传统针刺疗法对波塞冬第三分组POR患者IVF-ET辅助治疗效果及细胞因子的影响：随机对照研究
时间：2023-01-23 22:30:02 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
杨婷，苟文婕，王薇，赵翠，陈学良，马晓玲，王雅琦，张学红
(兰州大学第一医院生殖医学中心，甘肃省生殖医学与胚胎重点实验室，兰州 730000)
随着辅助生殖技术的发展，体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术能够解决大多数不孕症患者的生育问题，然而仍有20%的不孕症患者在IVF-ET治疗中表现出对促性腺激素(Gn)刺激反应不良，获卵数少、优质胚胎率及临床妊娠率低，被称为卵巢低反应(POR)[1]。近年来，文献报道POR患者的发病率呈现逐年上升且年轻化的趋势，其IVF-ET临床妊娠率仅为11.5%，周期取消率为34.4%[2]。如何提高POR患者辅助生殖助孕活产率，解决生育力低下问题，逐渐受到生殖医学界的广泛关注。
传统针刺疗法是一种安全绿色疗法，在辅助生殖领域应用广泛，目前关于其提高IVF-ET临床妊娠率的作用尚存在争议[2]。本课题采用波塞冬POR分类标准，选取满足第3分组标准[3]的患者，即年龄<35岁、抗苗勒管激素(AMH)<1.2 ng/ml、基础窦卵泡计数(AFC)<5个。目的在于综合考量POR患者的年龄、卵巢储备及反应性，减少研究中的人群异质性，规避年龄对活产率的直接影响，期望更精确探究传统针刺治疗对POR患者卵子质量、妊娠结局及卵泡液中相关因子的表达，以及对于颗粒细胞线粒体DNA(mtDNA)拷贝数的影响。
一、研究对象及分组
选取2017年10月至2020年10月年因不孕症在兰州大学第一医院生殖中心行IVF-ET治疗的POR患者为研究对象。
纳入标准：年龄<35岁；
符合POR波塞冬标准第3分组诊断标准[3]；
因女性输卵管因素行辅助生殖治疗患者；
促排卵方案采用改良微刺激方案。
排除标准：因放、化疗或药物使用等引起的POR；
处于严重内科疾病急性期；
近期(3个月内)服用中药、使用理疗或者艾灸者；
合并严重子宫畸形、宫腔粘连、腺肌症、子宫内膜异位症者；
合并男性因素不孕者；
夫妇因染色体异常行胚胎植入前遗传学检测(PGT)助孕者；
改良微刺激方案当月移植者。
根据临床试验最低样本量30例，考虑允许脱落率为20%，通过SPSS 20.0计算样本总病例数为109例。采用随机数字表法进行分组，由SPSS 20.0软件自动生成随机数字，将不同的数字卡片放在纸袋中密封。根据患者就诊顺序，随机抽取信封，其中抽取的数字卡片为单数者纳入针刺治疗组(针刺组)共50人，抽取的数字卡片为双数者纳入空白对照组(对照组)共59人。
剔除标准：受试者依从性差，不能坚持研究治疗方案者；
治疗中出现严重不良反应及严重并发症，或促排卵过程中因低反应取消取卵者；
因其他原因自行要求退出者。
本研究方案经兰州大学第一医院伦理委员会批准(审批号：LDYYLL2020-164)，所有研究对象均充分知情同意后签署知情同意书。
二、治疗方案
1.针刺治疗：采用房繄恭教授的“房氏调经促孕十三针”方案，选取关元、大赫(双)、气海、肾俞(双)、中极、足三里(双)、三阴交(双)、太冲(双)、太溪(双)穴[4]。具体实施中，关元、大赫(双)、气海、肾俞(双)、足三里(双)各穴直刺1～1.5寸；
中极、三阴交(双)、太冲(双)、太溪(双)各穴直刺0.5～1寸。腧穴要求得气，留针期间每隔10 min平补平泻法行针1次，共留针30 min。于促排卵前连续2个月于患者早卵泡期开始每日针刺1次，共10 d；
促排卵期间从促排卵第1天开始针刺10 d，共计3个周期。针刺治疗由同一位副主任针灸医师独立完成。对照组不进行针刺治疗。
2.IVF-ET治疗：患者均采用改良微刺激促排卵方案。在月经第2天予来曲唑(江苏恒瑞医药)2.5 mg/d共5 d，同时给予尿促性腺激素(HMG，珠海丽珠医药)150～300 U/d，根据卵泡生长情况及激素水平适时调整药物用量。当主导卵泡直径大于18 mm时扳机，注射重组HCG(默克雪兰诺，德国)250 μg，34～36 h后取卵，常规行IVF。获得优质胚胎冷冻保存，择期行冻融胚胎移植(FET)。
