基于DNA与上转换纳米颗粒相结合的生物传感与成像研究进展

赵恒智，余方志，李翔菲，李乐乐

（国家纳米科学中心,中国科学院纳米生物效应与安全性重点实验室,北京 100190）

脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）作为主要的遗传物质在生命系统中发挥着重要的作用.得益于DNA分子的碱基互补配对特性以及一系列功能性DNA如核酸适体（Aptamer，可与目标物发生特异性结合）、脱氧核酶（DNAzyme，具有类酶催化功能）的发现，DNA被广泛应用于生物传感、生物成像、药物递送和疾病治疗等领域［1～8］.DNA在上述领域的应用中具有诸多方面的优势.首先，DNA可以通过固相合成实现自动化的化学合成，其具有易于合成及易于化学修饰的优点［9，10］.此外，DNA还具有可编程性强以及生物相容性好等优势，极大地推动了DNA在生物医学领域中的应用.另一方面，由于小尺寸效应，纳米材料具有独特的光学、电学及磁学特性，在生物成像等领域中表现出优良的应用潜力［11～13］.通过将这些纳米材料与DNA进行结合，不仅可以整合DNA及纳米颗粒各自的优势，还可以催生出单一成分所没有的协同特性，实现新型生物成像应用［14～16］.

由于具有独特的光学、磁学等性质，镧系元素掺杂的上转换纳米颗粒（Upconversion nanoparticles，UCNPs）受到了广泛关注［17～21］.与传统的发光材料如量子点、碳点等不同，UCNPs通过非线性光学过程展现出反斯托克斯的发光特性.在该过程中，UCNPs在低能量光子如近红外（Near-infrared，NIR）光辐射下可连续吸收2个或多个光子，产生较短波长的紫外（Ultraviolet，UV）光或可见光［21］.UCNPs具有如下优势：首先，UCNPs的激发光处于NIR窗口，不仅可以大幅降低来自生物系统的自发荧光背景干扰，还能有效避免光引起的组织损伤；
其次，NIR光具有更高的组织穿透深度，可实现活体水平的生物成像；
第三，UCNPs发光稳定性好，可以有效地抵抗光漂白；
因此被广泛应用于生物成像［5，19］.此外，通过在UCNPs中掺入不同的镧系离子，可在同一激发波长照射下实现多色发光成像分析.近年来，基于DNA与UCNPs相结合的生物成像技术备受关注.这种交叉融合能够将DNA的分子识别功能与UCNPs的光学性能相结合，从而开发出新型生物成像策略，为疾病的诊断及病理学研究提供新工具.

本文聚焦基于DNA与UCNPs结合的生物成像策略，并根据工作原理将其归纳为3种成像方法（图1）.第一种方法，将具有肿瘤标志物识别能力的核酸适体与UCNPs结合，实现肿瘤靶向成像.第二种方法，UCNPs作为能量供体与DNA结合，构建基于发光共振能量转移（Luminescence resonance energy transfer，LRET）机制的生物传感器，实现对靶标分子的检测与成像分析.第三种方法，通过构建光响应的DNA传感器，并引入UCNPs作为控制单元，实现NIR光操控的、时空选择性分子传感与成像.本文将分别对这3种成像策略的研究进展进行概述，并对该领域的发展前景进行了展望.

Fig.1 Schematic illustration of biosensing and imaging strategies based on the integration of DNA and UCNPs

光学成像技术是一种分辨率高、具有原位实时能力的成像手段，其在生理病理学研究以及疾病诊断等领域应用广泛，是医学和生命科学中不可或缺的研究工具.与传统有机荧光染料及量子点等荧光材料不同，UCNPs可在NIR光的激发下产生上转换发光，从而能够在生物成像应用中大幅降低生物样品所产生的自体荧光干扰并实现深层组织成像.利用UCNPs对肿瘤部位进行特异性地标记，可视化地分辨病变组织与正常组织，有望用于肿瘤诊断及手术导航.然而，UCNPs本身不具有肿瘤特异性识别功能，需将其与具有靶向功能的配体相结合以实现相关应用.

