食用果蔬酵素活性成分的对比分析及其体外降脂性能初探
时间：2023-02-12 16:15:06 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
商曰玲，夏晶晶，支柳，余晓红*
盐城工学院海洋与生物工程学院（盐城 224051）
食用果蔬酵素是一种以多种新鲜水果与蔬菜为原料，利用其自身含有的有益微生物自然发酵而产生的、含有多种营养物质的酵素产品[1-2]。食用果蔬酵素中含有丰富的有机酸、多酚类物质、多糖、维生素、生物活性肽、氨基酸、蛋白质等活性成分，具有抗氧化、调节免疫力等多种生理功能[3-4]。有研究表明，废弃的蓝莓皮渣加入酵母菌和植物乳杆菌混合发酵，发酵后还原力提高1.24倍，羟基自由基清除能力提高8.1%，DPPH自由基清除能力提高5.0%[4]。采用红心火龙果果皮发酵，可得产物中总酚和总黄酮含量最高，且具有最强的总·OH清除能力、还原性及抗氧化性。此外，果蔬酵素具有抑菌作用，可以起到维持面部洁净、抑制面部油脂的功效[5]。
食用果蔬酵素因其健康性和天然性，成为越来越受消费者欢迎的一类功能食品，主要用于营养保健、临床医学、养颜美容和亚健康调理等领域，而酵素在降脂性能方面的相关研究较少[6]。相关报道有采用糙米酵素提取物灌喂大鼠，其肝脏粗脂肪质量显著低于高脂对照组，从侧面表明糙米酵素提取物有预防脂肪肝的作用[5]。另有研究采用苹果、香蕉、胡萝卜、卷心菜、香菇、昆布及蓝莓等60余种新鲜水果、蔬菜、菇类、藻类及长白山特色野生植物等为原料，恒温发酵300 d以上，制得果蔬精华液，含有功能性低聚糖、氨基酸、有机酸等丰富的营养成分，具有改善人体内微生态环境、提高机体免疫力、延缓衰老及降低血清胆固醇等功效[7]。
试验通过多种蔬菜与水果制备食用果蔬酵素，测定酵素中的蛋白酶活性、还原性和抗氧化性，分析影响食用果蔬酵素物质活性的主要因素，通过测定脂肪酶活性、胆固醇酯酶活性抑制率和胆固醇胶束溶解度抑制率等指标研究酵素的体外降脂性能。通过对食用酵素活性成分等指标的分析评价及其降脂性能研究，对进一步阐明果蔬酵素的保健机理、高效定向开发食用酵素保健食品等具有重要意义。
1.1 果蔬酵素的制备
试验制作的酵素采用泰国乐素昆博士制作酵素的方法，按蜂蜜、果蔬、水为1∶3∶10的比例，置于阴凉通风处自然发酵6个月。不同配方的酵素按原料种类和消化性果蔬数目分类如下。
酵素A的原料为10种蔬菜，以产品器官为分类标准：（1）根菜类：胡萝卜、白萝卜；
（2）茎菜类：莲藕、洋葱；
（3）叶菜类：白菜、芹菜；
（4）花菜类：西蓝花、花菜；
（5）果菜类：西红柿、黄瓜。其中，包含胡萝卜、白菜、芹菜、西红柿、黄瓜5种助消化蔬菜。
酵素B的原料为10种水果，以水果特性为分类标准：（1）瓜类：西瓜、甜瓜；
（2）柑橘类：柠檬、甜橙；
（3）浆果类：葡萄、香蕉；
（4）仁果类：苹果、梨；
（5）核果类：桃子、黑布林。
酵素C的原料为5种蔬菜和5种水果，分别为胡萝卜、洋葱、白菜、西蓝花、西红柿、西瓜、甜橙、葡萄、苹果、桃子。
酵素D的原料为10种蔬菜和10种水果，分别为胡萝卜、白萝卜、莲藕、洋葱、白菜、芹菜、西蓝花、花菜、西红柿、黄瓜、西瓜、甜瓜、柠檬、甜橙、葡萄、香蕉、苹果、梨、桃子、黑布林。
酵素E的原料为20种助消化性的蔬菜和水果，分别为胡萝卜、白萝卜、芹菜、韭菜、黄瓜、西红柿、冬瓜、绿豆芽、青椒、南瓜、苹果、梨、甜橙、香蕉、黑布林、杨梅、火龙果、猕猴桃、芒果、西柚。
1.2 主要试剂
三氯乙酸、碳酸钠、盐酸、无水乙醇、氯化钠、胆固醇、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、铁氰化钾、钼酸铵磷酸、氢氧化钠、油酸、乙腈（均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；
硫酸、磷酸钠、磷酸氢二钠（均为分析纯，江苏彤晟化学试剂有限公司产）；
三氯化铁、橄榄油（均为化学纯，国药集团化学试剂有限公司）；