3.FET：FET周期均采用人工周期方案准备内膜。患者月经周期第3～5天予戊酸雌二醇(补佳乐，拜耳，德国)4～6 mg/d共14～18 d，经阴道超声监测内膜厚度≥8 mm时予口服地屈孕酮(雅培，荷兰)30 mg/d和阴道放置黄体酮软胶囊(益普生，法国)600 mg/d行黄体转化3 d，选择冻融复苏的优质卵裂期胚胎进行移植，移植术后持续黄体支持至验孕日。
4.妊娠判定：移植后两周检测血HCG阳性(HCG≥5 U/L)但B超未见孕囊者为生化妊娠；
移植后4周阴道超声观察到宫内妊娠囊及胎心搏动为临床妊娠；
患者孕28周以上胎儿出生有生命迹象为活产。
三、实验操作
1.卵泡液及颗粒细胞收集：患者取卵术后，保留直径≥18 mm成熟卵泡的清亮卵泡液，常温下2 000 r/min离心，取上清液-80℃冰箱保存待检；
取沉淀置于2 ml 50% Percoll液中，4 000 r/min离心10 min，去除血细胞，吸出两层界面处的颗粒细胞，重复加入2 ml 50% Percoll液，吸出漂浮絮状颗粒细胞，PBS清洗2次，-80℃冰箱保存待测。
2.卵泡液细胞因子检测：酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒(上海恒远生物)测量卵泡液β-内啡肽(β-EP)、间隙连接蛋白43(Cx43)、骨形态发生蛋白-4(BMP-4)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、环氧合酶-2(COX-2)水平。实验采用双抗体夹心法酶联免疫分析，用特异性抗体包被于固相载体，经过洗涤之后再加入待测样品(含抗原)，经过保温孵育洗涤等一系列操作后，进行显色之后测定，测定出欲测抗原(底物)的量。
3.颗粒细胞DNA提取及mtDNA拷贝数定量检测：采用柱式法DNA抽提试剂盒(上海生工)抽提DNA，通过实时定量PCR(Real time-PCR)方法，选取高度保守序列ND1(mtDNA管家基因)作为目的基因，HGB基因作为内参，通过相对定量方法计算mtDNA拷贝数。ND1基因引物：上游5′-CCCTAAAACCCGCCACATCT-3′，下游5′-GAGCGATGGTGAGAGCTAAGGT-3′；
HGB基因引物：上游5′-GTGCACCTGACTCCTGAGGAGA-3′，下游5′-CCTTGATACCAACCTGCCCAG-3′。MT-ND1扩增条件是：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，40个循环；
HGB的扩增条件是：95℃ 10 min，95℃ 15 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s，40个循环。采用实时定量PCR分别得到两组的颗粒细胞中目的基因ND1和HGB的CT值，通过2-ΔΔCT的计算方法得到相对表达量。
四、观察指标
研究对象的一般资料，包括年龄、不孕年限、体质量指数(BMI)、AFC、AMH水平；
促排卵指标，包括促排卵天数、促排卵用药总量、获卵数、卵泡输出率[HCG日成熟卵泡数(直径16～22 mm卵泡)/基础窦卵泡数(直径3～8 mm卵泡)×100%]、MⅡ卵率(MⅡ卵母细胞数/总获卵数×100%)；
受精及胚胎培养/移植结局，包括2PN数、2PN受精率(2PN数/MⅡ卵母细胞总数×100%)、优质胚胎率(优质胚胎数/2PN数×100%)及累计活产率(获得活产的患者数/一次取卵周期患者数×100%)等。
五、统计学方法
一、患者助孕资料
本研究共纳入109例POR波塞冬第3分组患者，随机分为针刺组(50人)和对照组(59人)两组。两组患者均无中途脱落，无失访病例，无不良反应发生病例。
1.患者基础资料：两组患者间年龄、不孕年限、BMI、AMH、AFC比较均无统计学差异(P>0.05)(表1)。