核酸适体是通过指数富集配体系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）筛选出的具有特定序列的寡核苷酸，能够与特定目标物结合，具有很强的结合亲和力和特异性［22～24］.由于与抗体的功能相似，适体常被称为“化学抗体”.迄今，通过SELEX技术已经筛选出大量的核酸适体，可以特异性识别小分子、蛋白质、细胞及组织［25～29］.因此，将具有肿瘤靶向功能的核酸适体修饰在UCNPs表面，有望实现基于上转换发光的肿瘤成像.例如，通过配体交换法将AS1411适体（可与癌细胞表面过表达的核仁素结合）修饰在UCNPs表面，实现了肿瘤细胞MCF-7的靶向成像［图2（A）］［30］.该纳米探针孵育后的MCF-7细胞在NIR光激发下显示出强烈的上转换发光，而同样条件下，核仁素阴性细胞NIH-3T3并未展现出明显的上转换发光信号，表明其肿瘤靶向成像功能.Tan课题组［31］通过在UCNPs表面修饰与细胞膜受体蛋白酪氨酸激酶7（Protein tyrosine kinase 7，PTK7）特异性结合的sgc8适体，并引入光敏剂分子，实现了PTK7过表达癌细胞CEM的靶向成像及光动力治疗［图2（B）］.随后，该课题组［32］将带有AS1411适体的DNA四面体框架核酸修饰于UCNPs表面，实现了对癌细胞的靶向成像.

Fig.2 DNA-UCNPs for aptamer-mediated targeted tumor imaging

比率成像的策略能够降低环境及仪器效率等造成的干扰，从而可获得更为可靠的成像信息.UCNPs具有可调的上转换发光特性.通过精准的设计合成及调控，能够制备出多色上转换发光的UCNPs，用于构建肿瘤比率成像分析方法.Zhang课题组［33］制备了双色发光的UCNPs，并对其进行核酸适体修饰以及药物装载，用于肿瘤成像及治疗.如图2（C）所示，修饰于UCNPs表面的sgc8适体链与携带猝灭剂BHQ-1的单链DNA部分杂交，使UCNPs的绿色发光被猝灭剂BHQ-1猝灭，从而只显现出红色发光.UCNPs表面核酸适体与癌细胞表面受体PTK7结合会引起核酸适体构象变化，从而释放携带猝灭剂BHQ-1的单链DNA并使光敏剂分子PPA靠近UCNPs.该靶向过程会引起UCNPs绿色发光的恢复以及UCNPs与PPA之间能量转移导致的红色发光降低.因此，可根据绿光强度与红光强度的比率实现肿瘤精准成像.此外，核酸适体构象的改变还能够同时触发化疗药物的释放以及光动力治疗的开启，从而实现集肿瘤成像、化疗药物释放及光动力治疗的一体化.

UCNPs具有独特的上转换发光特性，其激发波长处于NIR窗口，因此可将其作为能量供体用于构建基于LRET的化学与生物传感器，从而解决传统荧光团激发波长较短带来的限制.此外，还可以利用UCNPs可调的多色发光特性发展比率型分子传感与成像策略.

