非小细胞肺癌ALK基因FISH检测出现不典型信号的处理方法
时间：2023-01-20 20:05:04 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
黄浩祺，刘志华，陈 洁，赵盼盼，张科平，崔 倩，林丹义，许 洁
间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphomakinase, ALK)基因融合在我国非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中的发生率约5.6%[1]。《中国非小细胞肺癌ALK检测临床实践专家共识》指出FISH是ALK基因易位检测的经典方法，在进行FISH结果判读时，对于存在不典型信号的病例，建议使用其他技术平台进行复检[2]。本文收集1 690例行ALK-FISH检测的NSCLC福尔马林固定石蜡包埋标本，并对其中ALK-FISH检测出现不典型信号的病例行Ventana ALK免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)检测及二代测序(next generation secjuencing, NGS)检测，寻找最佳的复检技术方案，以提高ALK基因检测的准确性。
1.1 材料收集2018年1月～2021年6月广东省人民医院病理科存档的1 690例行ALK-FISH检测的NSCLC福尔马林固定石蜡包埋标本。
1.2 主要仪器与试剂ALK BA探针(06N43-020，美国Vysis公司)，FISH预处理试剂盒Paraffin Pretreatment Kit Ⅱ(07J02-002，美国Vysis公司)，抗ALK兔单克隆抗体(D5F3，Roche公司)，DNA提取试剂盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(56404，德国Qiagen公司)，人多基因突变检测通用试剂盒(RS03F-12，燃石医学)，人多基因突变检测捕获探针-朗清(RS060-12，V4，燃石医学)；
杂交仪(S500-24，美国ThermoBrite公司)，荧光显微镜(BX51，日本Olympus公司)，全自动免疫组化染色仪(Ventana-Benchmark Ultra，罗氏公司)，高通量测序仪(illumina，MiSeqDx，美国)。
1.3 FISH检测切片应用FISH预处理试剂盒Paraffin Pretreatment Kit Ⅱ进行预处理，再滴加ALK BA探针，于杂交仪上80 ℃变性5 min，37 ℃孵育过夜，洗片后加入DAPI复染，即可在荧光显微镜下观察信号。结果判读在100×物镜下观察癌细胞胞核的FISH结果并进行信号计数和比值计算(表1)。ALK-FISH切片由两名经验丰富的医师采用双盲法进行判断，所有病例判读结果一致。
表1 ALK基因FISH结果判读方法
1.4 Ventana ALK(D5F3) IHC检测ALK-IHC检测使用罗氏诊断公司的Ventana ALK(D5F3)抗体诊断试剂盒，选择与ALK-FISH检测出现不典型信号病例相同的肿瘤组织蜡块，切片进行全自动IHC流程，显微镜下观察结果，检测过程中分别设阴、阳性对照。采用二元判别法，即ALK阳性判断标准：无论着色细胞多少，只要肿瘤细胞胞质内出现强染色颗粒，即判定为阳性。ALK-IHC由两位经验丰富的医师采用双盲法观察判断，所有病例判读结果一致。
1.5 基因组DNA提取选择与ALK-FISH检测出现不典型信号病例相同的肿瘤组织蜡块，切取10 μm厚组织8片，应用石蜡组织DNA抽提试剂盒提取DNA。
1.6 二代测序(next generation secjuencing, NGS)文库构建应用人多基因突变检测通用试剂盒，将上一步提取的样本DNA随机打断后连接上接头，选择人多基因突变检测捕获探针(朗清)进行杂交后对目标基因进行捕获，最后得到终文库。
1.7 二代测序上机根据MiSeqDx高通量测序仪标准操作流程操作，终文库变性后在测序仪上进行高通量、高深度测序，生信人员对下机数据进行分析解读。
