CDKN2A/B基因多态性在颅内动脉瘤形成过程中的功能分析
时间：2023-01-21 20:05:03 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
张利通 李冉 许红旗 梁洪磊
安阳市人民医院神经外科（河南 安阳 455000）
颅内动脉瘤（intracranial aneurysms）是多因素导致的复杂疾病，是遗传和环境共同作用的结果。颅内动脉瘤在人群中的发病率为3.2%[1]，一旦破裂就会导致蛛网膜下腔出血，生存率低，并且伴有严重的后遗症[2]。颅内动脉瘤每年的破裂率为1%，大部分颅内动脉瘤患者终身未破裂[3]。全基因组分析证实了一些基因位点与颅内动脉瘤的形成相关[4-5]。多中心研究结果重复定位在染色体9p21上的基因位点：CDKN2A/B；
该基因突变与颅内动脉瘤的形成有很强的关联性[6]，但是这些研究并没有深入研究颅内动脉瘤形成的遗传机制。
CDKN2A为细胞周期蛋白依赖激酶2A，CDKN2B为细胞周期蛋白依赖激酶2B，这两个基因编码p16INK4a（CDKN2A的外显子1α，2和3编码），p14ARF（CDKN2A的外显子1β，2编码），p15INK4a（CDKN2B编码）。有研究表明，从鼠身上分离出血管平滑肌细胞原代培养，通过调节CDKN2A/B的表达，会引起平滑肌细胞的过度增殖或凋亡[7]。平滑肌细胞在颅内动脉瘤的发生中起着重要作用，因此这个发现很可能提示CDKN2A/B和颅内动脉瘤的形成的潜在关系。但是国内外尚没有在动物或人体动脉瘤壁组织中探索该基因的突变在颅内动脉瘤的形成过程中的作用。因此，本文旨在探索该基因参与颅内动脉瘤的形成中的具体机制。
1.1 研究对象病例组为安阳市人民医院神经外科在2017-2021年间行开颅夹闭颅内动脉瘤的过程成功取下动脉瘤壁组织的82例患者；
对照组为本院同期收治的114例入院头CTA检查无颅内动脉瘤的头外伤患者。病例组：男41例，女41例，年龄（53.34±11.420）岁，高血压42例，高血脂28例，糖尿病12例；
对照组：男65例，女49例，年龄（51.17±10.519）岁，高血压46例，高血脂38例，糖尿病10例。
1.2 方法82例离体瘤壁组织被液氮迅速冷冻，并保存于-80℃冰箱。因1例组织过小实验中未得到相应图片及数据，有效标本为81例。使用免疫荧光显示瘤壁中p15INK4b/p16INK4a蛋白的表达，通过荧光染色区域的比例对比不同基因型的表达量。每个研究对象均使用EDTA抗凝管留取2 mL静脉血标本，并提取DNA，选取CDKN2A/B相关的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms SNP）位点（rs1333040，rs700651，rs10757278，rs10757272，rs6475606）并进行基因分型，选取的SNP位点均为既往全基因组分析以及文献中报道与颅内动脉瘤显著相关的[5]。冰冻动脉瘤壁组织中提取RNA，使用RT-PCR技术检测动脉瘤壁中p16INK4a，p15INK4b的表达水平，组织内 p16INK4a，p15INK4b蛋白表达量采用Western blot方法测定。每位患者均签署知情同意书，并经过安阳市人民医院伦理委员会审查。
1.3 统计学方法采用SPSS 25.0软件进行统计分析，在病例组和对照组之间对每个SNP位点的等位基因频率和基因型频率进行统计，采用Pearson检验的统计方法在病例组和对照组之间比较SNP位点基因频率之间的差异，并计算位点的相对风险度比值比（OR）及其95%CI。计量资料以（）表示，计数资料以例（%）表示。经方差齐性检验后（P＞0.05）采用独立样本t检验进行组间比较。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 动脉瘤壁组织表达p15INK4b/p16INK4a蛋白预实验通过对动脉瘤壁组织进行免疫荧光染色，可见p15INK4b/p16INK4a蛋白荧光染色，验证动脉瘤壁组织内表达p15INK4b/p16INK4a蛋白（图1）。
2.2 病例组和对照组的临床特征分析两组年龄、性别、高血压、高血脂、糖尿病、吸烟、饮酒等相关特征，结果两组间差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1，进一步对两组间相关SNP位点进行分析。
表1 病例组和对照组的临床特征Tab.1 Clinical characteristics of case group and control group 例（%）
2.3 SNP与颅内动脉瘤的关联分析使用114例对照组及82例颅内动脉瘤患者外周血，提取DNA，对CDKN2A/B相关基因的SNP位点进行基因分型，在两组间行统计学分析发现，rs10757272位点等位基因T的频率高于对照组（P=0.029，OR=1.658，95%CI：1.051 ～ 2.614）。其余的基因位点差异无统计学意义，见表2。