MicroRNA（miRNA）是一种非编码RNA，在许多细胞过程中发挥着重要的调节作用.研究表明，miRNA的表达水平与多种癌症的发生发展密切相关［34～36］.因此，miRNA可作为一种潜在的肿瘤标志物用于癌症的诊断及治疗.Zhu课题组［37］通过将双受体分子标记的cDNA（miRNA互补序列）在静电作用下吸附于UCNPs表面，构建了用于活细胞内miRNA成像的纳米传感器［图3（A）］.在初始状态下，受体分子与能量供体UCNPs之间距离接近，可通过LRET猝灭UCNPs的上转换发光.当目标miRNA存在时，其能与cDNA杂交并形成稳定的DNA/RNA异源双链结构.由于双链结构具有较大的刚性，使其与UCNPs之间的亲和力下降并从UCNPs表面释放，从而中断受体分子与供体UCNPs之间的LRET作用，进而恢复UCNPs的上转换发光用于miRNA检测.该传感器进一步被用于活细胞内miRNA的原位成像分析.Na课题组［38］将靶标miRNA的互补DNA序列分成两段，并将其中一段修饰于能量供体UCNPs表面，另一段进行受体荧光团TAMRA标记，构建了一种基于LRET的miRNA传感策略.该方法利用靶标miRNA的“桥联”作用将受体荧光团标记的互补DNA捕获至UCNPs表面，从而通过LRET作用影响UCNPs发光，实现miRNA的传感检测.DNA自组装能够赋予DNA纳米结构规则的几何构型以及良好的结构稳定性.受此启发，Kuang课题组［39］合成了以DNA为框架，金纳米颗粒和UCNPs为顶点的纳米金字塔探针，用于细胞内miRNA的检测与成像.良好的几何构型使得UCNPs与金纳米颗粒之间发生LRET过程，从而猝灭UCNPs的上转换发光.目标miRNA的存在可触发DNA框架的瓦解，导致UCNPs与金纳米颗粒之间的LRET中断，从而恢复UCNPs的上转换发光以实现miRNA检测.此外，该纳米金字塔探针还可通过圆二色光谱信号的变化实现对miRNA的定量检测.最近，Ding等［40］利用双色发光的UCNPs作为能量供体并提供内参信号，结合miRNA触发的发夹DNA自组装反应，构建了自参比信号放大的纳米传感器.目标miRNA引发的发夹DNA自组装反应能够将受体荧光团拉近至供体UCNPs表面，从而通过LRET效应引起信号的变化，实现活细胞中miRNA的高灵敏比率成像［图3（B）］.miR122作为一种新兴的肝损伤生物标志物，在药物性肝损伤检测中展现出巨大潜力.Li课题组［41］以UCNPs为供体，金纳米笼为能量受体及药物载体，并基于miR122介导的DNA链置换反应，构建了药物性肝损伤成像及按需给药的一体化纳米诊疗平台.

Fig.3 LRET-based DNA-UCNP sensors

三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）是生物体中普遍存在的生物活性分子，在能量传递、酶催化和信号转导中起着至关重要的作用.Chen课题组［42］将ATP适体的互补序列DNA修饰于UCNPs表面并与Cy3荧光团标记的ATP适体链杂交，构建了ATP传感器.在初始状态下，能量供体UCNPs与受体荧光团Cy3间的LRET使得UCNPs的发光被猝灭.ATP能够与适体链发生特异性结合，从而使Cy3标记的适体DNA从UCNPs表面释放并中断LRET作用，恢复UCNPs的上转换发光.该传感器进一步被用于活细胞内ATP的原位成像分析.通过选择不同的功能性DNA，该方法可应用于其它小分子的检测与成像.Lee课题组［43］以UCNP为供体，氧化石墨烯为受体，通过多巴胺适体将两者进行集成，构建了多巴胺生物传感器，用于检测干细胞来源多巴胺能神经元中释放的多巴胺分子.近期，Zhang课题组［44］将Pb2+选择性DNAzyme探针修饰于UCNPs表面，基于LRET原理，构建了特异性成像Pb2+的纳米传感器.

通过掺杂不同元素，UCNPs在NIR光激发下具有可调的多色发光，为生理病理过程中多靶标检测提供了新工具.Liu课题组［45］开发了一种DNA-UCNPs纳米传感器，用于溶酶体中K+及pH的多靶标成像分析［图3（C）］.该纳米传感器主要由UCNP能量供体、金纳米颗粒受体及具有K+或pH响应能力的DNA分子连接而成.K+会触发富鸟嘌呤序列DNA分子形成G-四链体结构，使得UCNP和金纳米颗粒相互靠近，通过LRET作用猝灭UCNP的绿色发光.同时，酸性pH条件下胞嘧啶的质子化驱动C+·G-C三链体DNA的形成，使发射蓝光的UCNP和金纳米颗粒靠近，导致蓝光猝灭.因此，通过引入不同上转换发光的UCNPs供体，可在NIR光激发下实现pH和K+的同时成像分析.该体系为溶酶体生物化学研究提供了新方法.研究发现，溶酶体中H+的流入会伴随着K+的流出.Kuang课题组［46］将2种含有不同miRNA识别序列、不同荧光修饰的DNA分子连接于UCNPs表面，并进一步与纳米金棒进行组装，构建了可同时成像2种不同靶标miRNA的纳米组装体探针.能量供体UCNPs与受体纳米金棒之间的LRET使得上转换发光信号被猝灭.在目标miRNA的存在下，miRNA通过与DNA分子中识别序列的杂交将UCNP从纳米金棒表面释放，进而开启供体UCNP与受体荧光团之间的LRET作用，实现对2种miRNA的检测及成像.该课题组［47］进一步构建了拉曼-上转换发光双模式成像纳米探针，实现了活细胞内miRNA及端粒酶活性的定量分析.