酪蛋白（化学纯，江苏彤晟化学试剂有限公司产）；
福林试剂、L-酪氨酸（均为生化试剂，国药集团化学试剂有限公司）；
酚酞（生化试剂，上海山浦化工有限公司）；
对硝基苯基丁酸酯（生化试剂，上海创赛科技有限公司）；
胆固醇酯酶（生化试剂，南京都莱生物技术有限公司）；
总胆固醇试剂盒（厦门海菲生物技术有限公司）。
1.3 仪器与设备
202-1A型电热恒温干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；
UV752N型紫外可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）；
FA1104型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；
HH-6型数显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；
80-1型台式离心机（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；
PHS-3C型pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；
KQ218型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
1.4 试验方法
1.4.1 蛋白酶活性的测定
采用福林法测定酵素的蛋白酶活性[8]。配制不同浓度梯度的L-酪氨酸溶液，加入碳酸钠溶液（42.4 g/L）5 mL，福林溶液1 mL，摇匀，于40 ℃水浴20 min，在波长680 nm处测得吸光度。以L-酪氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制作标准曲线。
样品的测定：取酵素1 mL，加入1 mL酪蛋白溶液（1%），于40 ℃水浴反应10 min后，立即加入2 mL三氯乙酸（65.4 g/L），摇匀，静置10 min后过滤，取滤液1 mL按照标准曲线的测定方法进行检测。对照试验测定方法同上，不同是将酪蛋白溶液与三氯乙酸的加入次序调换，使酶失活，参照标准曲线，计算酵素中蛋白酶的活性。
1.4.2 总抗氧化能力的测定
采用钼氨酸还原法测定酵素的总抗氧化能力[9]。制备20 mg/mL的维生素C标准溶液，分别取30，50，80和100 μL标准溶液定容至10 mL，将稀释过的溶液加入到反应体系中（0.6 mol/L硫酸，28 mmol/L磷酸钠，4 mmol/L钼酸铵），95 ℃水浴90 min。冷却至室温，以试剂空白做参比，于695 nm处测吸光度，绘制标准曲线。
样品的测定：将1 mL酵素加入到反应体系中，参照标准曲线测定方法，计算总抗氧化能力。
1.4.3 还原性的测定
采用铁氰化钾还原法测定酵素的还原性[10]。在试管中加入2 mL酵素、2 mL磷酸缓冲液（0.2 mol/L，pH 6.6）及2 mL铁氰化钾（10 g/L），于50 ℃反应20 min，加入2 mL三氯乙酸（0.1 g/mL），在3 000 r/min下离心10 min，立即取2 mL上清液，加入2 mL蒸馏水和0.4 mL三氯化铁（1 g/L），在700 nm处测吸光度。吸光度越高，还原性越强。
1.4.4 脂肪酶活性的测定
采用滴定法测定酵素的脂肪酶活性[11]。取若干个锥形瓶，加入1 mL橄榄油与5 mL磷酸缓冲液（0.025 mol/L，pH 7.5）中，以不含橄榄油为空白，40 ℃水浴5 min。将1 mL稀释20倍的酵素加入锥形瓶中，5 min后立即加入15 mL 95%的乙醇，酶反应终止。在每个锥形瓶中加入3滴酚酞指示剂，用氢氧化钠（0.05 mol/L）滴定至淡红色，记录消耗的NaOH的体积，按式（1）计算。
式中：X为样品的脂肪酶活性，μmol/mL；
V为滴定酵素时消耗NaOH体积，mL；
V0为空白试验消耗NaOH体积，mL；