表1 两组患者基础资料比较(-±s)
2.患者助孕过程及结局资料：针刺组MⅡ卵率显著高于对照组(P<0.05)；
两组患者间其他促排卵、胚胎发育指标比较均无统计学差异(P>0.05)；
两组间解冻移植日内膜厚度及累计活产率比较均无统计学差异(P>0.05)(表2)。
二、卵泡液中卵子发育相关因子和炎症因子表达
针刺组患者卵泡液中ICAM-1及COX-2浓度均显著低于对照组(P<0.05)，而两组间卵泡液中β-EP、Cx43、BMP-4浓度比较均无统计学差异(P>0.05)(表3)。
表2 两组患者助孕过程及结局资料比较[(-±s)，%]
表3 两组患者卵泡液细胞因子浓度比较(-±s)
三、颗粒细胞mtDNA拷贝数
本研究采用实时定量PCR分别得到两组患者颗粒细胞中mtDNA管家基因ND1和HGB的CT值，通过2-ΔΔCT计算相对表达量。经t检验，针刺组和对照组ND1和HGB的相对表达量差异无统计学意义(P=0.835)，提示两组间线粒体基因拷贝数无统计学差异(P>0.05)(表4)。
表4 两组患者颗粒细胞mtDNA拷贝数比较(-±s)
四、安全性评价
针刺组与对照组患者治疗前后检测血、尿常规及肝肾功能和心电图均未见明显异常，均未出现卵巢过度刺激综合征(OHSS)及取卵后出血等不良事件。
目前POR患者发病率逐年上升且年轻化，该类患者IVF-ET妊娠率仍不理想。文献报道给予POR患者300 U促性腺激素(Gn)启动剂量，IVF促排卵周期活产率仅为11%[5]。有研究表明导致POR的危险因素包括年龄、遗传、免疫、环境、卵巢手术、放化疗等[6]，提高POR患者IVF-ET临床妊娠率的关键靶点在于提高IVF-ET治疗中的卵泡输出率及胚胎质量，以下措施目前较为常用：优化促排卵方案，添加生长激素、脱氢表雄酮(DHEA)、抗氧化剂等，卵母细胞线粒体移植技术，传统中药及针灸疗法等[7]。本研究旨在探讨传统针刺治疗对于POR患者IVF-ET治疗中胚胎质量及卵泡发育相关因子表达的影响。
一、传统针刺治疗对IVF累计妊娠率及活产率的影响
近年来国内外发表的多项临床试验及系统评价对于针刺疗法是否能改善IVF妊娠结局尚存在争议。多项研究表明针刺治疗可以提高IVF-ET患者的临床妊娠率[8-9]；
而2017年美国生殖医学会(ASRM)指南中指出辅助针刺治疗不能改善妊娠结局[10]；
Smith等[11]研究显示，针刺不能提高接受IVF-ET治疗患者的活产率，但国内王亚楠等[12]指出Smith等[11]的研究所选取的患者群体、针刺选穴、刺激量及介入时机，以及患者自身状况不同造成研究结果异质性大。另有研究表明，在IVF-ET治疗中辅助传统针刺及激光针刺疗法能够缓解患者紧张，改善患者心理压力等情绪问题[13]。
本研究中针刺组与对照组患者累计活产率无统计学差异(P>0.05)，分析原因可能与选取人群有关。有研究表明年龄是预测围产期结局和累计活产率的关键参数[8]，本研究中选取波塞冬第3分组的POR患者，年龄<35岁，排除子宫畸形及男方因素性不孕，前期均募集到优质胚胎，所以两组累计活产率均能达到50%左右。本研究中传统针刺治疗3个周期并不能提高波塞冬第3分组POR患者的累计活产率，但因本研究样本量较少，针刺治疗是否能提高IVF-ET患者的累计活产率仍需要多中心、同质化的大样本临床研究来验证。
二、传统针刺治疗对POR患者的作用
本研究结果表明针刺组较对照组POR患者MⅡ卵率显著提高(P<0.05)。Haahr等[7]指出，针对波塞冬第3分组的年轻POR人群，IVF-ET的困难在于如何提高卵泡输出率和募集优质胚胎。李晓彤等[14]指出针刺对于卵巢储备功能低下(DOR)的患者有一定的治疗作用，其研究发现针刺调经促孕治疗可以改善DOR患者的卵巢储备功能，且安全性较好。本研究中两组POR患者获卵数无统计学差异(P>0.05)，卵泡输出率均达到80%以上，受精率及优质胚胎率无统计学差异(P>0.05)，但针刺组MⅡ卵率显著提高(P<0.05)，平均优质胚胎数略高于对照组，虽无统计学差异，但对于AFC<5个的POR患者来说，多1个可用优质胚胎可相对增加POR患者移植机会。