传统传感器的设计采用“始终开启”的策略，即只要有靶标分子输入便会产生成像信号.该类传感系统在复杂生命体系（如细胞内和活体）中的应用面临一个关键难题，即其在被递送至目标区域的过程中可对靶标分子提前响应，导致成像的精准度受限［48］.因此，如何实现“时-空”可控的分子传感与成像成为该领域的一个前沿科学问题.

针对这一问题，本课题组［49］通过引入UCNPs作为控制模块，率先提出了上转换发光激活型传感方法，以实现时空选择性分子传感与成像.如图4（A）所示，设计了含有UV光敏感基团（PC）的互补链与ATP适体杂交，封闭其ATP识别功能.同时，互补链3′端标记的猝灭基团可以有效猝灭适体链5′端标记的荧光基团Cy3.进一步将构建的DNA传感器与UCNPs结合，构建了近红外光调控的传感器件.在NIR光照射下，UCNPs将其转换为UV光以切割互补链中的PC基团，导致互补链与适体链的杂交亲和力降低，进而恢复核酸适体对ATP的识别能力.核酸适体链通过结合ATP发生构象变化，与互补链分离，从而恢复Cy3荧光信号.利用该方法，通过NIR光控制实现了在活细胞中ATP分子的时空选择性成像分析.这一概念性方法自提出以来已经在生物传感与成像领域得到了广泛应用［48］.例如，本课题组通过合理设计光激活型DNA传感体系，将该方法拓展至miRNA和pH的精准成像分析［50，51］.Lu课题组［52］通过引入“光笼”基团对DNAzyme的切割底物进行保护，设计了一种UV光激活的金属离子成像探针，并将UCNPs作为控制模块与其结合，开发了一种NIR光激活的金属离子传感器，实现了对细胞内和斑马鱼胚胎中锌离子的成像分析.为增强DNA探针的生物稳定性，Pang课题组［53］将基于DNA四面体结构的miRNA纳米传感器与UCNPs进行集成，开发了可示踪细胞内miRNA的NIR光激活型DNA纳米机器.DNA马达是一种动态的DNA纳米机器，其可通过链置换反应或DNAzyme切割反应增强信号转导和放大传感信号［54］.近期，Li课题组［55］利用UCNPs构建DNA马达，经NIR光启动目标mRNA介导的链置换反应及连续的DNAzyme切割反应，实现了对肿瘤标志物生存素mRNA的高灵敏成像分析.此外，以同时成像多种miRNA分子为目标，Luo课题组［56］将UV光响应的DNA纳米探针与UCNPs相结合，构建了能够成像细胞内多种miRNA的NIR光调控型纳米传感器.最近，该课题组［57］通过在UCNPs表面修饰UV光敏感的劈裂型DNAzyme探针，实现了NIR光控制的目标RNA高灵敏成像分析.在该设计中，NIR光的照射能够恢复劈裂型DNAzyme探针的靶标RNA识别能力，并通过与靶标RNA的杂交激活DNAzyme的切割能力，从而产生响应信号用于靶标RNA成像.基于DNA的分子逻辑电路由于能够在生物系统中执行复杂的信息处理而受到研究者们的广泛关注.本课题组［58］将DNA逻辑电路的概念与上转换纳米技术相结合，构建了NIR光激活的多靶标分子关联性成像分析方法，展示了利用上转换纳米技术对DNA逻辑运算进行时空操控的潜力.

