不同毛色巴什拜羊皮肤组织中LEF1、YWHAZ及WNT2基因差异表达

洪文娟，侯晨曦，何宗龙，决肯·阿尼瓦什

(新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052)

【研究意义】在哺乳动物生长过程中，被毛作为毛囊发育的皮肤衍生物，生长和稳固被毛是毛囊最主要的生理功能。毛囊中的毛囊干细胞不仅能够通过自分泌因子成纤维细胞生长因子18(fibroblast growth factor 18,FGF18)实现自我调节，还可以调节其周围黑色素细胞参与被毛颜色的形成过程，可以决定被毛的颜色[1]。【前人研究进展】Wnt信号因Wnt配体结合膜受体的不同而将Wnt信号分为三类[2]，其中最为经典的一类是Wnt/β-catenin信号通路[3]。被Wnt信号通路激活转录的靶基因是细胞特异性的。Wnt通路本身的调节也是多层次的，例如β-连环蛋白(β-catenin)、Frizzled(FZD)家族蛋白、肺耐药蛋白(lung resistance protein，LRP)、淋巴增强因子-1(lymphatic enhancement factor，LEF1)/T细胞因子-3(T cell factor 3，TCF3)正向的调控因子，也存在如Dickkopf(DKK)家族基因等反向的调控因子[4]。真皮中的Wnt信号在表皮基板的形成过程中是必不可少的。抑制基因Dkk1的异位表达在Wnt/β-catenin信号通路中会导致真皮中β-catenin以及LEF1基因表达出现缺失从造成表皮基板的正常形成受到阻碍[5]。无义突变的小鼠在胚胎时期会出现皮肤中缺少LEF1阳性表达的表皮基板，具有功能的Wnt蛋白的产生和分泌在基板的形成过程中是必不可少的[6]。LEF1基因敲除后小鼠的触须毛囊全部消失，被皮毛囊停止生长；
当LEF1基因过表达时也会影响到触须和毛发的正常生长[7,8]。Wnt/β-catenin信号通路能直接调控黑色素细胞特异表达基因如小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor，MIFT)等转录过程。MIFT同LEF1直接作用，协同上调多巴色素异构酶(dopachrome tautomerase，DCT)的表达。【本研究切入点】小鼠的LEF1基因被敲除之后虽然不产生黑素但是黑素细胞依然存在，LEF1基因涉及黑素细胞合成或者向邻近毛发角蛋白细胞转运色素的能力[9]。Wnt/β-actenin信号在毛母质细胞生长期具有调控其增殖和分化的作用，毛母质细胞内的LEF1基因表达及核内聚集的β-catenin,毛母质细胞内拥有活跃的Wnt/β-actenin信号。当毛囊角蛋白细胞分化形成毛干，其基因表达过程中研究发现存在启动子区域含有多个Tcf/LEF结合位点。上述角蛋白基因被认为是Wnt信号的靶基因[10]。WNT2基因是WNT家族的成员之一，在WNT2基因与肿瘤的形成和转移之间的分子机制研究有较多的成果[11，12]，在细胞的生长、增殖过程中WNT2基因发挥着重要的作用，揭示了在此过程中WNT信号作用的细胞类型，在毛囊形成的不同阶段WNT信号处在一个高度调节动态。WNT2基因具有潜在的研究价值，作为绵羊毛囊发育的潜在关键基因[13]。毛囊干细胞不仅实现自我调节，会调控其周围的黑色素细胞参与被毛颜色的形成[14]。酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5单加氧酶激活蛋白ζ(tyrosine3-monooxygenase/tryptophan5-monooxygenase activation protein zeta，YWHAZ)基因是14-3-3家族成员之一，YWHAZ表达的蛋白是一种中枢蛋白，有结合功能多样的信号蛋白的能力，包括跨膜受体、激酶和磷酸酶，在调节多种信号传导途径例如在Wnt/β-actenin信号通路、抑制细胞凋亡等发挥重要作用[15]。巴什拜羊皮肤中LEF1、WNT2、YWHAZ的表达情况与毛色之间相关性分析，尚未见到研究报道。【拟解决的关键问题】研究LEF1、WNT2、YWHAZ作为潜在的毛色候选基因在mRNA表达水平上与毛色之间的相关性，为研究Wnt/β-actenin 信号通路在毛囊黑色素干细胞中的分子运行机制提供理论依据。