50为0.05 mol/L NaOH溶液1 mL相当于脂肪酸50 μmol；
n为酵素稀释倍数；
5为反应时间5 min，以1 min计。
1.4.5 胆固醇酯酶活性抑制率的测定
胆固醇酯酶与对硝基苯基丁酸酯反应，生成黄绿色产物，根据溶液的吸光度判断样品的抑制活性[11]。称取5.844 g氯化钠与2.77 g牛磺胆酸钠，用磷酸钠缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.0）定容至100 mL，分别取1 mL缓冲液加入4支试管中，加入10 μL对硝基苯基丁酸酯（0.2 mmol/L）。在空白管中加入50 μL酶液，空白对照管中既不加酶液，也不加酵素，抑制管中加入50 μL酶液与25 μL酵素，背景对照管加入25 μL酵素，分别在405 nm处测定吸光度，抑制率按式（2）计算。
式中：A为空白管的吸光度；
B为空白对照管的吸光度；
C为抑制管的吸光度；
D为背景对照管的吸光度。
1.4.6 胆固醇胶束溶解度抑制率的测定
制备人体模拟胶束，加入酵素后，利用胆固醇试剂盒进行测定[11]。分别称取0.537 g牛磺胆酸钠、0.077 g胆固醇、0.141 g油酸及0.771 g氯化钠，用磷酸缓冲液（pH 7.4）定容至100 mL，利用超声波均质，37 ℃静置12 h。将空白对照，100 μL酵素分别加入到4 mL胶束溶液中，37 ℃培养2 h，并在16 000 r/min下离心20 min，收集上清液用总胆固醇试剂盒测定胶束中胆固醇含量（mmol/L）。胆固醇的溶解度按式（3）计算，相应的抑制率按式（4）计算。
式中：A为空白溶液的胆固醇溶解度，mmol/L；
B为样品溶液的胆固醇溶解度，mmol/L。
2.1 不同配方食用果蔬酵素中蛋白酶活性的对比分析
采用L-酪氨酸标准液绘制的标准曲线为y=0.012x-0.000 2，R2=0.983，其中，y为吸光度，x为L-酪氨酸溶液质量浓度（mg/L）。依据标准曲线，测得的不同配方食用酵素的蛋白酶活性见图1。
图1 不同配方食用果蔬酵素的蛋白酶活性
结果表明，由5种蔬菜和5种水果制备的酵素C的蛋白酶活性明显高于其余配方的酵素，而由10种蔬菜制备的酵素A具有最低的蛋白酶活性。采用水果为原料，相较于以蔬菜为原料的酵素含有较多的糖类物质与矿物质，促进酵素发酵过程中活性成分的产生。由20种果蔬制备的酵素D与E，果蔬种类较多，发酵较快，使酵素总酸提前下降，pH升高，蛋白酶活性降低[12]。酵素C果蔬种类适中，表现出较高的蛋白酶活性。
2.2 不同配方的食用果蔬酵素抗氧化性的对比分析
人类的衰老及心脑血管等疾病与各种活性氧和自由基有关[13]，因为人体内过量的自由基可以造成DNA损伤、蛋白质变性甚至是身体器官的病变[14]。
试验采用钼氨酸还原法，测定酵素的抗氧化活性。采用维生素C标准液绘制的标准曲线为y=0.002 5x+0.167，R2=0.992，y为吸光度，x为维生素C溶液的质量浓度（mg/mL）。依据标准曲线，测得的不同配方食用酵素的抗氧化活性见图2。
图2 不同配方食用果蔬酵素中的抗氧化性
结果表明，由5种蔬菜和5种水果制备的酵素C和10种水果制备的酵素B具有较高的抗氧化活性，且显著高于其他配方酵素。果蔬中具有抗氧化作用的物质主要有维生素C、维生素E、类胡萝卜素及多酚类物质等。在常见的几十种蔬菜中，莲藕表现最强的抗氧化性能，主要是其含有的多酚类物质起作用[15-16]，胡萝卜中含有较多的类胡萝卜素。水果中甜橙含有较多的维生素C，葡萄的葡萄皮色素也具有优良的抗氧化性，其抗氧化能力相当于维生素C的98%以上，具有抗氧化性的主要成分可能是花青素与花色苷[17]。酵素C中含有具有较强抗氧化性能的果蔬，并且为混合发酵，相比于单一蔬菜与水果发酵的酵素A与B，多种类的抗氧化活性物质共同作用使得酵素C表现出更强的抗氧化性。酵素D虽然在酵素C原料的种类上多加10种蔬果，在发酵初期可能表现出更强的抗氧化性，但因为种类过多，发酵速度过快，酚类物质消耗也较快[18]，因此按照正常的6个月发酵时间后，其抗氧化能力不断下降。酵素E的抗氧化性略低于酵素D，可能是因为酵素D中不含有抗氧化性最高的蔬菜莲藕。