生物分子在细胞内的时空分布受到严密而精细的调控以保证各种生化反应的高效有序进行，从而维持细胞的正常生命活动［59，60］.因此，在亚细胞水平对生物分子的分布及浓度进行监测，有利于深入研究探索各种生理和病理过程，为生命科学的研究和重大疾病的诊疗提供更多依据.为了实现亚细胞水平靶标分子的精确检测，本课题组［61］设计了UV光响应的DNA探针，通过将其与UCNPs及线粒体靶向配体相结合，构建了DNA纳米传感器，实现了对活细胞线粒体中2种癌症相关miRNA的精准成像［图4（B）］.在该体系中，DNA传感系统由基于toehold介导的链置换反应设计而成.只有在PC基团被光解以后，靶标miRNA（miR-10b和miR-21）才能够通过两步连续的链置换反应将猝灭基团标记的互补链替换，从而恢复Cy5的荧光信号.因此，可以在DNA纳米传感器定位至线粒体后，通过NIR光照射远程开启其传感功能，特异性地对线粒体内miR-10b和miR-21进行关联性成像分析.鉴于该方法在miRNA空间限制性成像中的成功应用，本课题组［62］进一步开发了NIR光激活的细胞器靶向型纳米传感器，分别实现了对线粒体和细胞核内脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1（Human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1，APE1）活性的精准成像分析.利用该酶活纳米传感器发现，氧化应激刺激会引起APE1在亚细胞水平的动态迁移.在此基础上，本课题组［63］将APE1响应的DNA探针、光敏剂分子及线粒体靶向配体与UCNP相结合，构建了一种多功能的DNA纳米器件，实现了对光动力治疗过程中线粒体内APE1酶活的实时成像分析.

Fig.4 DNA-UCNPs for spatiotemporally selective molecular sensing and imaging

由于DNA的分子识别功能及UCNPs独特的光学性质，二者的有机结合在生物传感与成像方面显示出良好的潜力和应用价值，本文综合评述了该领域的最新研究进展.将该DNA-UCNPs体系分为3类：（1）DNA-UCNPs用于肿瘤靶向成像.该策略通过将具有靶向功能的DNA分子（如核酸适体）修饰于UCNPs表面，利用UCNPs独特的上转换发光对靶细胞和组织进行成像.（2）基于LRET机制的DNA-UCNPs生物传感器.该策略通过将UCNPs作为能量供体引入到DNA传感器中，不仅可以将激发光置于NIR窗口，还可以通过UCNPs可调的多色发光特性，实现比率型分子检测及多靶标成像.（3）DNA-UCNPs用于时空选择性分子成像.该策略将UCNPs作为控制模块，利用NIR光远程开启DNA传感模块的传感功能，从而实现“时-空”可控的分子成像.此外，将该策略与细胞器靶向配体相结合，可进一步在亚细胞水平对特定细胞器内的靶标分子进行精准成像分析.

尽管目前取得了一系列进展，但在未来的研究中仍有一些问题亟需解决.（1）在DNA-UCNPs用于肿瘤靶向成像的应用中，功能DNA分子通常以共价方式偶联至UCNPs表面，步骤繁冗，效率较低.此外，带负电的DNA和带正电的UCNPs之间存在较强的静电相互作用，DNA磷酸基团与UCNPs上稀土间存在强配位作用，这些均可能导致偶联后的功能DNA分子失去空间构象，从而丧失靶标识别的能力.因此，在未来的研究中，可通过引入能够保持核酸适体识别能力的三维DNA结构或削弱核酸适体与UCNPs之间相互作用的表面处理技术来应对该问题.（2）在基于DNA-UCNPs的LRET传感器中，UCNPs作为能量供体，基于LRET效应，以上转换发光或受体荧光来实现对目标分子的成像与定量分析.然而，以发光强度作为信号输出会受到组织深度不均等因素的影响，难以实现精准的定量分析.而发光寿命受上述因素的影响较小，因此可利用发光寿命作为信号输出，实现更为精准的分子传感与成像.（3）在DNA-UCNPs用于时空选择性分子传感与成像的应用中，DNA传感模块的激活效率与UCNPs的上转换发光效率紧密相关.已有研究显示，通过在UCNPs表面修饰适合的荧光团可显著提高光子的上转换效率［64］，在未来的应用研究中可以考虑利用相关方法提高DNA传感模块的激活效率.（4）由于UCNPs的激发光处于NIR窗口，其较高的组织穿透深度使得UCNPs在活体成像方面拥有着巨大的潜力［65，66］.最近，具有更深组织穿透深度的NIR-II区UCNPs也被用于活体传感及成像［67］.此外，UCNPs可调的多色发光特性使其还能够应用于活体水平的多色成像［68］.目前，DNA-UCNPs在细胞成像方面已取得了较大进展，然而其在活体成像中的应用仍处于初步阶段.因此，DNA-UCNPs在活体成像方面的应用具有广阔的探索空间.

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