中药诱导间充质干细胞成骨分化信号通路的研究进展

黄泽宇，梁艳芳，曾今诚，邱贤秀 （1.广东医科大学东莞市医学活性分子开发与转化重点实验室，广东省医学分子诊断重点实验室，广东东莞 52808；
2.广东医科大学医学技术学院，广东东莞 52808；
.东莞市滨海湾中心医院/暨南大学附属东莞医院病理科，广东东莞 52900；
4.广东医科大学基础医学院，广东东莞 52808）

骨质疏松症（Osteoporosis）为常见的慢性代谢性骨病之一。间充质干细胞（MSCs）成骨分化能力下降被认为是其发生的主要原因之一。MSCs 早在1976 年便被Friedenstein 等[1]发现，其具有高度自我更新和多向分化潜能，如今已成为干细胞研究的热点。MSCs 来源广泛，在一定条件下可分化为成骨细胞，因其强大的修复潜力而被广泛用于骨质疏松症的治疗。MSCs 成骨分化的主要机制可简单概括为两种，一是通过添加生物活性因子或促成骨药物、物理刺激等直接激活细胞成骨分化的基因；
二是通过上述条件活化成骨分化相关通路，通路再激活成骨分化相关基因，最终发挥诱导间充质干细胞定向成骨分化的作用。研究表明MSCs在成骨分化的过程受到多种信号通路的调节[2-5]。目前间充质干细胞诱导成骨分化主要依靠成骨诱导培养基[6]。然而单纯使用传统成骨诱导培养基的诱导效率较低，因此常添加其他成分或改变培养基的环境来提高成骨分化的效率，但该过程中常存在多种缺点。中药来源广泛，副作用小，其治疗骨质疏松症具有多种独特优势[7-8]。本文旨在分析总结中药在诱导间充质干细胞成骨分化方面的国内外研究进展，综述中药在诱导间充质干细胞成骨分化过程中相关信号通路及机制，以期为骨科疾病的防治、再生医学、中医药开发、细胞与组织工程等科学技术领域的研究提供参考。

间充质干细胞的成骨分化是一个包含诸多信号因子的复杂过程，Wnt/β-catenin 信号通路是目前研究最多的促性成骨的关键经典通路，其参与了多种生物学过程。Wnt/β-catenin 信号通路主要包括Wnt 蛋白、β-连环蛋白（β-catenin）、糖原合成蛋白激酶-3（GSK-3β）、低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（LRP5/6）和卷曲（Frizzled）受体，其中β-catenin 是该通路的关键因子，其在胞质中的浓度控制着Wnt/β-catenin 信号通路的激活与关闭，在MSCs 定向成骨分化中起重要的调节作用；
GSK-3β 激酶能促进β-catenin 的磷酸化及泛素化降解，调节胞内β-catenin 浓度；
LRP5/6 和Frizzled受体作为受体与Wnt 蛋白结合以激活通路。该信号通路的主要调节机制为Wnt 基因被激活后生成Wnt 蛋白与LRP5/6 受体及Frizzled 受体结合后，激活细胞内蓬乱（DSH）蛋白以激活GSK-3β 结合蛋白（GBP），而GBP则抑制GSK-3β 激酶的生成，使胞内的β-catenin 浓度因无法被降解而升高，最后进入核内与T 细胞辅助因子（TCF）编码的蛋白质及淋巴增强因子（LEF）编码的转录因子结合，最后激活Wnt/β-catenin 信号通路下游的成骨相关转录因子。