1.1 材 料

1.1.1 试验动物

试验于2020年7月在新疆塔城地区裕民县开展，从新疆谢利盖畜牧有限公司随机挑选被毛为黑色和白色周岁健康的巴什拜羊各8只，每种毛色公和母各4只。在其肩胛部将被毛剃干净后用取皮器取皮肤组织2块，装入事先准备好的冻存管中，大小为1 cm2。迅速置于液氮罐中带回实验室用于总RNA的提取。

1.1.2 试剂和仪器1.1.2.1 试剂

Trizol Reagent、琼脂糖、无水乙醇、氯仿、异丙醇、超纯水、GoldView、PCR MasterMix(天根生化科技有限公司，北京)RNase-free ddH2O、5×TBE缓冲液(Solarbio，北京)、D2000 DNA Maker(天根生化科技有限公司，北京)反转录试剂盒(RevertAid First Strand Cdna Synthesis Kit)、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANgel Midi Purification Kit,天根生化科技有限公司，北京)、荧光定量试剂盒(Ribonuclease Inhibitor、SYBER Premix ExTaqTM天根生化科技有限公司，北京)。

1.1.2.2 仪 器

研钵；
移液枪(Thermo)；
超低温电冰箱购自海尔家电公司；
高速冷冻离心机购自Eppendorf公司；
超净工作台购自上海博讯实业有限公司；
LDZX-75KBS型立式压力蒸汽灭菌器购自上海申安医疗器械厂；
DYY-6C型电泳仪及琼脂糖水平电泳槽均购自北京市六一仪器厂；
Infinite M200型酶标仪购自上海研域仪器设备公司；
Gel Doc 2000型凝胶成像仪购自Bio-Rad公司；
Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪。

1.2 方 法

1.2.1 总RNA提取及cDNA合成

按照Trizol法提取巴什拜羊皮肤组织的总RNA，-80℃保存备用。取4 μL总RNA用于RNA品质的检测，用1.0%琼脂糖凝胶电泳，220V，15 min。再用分光光度计测定总RNA浓度，选出D260nm/D280nm值在1.8～2.0 RNA样品。最后按照反转录试剂盒说明合成cDNA。

1.2.2 引物设计与合成

比较GenBank中其它哺乳动物LEF1基因cDNA编码序列的同源性，借助Primer5.0plus软件，设计出1对扩增产物为108 bp引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。同理设计出YWHAZ，WNT2基因的引物。

1.2.3 巴什拜羊LEF1、YWHAZ、WNT2基因的特异性

取适量的反转录产物为模板，以特异性的引物进行PCR扩增。PCR反应体系25 μL：cDNA模板1 μL，2×TaqPCR Mix11μL，上、下游引物各0.5 μL，RNase-free aaH2O 7 μL。PCR反应循环数的设置：95℃预变性5 min；
95℃变性30 s，60℃退火30s，72℃延伸10s，37个循环；
72℃延伸5 min，4℃保存。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶检测。PCR产物纯化后送生工生物工程股份有限公司进行测序。

1.2.4 巴什拜羊LEF1、YWHAZ、WNT2基因定量

qRT-PCR反应体系20 μL：cDNA模板2 μL，2×SYBR Premix ExTaq10 μL，上、下游引物各0.5 μL，RNase-free aaH2O 7 μL。PCR反应程序：95℃预变性5 min；
95℃变形30s，60℃退火30s，37个循环；
95℃变性10s，65 ℃退火30s(65～95℃升温为0.50℃/s)。用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪完成。