三、传统针刺辅助治疗后卵泡液细胞因子指标变化
在本研究中，两组患者卵泡液中β-EP、Cx43、BMP-4表达无统计学差异(P>0.05)。卵泡液为卵母细胞的发育提供了非常重要的微环境，卵泡液相关生化指标可以反映卵子成熟度及后期胚胎发育潜能[15]。Tam等[16]发现β-EP水平在IVF患者获得形态成熟卵母细胞的卵泡液中较未成熟卵母细胞卵泡液中含量低，认为卵巢局部分泌β-EP，卵泡液中少量的β-EP与卵母细胞发育潜能有关。本研究中针刺组与对照组卵泡液β-EP浓度未见明显差异，提示针刺治疗可能并不影响卵巢局部分泌β-EP。BMP-4为转移生长因子-β(TGF-β)超家族一员，是卵泡生长发育过程中的促进因子，参与卵巢内调节系统，其能促进始基卵泡向窦前卵泡转化和生长[17]。Cx43表达于颗粒细胞与卵母细胞之间，进行新陈代谢物质传递及双向信息交流，在卵泡选择过程中发挥重要作用[18]。本研究中两组患者卵泡液中Cx43、BMP-4表达均无明显差异，由此我们推测传统针刺治疗在卵泡早期募集阶段可能发挥作用不大。
本研究中，针刺组患者卵泡液中ICAM-1、COX-2水平较对照组显著降低(P<0.05)。ICAM-1被称为CD54，在白细胞和内皮细胞中少量表达，在白介素-1(IL-1)等作用下在多种类型的细胞中表达上调，参与调节炎症反应和免疫应答[19]。COX-2是一种环氧酶同工酶；
细胞受到刺激后，经过一系列信号转导促进其表达，催化前列腺素合成，参与炎症反应[20]。有研究表明在卵巢干细胞体外培养实验中，炎性因子可能干扰其正常功能并引起卵巢干细胞凋亡[21]。本研究中针刺治疗能够降低卵泡液中ICAM-1、COX-2分泌水平，一定程度上抑制了IVF-ET促排卵治疗中的过度炎症反应，对于卵子发育具有正性作用。
四、传统针刺辅助治疗后颗粒细胞mtDNA表达变化
颗粒细胞是组成卵冠丘复合物的主要细胞成分，为卵母细胞提供ATP合成底物、相关类固醇激素及生长因子，保护卵母细胞免受氧化应激损伤[22]。颗粒细胞mtDNA拷贝数可以直接反应线粒体生物学功能，与胚胎质量密切相关。有研究表明优质胚胎较劣质胚胎mtDNA拷贝数明显增高[23]。本研究中，两组患者间颗粒细胞mtDNA拷贝数无统计学差异(P>0.05)，针刺组略有增高的趋势，这与针刺组的优质胚胎数略高于对照组的趋势一致，但考虑到本研究样本量有限，后续还需要大样本研究进行进一步的探讨。
五、POR患者辅助传统针刺治疗的中医辨证学分析
中医学认为肾主生殖，司开合，为生殖之本。POR不孕症患者归属为“不孕”“闭经”“血枯”等范畴，发病大多与肝郁脾虚、肾精不固、天癸、冲任和子宫功能失调，脏腑气血亏虚，冲任不能相资，影响胞脉胞络的功能[4]。
POR患者在促排卵阶段表现为肾阳匮虚、脾失健运，肝气郁滞、气滞血瘀，气血失衡[14]。中国中医科学院针灸医院房繄恭教授根据患者发病特点，选取疏肝解郁、滋补脾肾、调理冲任气血的穴位，配合恰当的补泻手法形成“房式十三针”方案[4]。本研究遵循“房式十三针”经典选穴方案，主要选穴任冲二脉，足三阴经及膀胱经的穴位；
常用腧穴是以任脉的中极、关元、气海，针之可固肾益精、调节冲任；
胃经的足三里，针之可健脾和胃、扶助正气；
脾经的三阴交，针之可健脾益肾、通络调经、补血活血；
膀胱经的肾俞，针之可有效刺激盆腔神经，影响盆腔内生殖活动；
肾经的大赫，肝经的太冲等为常用首选要穴。以上诸穴相互配伍，攻补兼施。
综上，在辅助生殖治疗中辅助针刺治疗由来已久，针刺疗法做为一种安全绿色的补充治疗方法，具有多层次、多水平、多靶点的综合治疗作用。本研究发现，波塞冬POR第3分组患者IVF-ET治疗中辅助3个周期传统针刺治疗能够提高MⅡ卵率，降低卵泡液中炎性因子ICAM-1、COX-2的分泌，但对于妊娠结局的影响不大。提示传统针刺疗法可能通过降低卵泡液中炎性因子水平发挥改善卵子质量的作用，但需要更进一步的研究加以验证。
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