淫羊藿苷（又名淫羊藿素）是淫羊藿的主要活性成分，可于各类淫羊藿的干燥茎叶中提取得到，因其具有促进骨代谢的作用而成为临床治疗骨质疏松症中的常用中药有效成分。研究发现淫羊藿苷可通过Wnt/β-catenin 信号通路调控MSCs 的成骨分化能力。李智奎等[9]通过荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）和Western blot 发现一定浓度的淫羊藿苷处理后Wnt7 和β-catenin 蛋白表达上调，而其抑制因子GSK-3β 的表达则下降，Wnt/β-catenin 信号激活促进了Runt 相关转录因子2（Runx2）和骨桥蛋白（OPN）等成骨相关基因的转录，最后诱导大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化。芝麻素是从花椒植物表皮与芝麻油中提取出的一类木脂素，广泛应用于多种疾病的临床治疗。研究表明芝麻素具有重塑骨骼结构、促进成骨分化的作用，然而其在促进MSCs 成骨分化中的作用却鲜有报道。马忠平等[10]通过免疫组化、免疫荧光和Western blot 实验发现芝麻素可以提高LRP5 蛋白的表达水平，促进其与配体Wnt 分子的结合以激活Wnt/β-catenin 信号，同时抑制GSK-3β 蛋白的合成，促进成骨分化相关基因OSX（成骨细胞特异性转录因子）、骨钙蛋白（OCN）、Runx2 和性别决定转录因子9（SOX9）的转录，以诱导大鼠BMSCs 成骨分化。冬凌甲草素是冬凌草的草质部分中具有生物活性主要的天然物质，副作用小，其在多种癌症、炎症与肿瘤的治疗中有着广泛的引用。近年来，有关研究发现冬凌甲草素能诱导成骨细胞分化与矿化，抑制破骨细胞的形成和功能，发挥了抗骨质分解的作用。蒯凤等[11]通过qRT-PCR 和Western blot 发现适当浓度的冬凌甲草素可以提高Wnt1 和β-catenin 的蛋白活性，被激活的Wnt/β-catenin 信号通路，使大量β-catenin 得以释放游离，与目的因子结合，激活成骨相关基因碱性磷酸酶（ALP）、细胞色素C 氧化酶1 号基因（Col-1）、Runx2 及OCN 的转录，以诱导大鼠MSCs 成骨分化。大豆异黄酮为大豆在生长过程中形成的一次生代谢产物，是一种具有雌激素样作用的天然活性物质，具有多种生物学作用，如抗氧化、抗血栓与降低炎性作用等，因此其在各种疾病的临床治疗中得到了广泛的应用。刘一栋等[12]通过qRT-PCR和Western blot 发现不同浓度的大豆异黄酮可提高Wnt1的表达水平，以此来促进其与LRP/Frizzled 等受体的结合，进而活化Wnt/β-catenin 信号通路，使之激活成骨相关基因Runx2、OPN 的转录，最后诱导大鼠BMSCs 成骨分化。目前关于大豆异黄酮促进间充质干细胞成骨分化的研究日益增多，大豆异黄酮在骨质疏松症的治疗价值开始得到认可，但其具体机制有待进一步研究。盘龙七片由盘龙七、当归、杜仲等二十九味中药有效成分组成，具有活血化瘀、祛风除湿等功效，临床上用于治疗骨性关节炎、骨折及骨质疏松症等多种骨科疾病。吴泽荣等[13]通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot 发现在最佳浓度下的盘龙七片可以上调Wnt3 与β-catenin 蛋白的表达水平，能促进Wnt 配体及其受体的结合医活化Wnt/β-catenin 信号通路，使大量的β-catenin游离并堆积，并与目的因子结合，激活成骨相关基因Runx2、OSX 与Col-a1 的转录，促进其蛋白的表达，最后诱导人BMSCs 成骨分化。尽管盘龙七片在骨科治疗中应用较为广泛，但其作用机制尚不明确，近年来已有不少研究人员发现其能通过调控多条信号通路诱导MSCs成骨分化，有助于进一步阐明其作用机制。

研究表明，Hedgehog（Hh）信号通路各种调节因子广泛存在于骨组织，在调节骨发育及维持骨组织稳态中起重要作用。该通路主要包括配体（Shh、Ihh、Dhh）、膜蛋白受体（Ptch、Smo）及转录因子（Gli1、Gli2、Gli3）。主要作用机制是上游的shh 配体（音猬因子）与patched 跨膜蛋白受体（膜蛋白受体Ptch）结合以解除后者对Smoothened 跨膜蛋白受体（Smo）的抑制作用，被解除抑制作用后的Smo 可激活下游锌指家族（Gli）转录因子，使其启动成骨分化相关基因的转录，促进MSCs 的成骨分化。