1.3 数据处理

PCR和qRT-PCR反应结束后，以溶解曲线来判定qPR-PCR反应的特异性，根据CT值来计算定量结果。内参基因β-actin与目的基因LEF1，YWHAZ，WNT2，在同一条件下不同PCR管中进行扩增，每个样本设3个重复。

qRT-PCR数据用Microsoft Excel 统计分析，结果均用“平均值±标准差(Mean±SD)”表示。2-△△CT法计算LEF1，YWHAZ，WNT2在黑色与白色巴什拜羊皮肤中基因的相对表达量，△CT目的基因=CT目的基因-CT内参基因，△△CT=△CT白色组-△CT黑色组，目的基因在不同毛色绵羊皮肤中mRNA差异表达倍数以2-△△CT表示。采用单因素方差分析和显著性检验的方法，利用SPSS21.0软件对数据进行分析，运用GraphPad Prism 8 软件绘制柱形图。P<0.01 表示差异极显著，P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。利用转录组测序结果相互验证qRT-PCR结果，转录组织数据来源于对课题组前期研究，转录组的部分数据通过采用 (Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped，FPKM)片段法来计算转录水平。

2.1 总RNA提取及鉴定

研究表明，部分试验样品可以明显看到28S，18S，2条带亮度好，清晰度高，5S条带不明显，说明试验提取的总RNA完整性好。用核酸蛋白测定仪，RNA样品的OD260nm与OD280nm比较均值为1.8～2.0。RNA符合试验要求。图1

图1 总RNA质量检测

2.2 引物设计与合成

引物信息见表1。

2.3 巴什拜羊LEF1、YWHAZ、WNT2基因的特异性

研究表明，三条目的条带大小分别为108 bp，166 bp，131 bp左右，且条带清晰，无二聚体或非特异性条带,于预期片段大小一致。LEF1、YWHAZ、WNT2可在绵羊体内正常表达。LEF1通过测序获得的序列信息：CTCTATCCAGGCTGGTCTGCAAGAGACAATTATGGT-AAGAAAAAG AAGAGGAAGAGAGAGAAGCTACAGGAGTCCACA TCAGGTACAGGTCCAAGAATGACAGCTGCC。图2

实时荧光定量目的基因和内参基因引物序列：基因LEF1、YWHAZ、WNT2、β-actin，引物序列(5′→3′)分别为5′-CTCTATCCAGGCTGGTCTGC-3′ 5′-GGCAGCTGTCATTCTTGGAC-3′、5′-AACGAGCTGGTACAGAAGGC-3′ 5′-AAGATGACCTACGGGCTCCT-3′、5′-AACGCCTGTCTCGTTGGAAT-3′ 5′-GGCACGTTGTCACACATCAC-3′、5′-CTTCCAGCCTTCCTTCCTGG-3′ 5′-GCCAGGGCAGTGTATCTCTTT-3′，退火温度分别为55℃、58℃、57℃、57℃，GenBank序列号分别为NC_040257.1、NC_040260.1、NC_040255.1、NC_040275.1，PCR产物分别为108、166、131、97 bp。

WNT2通过测序获得的序列信息：AACGCCTGTCTCGTTGGAATCTGGCTCTGGCT-CCCTCTAC TTTACCTGG-CTCAGCCCTGAGGTCAGCTCTTCA TGGTGGTACATGAGAGC-TACGAGTGGCTCCTCCAGGGTGATGTGTGACAACGTGCC。

YWHAZ通过测序获得的序列信息：AACGAGCTGGTACAGAAGGCCAAACTGGCCG-AGC AGGCTGAGCGATATGATGACATGGCAGCCTGCAT GAAGTCTGTAACTGAGCAA-GGAGCTGAATTA TCAGGAATCTTCTCTCAGTTGCTTATAAAAATGTT GTAGGAGCCC-GTAGGTCATCTT。图2

注:M:DL2000 DNA Marker;1～3:β-actin基因；
4～8:YWHAZ基因；
9～11:WNT2基因；
12～14:LEF1基因

2.4 巴什拜羊LEF1、YWHAZ、WNT2基因的mRNA表达量

研究表明，绵羊皮肤组织中LEF1、YWHAZ、WNT2基因和β-actin基因qRT-PCR扩增曲线拐点清楚，平行性良好，符合“S”型标准；
溶解曲线有且只有一个峰，并且Tm值都在80～90 ℃，qRT-PCR反应中收集的信号都来自引物的特异性扩增。图3