2.3 不同配方的食用果蔬酵素还原性的对比分析
试验采用铁氰化钾还原法测定酵素的还原活性，在700 nm处测定不同配方酵素的吸光度，测量结果如图3所示。
图3 不同配方的食用果蔬酵素中的还原性
结果表明，由纯蔬菜制备的酵素A具有最低的还原活性，其他4种果蔬酵素还原活性没有明显差异。因水果中含有的还原性物质较蔬菜中多[19]，酵素B、D、E均含有10种不同的水果，而酵素C中只含有5种不同水果，酵素A中不含水果，因此酵素B、D、E表现出更高的还原性。
2.4 不同配方的食用果蔬酵素降脂性能的对比分析
体外降脂性能主要由脂肪酶活性、胆固醇酯酶抑制率和胆固醇胶束溶解度抑制率进行体现。胆固醇酯酶是催化胆固醇酯水解成胆固醇和脂肪酸的一种酶，抑制胆固醇酯酶的活性能够减少部分胆固醇的生成，降低其生物利用度。进入人体肠道内的胆固醇需要溶解于胆固醇胶束内才能被吸收，抑制胆固醇胶束溶解度就能有效抑制胆固醇的吸收，降低血液中胆固醇含量。不同配方食用果蔬酵素的降脂性能指标结果见图4～图6。
从图4可以看出，不同配方的酵素中脂肪酶活性大小依次为C＞D＞B＞E＞A，酵素C的脂肪酶活性最高，为160 μmol/mL，酵素A的脂肪酶活性最低，为40 μmol/mL。原花青素可以提高脂肪酶的活性，葡萄籽中的原花青素含量最高[20]，因此相比于酵素A、E，原料中均有葡萄籽的酵素B、C、D的脂肪酶活性较高。相比于只含有水果的酵素B，酵素C和酵素D的原料同时含有蔬菜与水果，天然有益微生物种类多，因此脂肪酶活性较高。酵素E的脂肪酶活性仅高于酵素A，表明消化性蔬果并不能提高酵素的脂肪酶活性。
图4 不同配方的食用果蔬酵素的脂肪酶活性
图5可见，不同配方的酵素的胆固醇酯酶活性抑制率大小依次为D＞C＞E＞B＞A。槲皮素对胆固醇酯酶具有较强的抑制作用[11]，含有槲皮素较高的水果有橙子、橘子、葡萄和香蕉等。蔬菜中莲藕含有的槲皮素最高，并且百合科葱属及十字花科蔬菜也含有较高的槲皮素[21]，其中，洋葱所含有的槲皮素仅次于莲藕。酵素D的果蔬种类多，且原料中含有具有较高槲皮素的多种果蔬，因此酵素D的胆固醇酯酶活性抑制率最高。酵素E中不含有莲藕、洋葱和葡萄等，因此相对于酵素C，其胆固醇酯酶活性抑制率较低。酵素A与酵素B均属于单一种类果蔬发酵，胆固醇酯酶活性抑制率较低。
图5 不同配方的食用果蔬酵素的胆固醇酯酶活性抑制率
图6为不同配方酵素的胆固醇胶束溶解度抑制率结果，不同配方的酵素的胆固醇胶束溶解度抑制率大小依次为D＞E＞C＞B＞A。5种酵素的胆固醇胶束溶解度抑制率与胆固醇酯酶活性抑制率大小比较相似。可能是因为槲皮素也可以降低胆固醇胶束溶解度。此外，植物甾醇对胆固醇胶束溶解度也有一定的抑制作用[11]，酵素E中含有梨、芒果、香蕉、猕猴桃、绿豆芽、韭菜、芹菜等含有较高植物甾醇的果蔬[22]，因此酵素E的胆固醇胶束溶解度抑制率较高于酵素C。
图6 不同配方的食用果蔬酵素的胆固醇胶束溶解度抑制率
通过分析不同配方食用果蔬酵素的降脂性能，发现蔬菜和水果为原料的食用酵素（C和D）具有较高的脂肪酶活性，较好的胆固醇酯酶活性抑制作用与胆固醇胶束溶解度抑制作用。较高的脂肪酶活性，可将食物中的油脂分解成甘油与脂肪酸；
通过抑制胆固醇酯酶活性，抑制体内胆固醇的生成；
通过降低胆固醇胶束溶解度，降低人体对胆固醇的吸收，在源头与过程中减少血液中胆固醇含量，达到降血脂的效果。因此，食用果蔬酵素是潜力巨大的降脂饮品，可用于降脂性能产品的开发应用。
试验发现酵素活性受发酵原料种类的多样性及成分的影响，如多酚类物质影响抗氧化性、原花青素影响脂肪酶活性、槲皮素和植物甾醇影响胆固醇酶活性及胆固醇胶束溶解度的抑制率。食用果蔬酵素具有降脂性能较，酵素产品在降血脂、降血糖等方面具有较大的研究前景与广阔的市场。
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