补骨脂素为补骨脂中的主要有效成分，具有抗骨质疏松、舒张血管及抗炎等多种功效，目前已被广泛应用于骨质疏松症的临床治疗中。韩宇等[14]通过酶联免疫吸附测定（ELISA）与荧光免疫检测发现补骨脂素含药血清可以上调通路中上游的启动信号因子 Shh配体的mRNA 及蛋白的表达，Shh 结合并下调patched跨膜蛋白受体1（Ptch1）mRNA 及蛋白的表达，以此解除Ptch1 对Hedgehog 信号通路下游的特异性转录因子Smo 的抑制作用，使得活化的Smo 激活Hedgehog 信号通路下游的转录促进因子Gli1，增加Gli1 蛋白的表达，从而促进大鼠BMSCs 成骨分化。目前补骨脂素在诱导MSCs 成骨分化的研究较为深入，但其促进MSCs在人体内的成骨分化的相关报道较为缺乏，有待进一步研究。补肾活血胶囊由多种中药浓缩制成，包括淫羊藿、杜仲、牛膝等，具有补肾健骨、填精益髓的作用。在骨质疏松症的临床治疗中，因其具有多成分、多靶点的特点而得到重视，亦有多项报道显示补肾活血胶囊能直接或间接对多个信号通路进行调控，以促进MSCs的成骨分化。梁学振等[15]通过Western blot 发现补肾活血胶囊含药血清能促进shh 配体的生成来使其结合Ptch 受体，解除Ptch 受体对Smo 的抑制作用，并激活Gli1 及Gli2 基因的表达，以上调成骨相关蛋白Runx2、Col-a1 的表达来促进大鼠BMSCs 成骨分化。梓醇为滋阴补肾中药地黄的主要活性成分，有关研究报道梓醇对于骨质疏松症具有一定的防治作用。赖满香等[16]通过定量聚合酶链反应（q-PCR）及Western blot 发现最佳浓度的梓醇能提高Shh mRNA 的表达，使其结合Ptch1 蛋白受体，激活Smo 及下游的Gli1 转录因子，增加Gli1 蛋白的表达量，以上调大鼠BMSCs 成骨相关基因来促进其成骨分化。目前有关梓醇诱导MSCs 成骨分化的研究也开始受到关注，但涉及的信号通路较多，具体的分子机制及潜在靶点有待进一步挖掘。左归丸是以菟丝子、川牛膝、山茱萸、山药等为主要有效成分的中药制剂，作为中药经典制剂，具有滋阴补肾的效果，在治疗骨质疏松症的临床应用中，其因疗效较好、副作用小的特点而引起了众多关注。高举会[17]通过ELISA 发现左归丸含药血清能上调提高Shh 蛋白的表达量，使其结合Ptch 受体以活化Smo，提高Gli1 蛋白的表达，最后促进大鼠BMSCs 中成骨相关基因的表达来促进其成骨分化。近年来，对于左归丸诱导MSCs 成骨分化的试验研究的数量也日渐增多，对其涉及的相关因子及信号通路的探究也在不断深入。柚皮苷为中药材骨碎补的主要成分之一，主要从柑橘类果皮中抽提而得，是一种天然黄酮类化合物，具有抗炎、镇痛、降血压等功效，还兼具无毒、绿色与环保等优点。有多项报道显示柚皮苷具有诱导成骨的潜力，引起研究者的广泛关注。周渊[18]通过荧光实时定量PCR 发现柚皮苷能上调通路Shh 配体对Ptch1 的结合，活化Smo 基因并促进下游Gli1 基因的转录，提高Gli1 蛋白的表达，最后激活成骨分化相关基因OCN、Runx2 的表达来促进人牙周膜干细胞hPDLSCs 成骨分化。随着探究的不断深入，越来越多的研究发现柚皮苷在诱导MSCs 成骨分化的过程中涉及多条信号通路，其具体的作用机制仍待进一步探索。

BMP/Smad 通路是调节成骨分化的经典通路，其在骨损伤相关疾病中的作用被广泛关注。该通路通过对间充质干细胞的自我分化和更新、细胞凋亡、迁移和增殖进行调节，发挥稳定胚胎发育和出生后组织体状态的作用。通路主要包括骨形态发生蛋白（BMP 膜蛋白）受体（BMPR-I A、BMPR-I B 及BMPR-Ⅱ）及Smad蛋白家族（R-Smads、C-Smads 及I-Smads）。配体激活后先结合BMP II 类受体，激活其激酶特性使BMP I 类受体磷酸化，之后促进Smad 蛋白的分泌；
Smad 家族中的R-Smads 被磷酸化的BMP I 类受体激活并结合C-Smads 形成复合物，该复合物进入核内可启动成骨相关基因的转录。