2.5 LEF1基因在黑色和白色巴什拜羊皮肤中的qRT-PCR

研究表明，LEF1基因在黑色和白色巴什拜羊皮肤中均能表达。并且在皮肤中表达差异极显著(P<0.01)，黑色的表达量明显高于白色的表达量。表1

图3 3个目的基因与内参基因的溶解曲线图及扩增曲线

表1 LEF1基因在黑色和白色巴什拜羊皮肤中的qRT-PCR结果

WNT2基因在黑色和白色巴什拜羊皮肤中均能表达。并且在皮肤中表达差异极显著(P<0.01)，在黑色被毛的巴什拜羊皮肤中的表达量明显高于白色被毛的巴什拜羊的表达量。表2

YWHAZ基因在黑色和白色巴什拜羊皮肤中均能表达。并且在皮肤中表达差异极显著(P<0.01)。在黑色被毛的巴什拜羊皮肤中的表达量明显高于白色被毛的巴什拜羊的表达量。表3

表2 WNT2基因在黑色和白色巴什拜羊皮肤中的qRT-PCR结果

表3 YWHAZ基因在黑色和白色巴什拜羊皮肤中的qRT-PCR结果

2.5 LEF1、WNT2、YWHAZ基因的转录组信息和荧光定量对比

研究表明，LEF1基因mRNA在黑色绵羊皮肤中表达量是白色绵羊皮肤的10倍，WNT2基因mRNA在黑色绵羊皮肤中的表达量是白色绵羊皮肤的20倍，YWHAZ基因mRNA在黑色绵羊皮肤中表达量是白色绵羊皮肤的11倍。图5

LEF1、WNT2、YWHAZ基因在黑色巴什拜羊皮肤中的表达量均高于白色巴什拜羊皮肤中表达量。图6

注：**肩标表示差异极显著(P<0.01)

图6 转录组中LEF1、WNT2、YWHAZ基因的FPKM值

哺乳动物的毛囊(Hair Follicle，HF)存在几类干细胞群，作为功能性的器官，HF的再生依赖于不同干细胞相互之间及时且有组织的协调作用。HF的突起和次级毛基质细胞中不仅有上皮干细胞(epithelial stem cells，EpSCs)，还有与毛发颜色相关的黑色素干细胞(melanocyte stem cells，McSCs)。在HF生长的早期(agagen，生长期)，分化的McSCs通过将自身产生的黑色素转移给邻近的上皮细胞，在HF生长的晚期(telogen，休止期)，分化的色素细胞会随着小部分的HF的退化而凋亡[16]。研究表明，Wnt/β-actenin是调节McSCs分化和色素沉着的重要信号通路。McSCs自身不能产生Wnt的配体，但是研究发现表达角蛋白(keratin，Ks)的上皮细胞可以产生能够激活Wnt信号的配体。通过芯片分析技术和qRT-PCR找到了Wnt的直接作用位点是内皮素1(Endothelin1，EDN1)，在Wnt激活的上皮细胞中，伴随着EDN1的表达量的升高，表现为McSCs的增殖的升高。Wnt信号是偶联McSCs与EpSCs的关键信号通路，这两种干细胞群在毛囊生长期协同激活Wnt信号，黑色素干细胞中Wnt信号的激活促使其分化为产生黑色素的细胞，而上皮干细胞中Wnt信号不仅促使毛囊的形成而且在毛发再生过程中调节黑色素干细胞的增殖[6]。有研究表明局部应用十四烷酰佛波醇-乙酯(TPA)可以激活Wnt/β-actenin信号，刺激黑色素干细胞的增殖和分化，促进头发基质色素的沉着[17]。WNT2基因在毛囊的形态形成方面有重要作用，主要体现在调节毛发长度[6]。试验研究发现WNT2基因在黑色和白色被毛的绵羊皮肤中均有表达，且在黑色被毛皮肤中表达极显著高于白色(P<0.01)，WNT2在Wnt/β-actenin信号通路中作用的分子机制有待进一步研究。