1.8 统计学分析采用SPSS 20.0软件对所有数据进行统计学分析，采用χ2检验进行变量分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
ALK-FISH检测1 690例NSCLC福尔马林固定石蜡包埋标本，其中6例出现FISH信号不典型，差异无统计学意义(P>0.05)；
5例ALK基因呈现出除融合和(或)断裂分离信号外单独存在一个绿色信号却不伴有相应的橙色(图1)，其中1例经NGS检测存在EML4-ALK基因融合，且其ALK-IHC结果为阳性；
1例细胞核除了有融合信号之外，还有单独的细小橙色信号(图2)，即单独橙色信号直径较正常细胞信号直径小，该例经NGS检测未检出ALK基因重排/点突变/插入/缺失/拷贝数变异，且其ALK-IHC结果为阴性(表2)。
表2 ALK-FISH结果不典型病例Ventana ALK(D5F3)IHC及NGS检测结果
图1 FISH检测ALK基因呈现出除融合和(或)断裂分离信号外单独存在1个绿色信号 图2 FISH检测ALK基因呈现出除融合和(或)断裂分离信号外单独存在1个细小橙色信号
我国NMPA批准了包括Ventana ALK(D5F3) IHC、FISH、RT-PCR、NGS 4个检测平台的ALK基因检测伴随诊断试剂。Ventana ALK(D5F3) IHC检测操作简单、检测成本较低，但结果判读易受其他因素影响；
NGS检测可以利用少量样本获得多基因多位点的突变信息，并利用这些突变信息为患者选择合适的靶向治疗[3]，但NGS检测成本高，不适合在临床推广；
RT-PCR仅能检测出已知突变；
FISH检测是ALK基因易位经典的检测方法，几乎能够检测所有ALK基因重排，具有较高的准确性和可靠性，在针对ALK阳性的NSCLC的临床试验中，大部分研究检测ALK融合均采用FISH技术。因此，FISH一度被认为是ALK基因融合检测的金标准，在许多医院进行常规开展。出现FISH检测信号不典型，实验室首先要排除实验问题，再针对具体病例进行分析，选择合适的方法进行复检验证。
本组6例ALK-FISH检测信号不典型，应用NGS和IHC复检，两种技术检测结果一致。2例复检结果与FISH相反，1例ALK单绿信号经IHC及NGS复检均呈阳性，另外1例多出细小橙色信号经过ALK-IHC及NGS复检均呈阴性。在临床实践中根据ALK-FISH试剂盒判读标准，除了融合和(或)断裂分离信号之外，还单独存在1个绿色信号却不伴相应的橙色信号为阴性，主要原因可能是ALK抑制剂(已批准的有克唑替尼、色瑞替尼、阿乐替尼等)作用的目标区域位于橙色探针结合区域，当这一部分缺失，判读为阴性，但有文献报道，部分该类型的病例经其他技术平台验证，存在ALK基因融合，且对ALK抑制剂治疗有效，Takeuchi等[4]研究分析认为，该类型的病例ALK探针橙色部分未完全缺失，剩余区域包括ALK激酶的结构域由于太短，无法在福尔马林固定石蜡包埋标本上清晰观察到橙色的荧光信号。细胞核除有融合和(或)断裂信号之外，还有单独的橙色信号判读为阳性，当出现多出的橙色信号点较正常信号点小的情况应警惕，排除FISH实验操作原因，出现这种结果首先考虑有可能是该区域部分基因扩增或细胞处于分裂间期染色质螺旋松疏呈颗粒状不均匀分布于细胞核中，由于切片原因，在不同断层显示信号弥散而非ALK基因发生断裂重排。
综上所述，对于ALK-FISH信号不典型病例，应谨慎对待，尽量选择1～2种或以上技术进行复检，本实验选择IHC及NGS法进行复检，获得一致结果。Ventana ALK(D5F3) IHC操作简单、检测成本较低，建议首选IHC，但是当标本由于处理不当或者保存时间过长等出现质量问题时，IHC染色易出现非特异性染色或者染色强度不足影响判读[3]，所以有条件的单位可以选择加做NGS或RT-PCR进一步验证，分析ALK基因的真实状态，尽可能避免漏、误诊。
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