以氢键形式结合，其中氟伐他汀与EXO1蛋白结合的亲和力为-7.9 kcal/mol，EXO1蛋白中的CYS80、THR81、LEU82、LYS85和GLU150这5个氨基酸与氟伐他汀形成5个氢键，此外加上疏水作用，以及π-π共轭作用，使得两者对接的能量数值较小。分子对接结果认为score 值<-7 kcal/mol，配体与受体结合的亲和力大，配体受体具有较强的结合活性，构象更为稳定。此外，MCM10和CDC45这两个蛋白的对接能量值也很低，分别为-7.6、-7.5 kcal/mol，分别形成4个和5个氢键。对接的详细信息见表2。
在这8个蛋白中，EXO1、MCM10、CDC45和KIF14对接的能量值<-7 kcal/mol，提示这几个蛋白很有可能是氟伐他汀作用的关键靶点。
图4 氟伐他汀与预测到的8个潜在的关键靶点对接示意图
表2 氟伐他汀与潜在的关键靶点对接分析结果
他汀类药物是一类HMG-CoA还原酶抑制剂，通过竞争性抑制甲羟戊酸代谢途径抑制甲羟戊酸及其下游产物的生成，影响胞膜完整性、蛋白合成以及细胞周期等诸多生物学功能，抑制肿瘤细胞的生长、增殖、分化、侵袭和转移等[9]，在胰腺癌的治疗或预防方面具有应用前景。
本研究通过对胰腺癌细胞MiaPaCa-2和PANC-1 mRNA表达谱进行数据挖掘与分析，发现与氟伐他汀相关的共同差异基因主要与DNA复制、细胞有丝分裂等生物学途径密切相关，涉及p53信号通路、嘧啶代谢和细胞周期等通路，这与Chen等[4]和Gbelcová等[10]的研究结果基本一致。p53是一种重要的抑癌基因，其编码蛋白p53通过多种机制参与调节细胞生长和凋亡、DNA修复以及细胞周期等[11]，突变型p53与肝癌、胰腺癌、乳腺癌等多种肿瘤相关。研究发现，突变型p53的稳定性与甲羟戊酸代谢途径中的中间产物甲羟戊酸-5-磷酸酯有关[12]，他汀类药物可通过抑制甲羟戊酸代谢途径或激活LKB1-AMPK-p38MAPK-p53-survivin信号通路抑制肿瘤增殖[13]。嘧啶是DNA复制和RNA合成的重要分子，其代谢过程十分复杂，包括核苷的回收、从头合成以及催化降解等，在细胞增殖、肿瘤分化以及上皮间质转化等均发挥着重要作用，嘧啶代谢异常与诸多癌症密切相关[14]，然而目前尚未发现文献报道他汀类药物对嘧啶代谢的影响。此外，Huang等[15]通过对2 142例胰腺导管腺癌患者的病历资料进行回顾性分析，发现辛伐他汀和阿托伐他汀能够降低胰腺癌的死亡率，国内外其他学者也有相同发现[16-17]。由此可见，在治疗方面，他汀类药物对胰腺癌的治疗作用是确切的，然而在预防方面，对于他汀类药物是否能够降低胰腺癌的发生风险仍存在争议[18-19]，需进一步研究。
差异基因相互作用网络分析结果发现，20 μM氟伐他汀处理48 h后，MiaPaCa-2和PANC-1两种细胞中EXO1(核酸外切酶1)的表达均显著下调。已有研究显示，EXO1是胰腺癌易感性的潜在候选基因[20]。EXO1的DNA错配修复可以作为胰腺癌患者总体生存的重要预测因子，是临床胰腺癌放化疗反应的潜在预测指标[21]。本研究通过关键靶点预测到EXO1蛋白，分子对接结果发现氟伐他汀与EXO1蛋白结合的亲和力较强，可能是氟伐他汀发挥抑制胰腺癌作用的重要靶点，目前暂未发现氟伐他汀和EXO1相关性的研究，关于两者的作用机制有待进一步探索。
此外，MCM10(微染色体维持蛋10)和CDC45(细胞分裂周期45)也是预测到的关键靶点且与氟伐他汀具有较强的亲和力。CDC45与GINS、MCM2-7形成CMG解旋酶，MCM10可通过与单链或双链DNA直接作用激活其活性，参与起始DNA复制以及延伸。MCM10过表达可使细胞摆脱周期控制,致使DNA无限复制，可作为肿瘤预后生物标志物或潜在治疗靶点[22-23]，然而目前尚无文献报道MCM10在胰腺癌中的作用。此外，氟伐他汀还能够下调KIF14(驱动蛋白家族成员14)、NCAPH(非SMC凝集蛋白1复合物亚基H)和细胞分裂相关基因NUF2的表达，这些基因参与染色体的凝缩、分离与稳定，其异常表达均可诱发肿瘤的形成[24-26]。KIF14是一种新发现的驱动蛋白超家族成员，其异常表达可导致基因缺失、染色体易位或重复、双核或多核细胞形成。多项研究均发现，KIF14与胰腺导管腺癌患者的总生存期相关，能够预测胰腺癌的进展和预后，可作为潜在的治疗靶点[27-29]。NCAPH是凝缩蛋白中真正发挥作用的亚基，参与维持染色体的稳定和凝缩。NCAPH在胰腺癌临床样本和细胞中过表达，当其表达降低时，细胞克隆的形成和增殖受到抑制，细胞周期阻滞在S和G2/M期，激活caspase-3和PARP裂解并启动凋亡程序[30]。此外，氟伐他汀能够下调DLGAP5、PBK、MKI67和RRM2的表达，这些基因涉及DNA的错配修复和细胞周期的调节。
尽管包含虚拟筛选在内的分子对接不可避免地会产生假阳性和假阴性，多种因素例如由配体结合引起的微小蛋白质构象变化也可能影响对接结果的质量，但综合大量文献验证结果，发现分子对接对于预测或者验证小分子化合物与蛋白大分子或者蛋白大分子之间的作用具有重要的作用，将小分子“停靠”到大分子靶标结构中，并对其与结合位点的潜在互补性进行"评分"的计算方法被广泛用于靶点确认和先导化合物的优化[31]。目前,分子对接除了主要用于虚拟筛选预测与靶点结合的潜在药物分子外，在基于药物小分子的靶点预测方面也发挥着不可或缺的作用，尤其是目前对单独的中药或者中药处方体内药物靶点预测应用较多[32-33]。徐朦等[32]通过网络药理学和AutoduckTools分子对接方法，筛选到益气解毒方对治疗肝癌起关键作用的DDX5和HNRNPK等8个核心基因；
田薇等[33]结合AutoduckTools分子对接方法，预测β-谷甾醇、豆甾醇、金合欢素可能是板蓝根发挥药效的主要活性成分，CASP3、PTGS2和TNF 等蛋白可能是板蓝根发挥抑菌作用的关键靶点。由此可知，分子对接在药物筛选和靶点预测中具有重要的作用。
上述研究结果表明，氟伐他汀能够影响胰腺癌MiaPaCa-2和PANC-1细胞基因表达谱，共同差异表达基因主要涉及嘧啶代谢、P53信号通路、核苷酸代谢和细胞周期等通路，分子对接结果提示EXO1、MCM10、CDC45和KIF14这几个蛋白很有可能是氟伐他汀作用的关键靶点。本研究为他汀类药物用于胰腺癌的治疗提供分子生物学上的理论依据。然而，本课题未进行相应分子生物学实验的验证，具有一定的局限性，后续我们将进行进一步的机制探究。
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