LEF1和TCF3分别作为TCF和LEF家族中在毛囊发育方面发挥着重要作用的转录因子，LEF1主要在毛乳头(dermal papilla，DP)细胞、内根鞘(inner root sheath，IRS)、外根鞘(outer root sheath，ORS)和毛母质细胞(hair follicle matrix cell)中表达，而这些细胞可以定向分化成间充质细胞和前皮质细胞形成毛发[18]。当LEF1过表达时，导致β-actenin信号通路阻断，导致毛囊形态异常，促进毛囊干细胞分化成为皮脂腺和上皮细胞[19]。试验研究发现LEF1基因在绵羊的黑色和白色被毛皮肤中均有表达，且在黑色被毛中的表达极显著高于白色(P<0.01)。研究结果与杨磊等[20]在棕色和白色羊驼皮肤中LEF1基因差异表达趋势一致。β-actenin可以作为MITF基因特异性的靶启动子来激活转录[21]。MITF与LEF1的功能合作导致DCT基因启动子的协同转激活，DCT是一种早期黑色素细胞标记物，MITF/TFE3家族是一类新的LEF1核调节剂，保证Wnt信号在多种类型的细胞中有效传播[22]。DCT是酪氨酸酶合成家族的成员之一，作为黑色素合成的关键酶基因，产生的蛋白在黑色素合成过程中起主要的促进作用[23]。韩吉龙等[24]研究表明MITF基因的mRNA表达量在黑色被毛的藏羊皮肤组织显著高于棕黑色和白色被毛的藏羊。LEF1的变化趋势与MIFT和DCT一致，符合LEF1先前研究的调控机制。这一结果表明，LEF1很有可能参与了绵羊毛色形成的过程。

皮肤黑色素瘤产生于皮肤黑色素细胞的恶性转化，因肿瘤基因或者肿瘤抑制基因的突变积累到一定程度迫使黑色素细胞的异常增殖并扩散到身体的其它器官。黑色素瘤中细胞凋亡的“关闭”，导致其具有强大的生存能力[25]。代杰等[26]的研究结果显示对YWHAZ基因进行敲除后，皮肤中的黑色素细胞瘤细胞增殖出现减慢、细胞凋亡加快、细胞的迁移及侵袭能力减弱，并且研究显示黑色素瘤组织中YWHAZ的平均相对表达量明显高于良性痣中YWHAZ的平均相对表达量(P<0.01)。Konstantakou等[27]对WM-266-4转移性黑色素瘤的细胞株采用纳米液相色谱-串联质谱(nLC-MS/MS)蛋白质组学技术分析发现：YWHAZ对B型迅速加速性纤维肉瘤(B-type rapidly accelerated fibrosarcoma，BRAF)基因和MITF基因产生特异性相互作用，并且BRAF和MITF共同受YWHAZ的调控。BRAF作为皮肤黑色素瘤的靶点是最重要的小分子抑制剂。试验研究发现YWHAZ基因在黑色和白色被毛的绵羊皮肤中均有表达，且在黑色被毛皮肤中表达量极显著高于白色(P<0.01)，表达量为(4.15±0.230 0)是在正常范围内。YWHAZ通过调控MITF影响黑色素细胞的增殖和分化，以及通过这种相互作用影响黑色素细胞瘤的发生的分子机制有待进一步研究。

LEF1、WNT2及YWHAZ基因在不同毛色的巴什拜羊皮肤组织中均有表达。且LEF1、WNT2及YWHAZ基因在黑色绵羊皮肤中的表达量极显著高于白色绵羊皮肤(P<0.01)，LEF1、WNT2及YWHAZ参与毛色的形成过程，可作为绵羊毛色潜在基因研究与毛色之间的相关性。黑色被毛的巴什拜羊LEF1、WNT2、YWHAZ基因的表达量极显著高于白色被毛色的巴什拜羊(P<0.01)，LEF1、WNT2、YWHAZ基因与绵羊毛色的形成具有一定的相关性。

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