研究发现淫羊藿素可通过BMP/Smads 信号通路诱导MSCs 的成骨分化。訾慧等[19]通过RT-PCR 法和ELISA 实验发现淫羊藿素能促进BMP-2 及BMP-9 的分泌，增强其与胞外BMP II 类受体的结合，进而磷酸化BMP I 型受体，以激活通路下游的受体调节型Smads（R-Smads），使R-Smads 与共同通路型介体Smads（C-Smads）形成复合物并转移至核内，启动成骨相关基因骨谷氨酸蛋白（BGP）、Osterix、Runx2 及Col-1 的转录，诱导大鼠BMSCs 成骨分化。三七皂苷Fa，为中药三七中的一种有效活性成分，主要从三七的干燥根及根茎中提取分离而得，具有活血止血、抗炎、抗肿瘤等诸多功效。林燕平[20]通过Western blot 发现一定浓度的三七皂苷Fa 能促进BMP2 与BMP4 的分泌，增强其与BMP II 类受体的结合，使其磷酸化BMP I 型受体进而激活通路下游的Smad1 及Smad4，进而启动成骨相关基因Runx2 的转录，促进大鼠BMSCs 成骨分化。除三七皂苷Fa 外，目前从三七中还能提取出七十多种具有较强的生物活性的皂苷成分且有着不同的药理活性，因此得到了中医药研究人员的重视。然而目前三七皂苷Fa 治疗骨质疏松症的报道较少，且其在诱导MSCs 成骨分化过程中涉及多条信号通路，具体机制仍需要进一步探讨。木通皂苷D（又称川续断皂苷Ⅵ），为传统中药川续断的主要成分，有着抗骨质疏松、补肝补肾、抗氧化的功用。研究人员发现木通皂苷D 具有诱导MSCs 成骨分化的作用，其可能的作用机制是通过促进BMP 配体及其受体的激活，促进Smad1 与Smad5 蛋白的表达，进而激活成骨相关基因OCN、Runx2 的转录，促进小鼠BMSCs 成骨分化[21]。因其众多且明确的药理作用，目前木通皂苷D 已主要用于骨质疏松症的治疗中。固本增骨方由当归、党参等9 味中药构成，且不同成分间具有相互补益的效果，具有壮骨活血、健脾补肾的功效。大量的临床应用实践证明固本增骨方在骨质疏松症治疗中效果良好，具有多靶点、多途径的优点，因此引起了研究人员探究其具体作用机制的兴趣。宋敏等[22]通过RT-PCR 及ELISA 法发现固本增骨方含药血清在大鼠BMSCs 中上调了BMP2 及BMP4 的表达量，增强了其与BMP II 类受体的结合，促进BMP I 类受体的磷酸化，进而激活BMP/Smad 通路下游的Smad1，从而启动成骨相关基因Col-1、BGP、Runx2 及OPN 的转录，促进大鼠BMSCs 成骨分化。有相关研究发现，柚皮苷诱导MSCs 成骨分化的过程中涉及了BMP/Smad通路。宁宇[23]通过qPCR 及Western blot 发现不同浓度梯度的柚皮苷可促进BMP2 的表达，以此增强其与BMP II 类受体的结合BMP I 类受体的磷酸化，增加Smad5 和Smad8 的蛋白表达量，并使它们与C-Smads形成复合体转移至核内，进而激活成骨相关基因Runx2及OSX 的表达，诱导兔BMSCs 成骨分化。

Notch 信号通路是广泛存在于动物组织细胞中介导细胞间信号传递的重要途径之一，在细胞的生命活动中承担重要作用，其进化模式高度保守，调节细胞增殖、分化及凋亡，对细胞活动和骨骼发育具有重要意义[24]。有研究表明Notch 信号通路能调控细胞成骨分化方向，在MSCs 成骨分化中扮演重要角色[25]。该通路主要包括Notch 受体、Jagged 配体（锯齿蛋白）与Hes基因（发状分裂相关增强子），其配体与受体都为细胞膜表面蛋白。其中Notch 受体与Jagged 配体结合后，经过三次蛋白水解反应后激活Notch 信号通路并形成胞外NICD（Notch 胞内结构域），NICD 经过胞质进入核内与着丝粒结合蛋白 1（CBF1 蛋白）结合，将转录抑制因子转化为转录活化因子，活化靶基因Hes 后可调节成骨相关基因。