表2 病例组和对照组SNP基因型和等位基因频率Tab.2 SNP genotypes and allele frequencies in patients and controls例（%）
2.4 rs10757272位点基因型与CDKN2A/B的表达水平之间的关系在81例颅内动脉瘤壁组织中，研究rs10757272位点基因型与CDKN2A/B的表达水平之间的关系，可以观察到该SNP位点不同基因型的p16INK4a、p15INK4bmRNA水平有差异，在T/T基因型中p16INK4amRNA低水平转录（P＜0.01），p15INK4mRNA也为低水平转录（P=0.014）。在T/T基因型中在p15INK4b蛋白为低水平表达（P=0.027），p16INK4a蛋白的表达水平差异无统计学意义（P=0.089），但是有相似的低表达趋势（图2）。
2.5 免疫荧光对比rs10757272位点不同基因型与p16INK4a，p15INK4b在动脉瘤壁中表达水平进一步验证rs10757272位点不同基因型与p16INK4a，p15INK4b在动脉瘤壁中表达水平的关系，采用免疫荧光的方法标记动脉瘤壁，计算平滑肌细胞染色区域中p16INK4a，p15INK4b各自染色所占比例，结果显示有T等位基因的SNP基因型p15INK4b低比例染色区域（P=0.037），p16INK4a差异无统计学意义（P=0.065）（图3、4）。
推测9p21区域的相关突变SNP位点通过调节CDKN2A/B基因的表达，引起p15和p16的改变，导致细胞周期蛋白D（cyclin D）与CDK4、CDK6不能发生相互作用。cyclin D-CDK4/6复合物不能被激活，使相关蛋白不能磷酸化，进而使转录抑制复合物Rb-E2F不能解聚，不能释放E2F转录因子，从而细胞不能增殖，并进入凋亡阶段。
全基因组和一些可重复性研究表明，位于9p21染色体上的CDKN2A/B基因位点突变是动脉瘤发生的主要因素。CDKN2A/B编码p16INK4a和p15INK4a，分别是CDK4（细胞周期素依赖蛋白激酶4）和CDK5（细胞周期素依赖蛋白激酶5）的抑制因子，其定位于染色体9p21。其通过抑制E2F，从而抑制E2F介导的细胞增殖基因的表达，从而抑制细胞增殖，为调节细胞增殖的基因，在调节细胞周期和抑制细胞增殖方面起着重要的作用[8-10]。在纯合子风险基因患者的动脉粥样硬化板块中分离出的平滑肌细胞提示p16和p15蛋白表达减少、细胞增殖增加；
敲除大鼠9p21同源序列基因后发现主动脉平滑肌细胞中CDKN2A/B的表达减少，平滑肌细胞的增殖明显增加，并且无法进入凋亡阶段[7]。一些研究结果同样表明，该基因通过细胞周期调节因子抑制血管壁的平滑肌细胞增殖[11-13]。但尚不清楚它们是否在人类血管系统中发挥类似的作用。
以前相关研究中均为外周血有核细胞中提取DNA研究相关位点的突变与动脉瘤的相关性[14]。但本研究为了探索相关位点的突变与动脉瘤发生的潜在机制，研究的是不同基因型颅内动脉瘤患者离体动脉瘤瘤壁中相关基因在转录和蛋白的合成上的差异。本文中所选SNP位点经统计分析后发现rs10757272在两组之间差异存在统计学意义，因此，笔者认为该位点与颅内动脉瘤显著相关。并且在国外报道中不同的人群和种族中得出相同的结论：rs10757272位点与颅内动脉瘤之间存在显著关联[5]。LI等[15]针对中国人群的研究中得出rs10757272与IA显著相关；
有关文献认为该位点与冠状动脉疾病显著相关[16-17]。为进一步探索该SNP位点突变与颅内动脉瘤的形成的潜在机制，进一步分析rs10757272位点不同的基因型与动脉瘤壁组织内CDKN2A/B的表达水平的关系。通过检测动脉瘤壁组织中基因表达产物p15INK4a、p16INK4a的水平，发现rs10757272位点的不同基因型与CDKN2A/B的表达水平上存在差异。尤其是本研究发现该位点TT基因型上动脉瘤壁中p15INK4a为低水平的表达，p16INK4a为低表达趋势。rs10757272位点基因型与p15INK4a、p16INK4a的表达水平相关，在T等位基因上p15INK4a的低表达，在C等位基因上表达较高。p15INK4a/p16INK4a在不同基因型中的表达的差异，导致平滑肌细胞的塑性，平滑肌细胞的塑性在动脉血管病变中起着关键作用，如在动脉硬化的形成过程中扮演重要角色[18-20]。平滑肌细胞的塑性亦可导致血管壁的顺应性下降，可能为动脉瘤形成的重要因素。并且在不同的基因型患者中，动脉瘤壁中的CDKN2B转录的mRNA有显著的差异，并且在相应的蛋白水平上存在差异，因此本研究认为该位点的突变会引起颅内动脉血管壁平滑肌细胞结构的改变，导致动脉壁结构的变化，在外界因素的干预下导致动脉瘤的形成。
本研究以IA患者的离体动脉瘤瘤壁作为研究对象，直接探索了rs10757272位点不同基因型在瘤壁内的表达水平，但本研究结果只是初步探索SNP位点不同基因型与颅内动脉瘤之间的潜在机制，不能从动态上了解该位点参与颅内动脉瘤形成过程中的具体机制，需进一步行细胞培养，动态了解其参与颅内动脉瘤形成具体过程。
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