大麻二酚为著名的传统中药材大麻中提取的非成瘾性成分，具有镇痛、抗惊厥、抗炎等多项特性。多项研究证明大麻二酚具有众多药理功效，并且不存在精神活性与药物依赖性，使得大麻二酚在临床应用中得到重视与广泛应用。近年来，众多研究人员发现大麻二酚可通过多种机制诱导MSCs 成骨分化。王伟峰等[26]通过RT-PCR 及Western blot 发现大麻二酚能提高Notch1 蛋白的表达水平，促进受体Notch1 与其配体的结合以激活Notch 通路，释放具有活性的Notch 胞内结构域NICD，NICD 进入细胞后通过形成新的复合体来激活Notch 通路下游的靶基因Hes-1 的转录，增加了Hes-1 蛋白的表达量，最终促进成骨相关基因Col-1、OCN、Runx2 的转录，以诱导人牙龈间充质干细胞hGMSCs 的成骨分化。刺五加苷为中草药刺五加中提取的主要药用成分，具有益气健脾，补肾安神功效，作为一种无毒副作用的天然活性物质受到各领域研究者的青睐，目前已应用于多种疾病的临床治疗中。虽然缺乏其治疗骨质疏松症的报道，但近年来亦有研究人士开始探究其在诱导MSCs 成骨分化的作用。黄月等[27]通过RT-qPCR 及Western blot 发现刺五加苷能上调Notch1 蛋白的表达水平，促进其与配体的结合来活化并释放NICD，激活Hes-1 基因的转录和表达，最终上调成骨分化相关基因Runx、OSX、OCN、骨唾液酸蛋白（BSP）的转录，诱导大鼠BMSCs 成骨分化。淫羊藿苷在诱导MSCs 成骨分化的过程中同样存在Notch信号通路的介入。邓宇等[28]通过RT-PCR 及Western blot 发现最佳处理浓度的淫羊藿苷能促进Notch 通路受体Notch1 及配体Jagged-1 的蛋白表达，使二者结合以激活Notch 信号通路，进而作用于Notch 通路下游的Hes-1，最终上调Runx2 的转录以诱导大鼠BMSCs成骨分化。研究表明，固本增骨方亦可通过Notch 信号通路诱导MSCs 成骨分化。周灵通[29]通过PCR 和Western blot 发现最佳浓度的固本增骨方含药血清能促进Notch1 蛋白的表达，使其与配体结合以活化Notch 通路形成NICD，进入细胞与核内带有CBF1 的转录抑制因子蛋白结合使之转化为转录活化因子，进而作用于Notch 通路下游的靶基因，最终上调成骨相关因子Col-1、BGP、Runx2 的转录，诱导大鼠BMSCs成骨分化。

间充质干细胞具有多向分化潜能与自我更新能力，在一定诱导条件下，MSCs 可实现向成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞及肌肉细胞等多向分化。因此，作为一种较为理想的“细胞种子”，诱导间充质干细胞分化为成骨细胞对治疗成骨细胞生成障碍或功能失调等相关疾病有着重要意义[30]。中药来源广泛，生于自然，较常规治疗药物具有更丰富的结构和生物活性，是巨大的药物分子宝库；
目前已有大量研究证实中药单体或中药提取物具有诱导间充质干细胞成骨分化的作用，其中可能涉及多条成骨细胞分化相关通路[31]，表明中药在促进间充质干细胞成骨分化的研究中有极大潜力。

本综述分析并总结了近年来中药单体在调控成骨细胞分化方面的作用及相关信号通路的研究进展，并探讨中药诱导间充质干细胞成骨分化的作用机制。虽然现有研究已经明确中药在诱导间充质干细胞成骨分化中的调控作用，但是这些研究以单信号通路研究为主，缺乏多通路交叉关联的信号调控网络研究，未能彻底地揭示其调控的具体机制，也未能充分体现中医药的独特优势。后续仍需更多的研究工作去探索和挖掘这些不同信号通路各自发挥作用的分子机制及各通路间的相互联系。

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