miR-16-5p通过靶向YWHAQ调控乳腺癌耐药细胞的凋亡与迁移能力
时间：2023-01-20 10:35:11 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
朱海涛，毛慧兰，陶 爽，王文锐，陈昌杰，杨清玲
1蚌埠医学院癌症转化医学安徽省重点实验室，2蚌埠医学院肿瘤基础研究与临床检验诊断重点实验室，3生物技术教研室，4生物化学与分子生物学教研室，安徽蚌埠233000
2020年，世界女性乳腺癌新发病例数超过220万，超过肺癌发病数而成为全球癌症首要发病原因，是第五大肿瘤致死因素［1］。当前，临床乳腺癌治疗措施包括手术治疗和各种抗肿瘤药物治疗，抗肿瘤药物他莫昔芬、曲妥珠单抗和紫杉醇等是乳腺癌药物治疗中常用的药物［2］，然而抗肿瘤药物耐药往往导致治疗过程被迫中断。因此，迫切需要阐明乳腺癌耐药细胞对抗肿瘤药物的分子机制，为临床治疗乳腺癌化疗耐药提供支持。非编码RNA多是一类不能编码蛋白质的RNA，研究发现非编码RNA在乳腺癌细胞耐药诱导中发挥着关键的作用［3,4］。miR-16-5p在肝癌、宫颈癌和肺癌等肿瘤中可影响肿瘤细胞对放化疗药物的敏感性，减弱放化疗药物的杀伤作用［5-7］，并有研究发现miR-16-5p还能抑制乳腺癌细胞生长［8,9］。但miR-16-5p在乳腺癌化疗耐药中的研究尚未见报道。YWHAQ属于14-3-3家族，有研究通过数据分析发现，当患者乳腺发生病变时，YWHAQ表达量会升高，且YWHAQ还能够影响乳腺癌的治疗效果以及预后情况［10,11］。目前尚缺乏YWHAQ影响乳腺癌耐药细胞活性的实验性验证。本研究希望通过分析miR-16-5p调节YWHAQ的表达，阐述二者影响乳腺癌紫杉醇耐药细胞生物学活性的分子机制，为临床治疗乳腺癌化疗耐药提供有效的靶点。
1.1 材料
1.1.1 临床标本 临床标本选自2019年1月～2022年1月间在蚌埠医学院第一附属医院以及蚌埠市第三人民医院进行手术治疗的乳腺浸润性癌及其癌旁组织（与肿瘤均不在同一象限且与肿块边缘相距5 cm）共13 对，病理结果均得到病理医师确认。纳入标准：女性，通过手术或穿刺活检病理确诊为乳腺癌者，乳腺癌组患者均符合《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范（2015版）》［12］中的诊断标准；
无其他系统疾病；
术前无相关抗肿瘤药物治疗史；
临床资料完整者等。排除标准：术前已接受抗肿瘤药物治疗者；
既往乳腺癌治疗复发者；
发生肿瘤转移者；
伴有其他恶性肿瘤者；
合并其他器官严重受损者等。本实验已通过蚌埠医学院伦理委员会伦理审查。
1.1.2 一般资料与临床病理特征 收集的乳腺浸润癌患者均为女性，年龄43～87岁。根据美国肿瘤联合会第8版乳腺癌分期标准（TNM法），其中临床分期为Ⅰ～Ⅱ期的患者共11人，Ⅲ期共2人。淋巴结转移（+）共4人。免疫组化结果：ER（+）共11人，PR（+）共10人，HER-2（+）共8人。
1.1.3 细胞株 人乳腺癌亲本细胞（SKBR-3）购自中国科学院细胞研究所；
紫杉醇耐药细胞（SKBR-3/PR）由课题组构建［13］。
1.1.4 试 剂 DMEM 培养基（Hyclone）；
Trazol（Invitrogen）；
PCR 试剂盒（GeneCopoeia 和Vazyme）；
miR-16-5p类似物、抑制剂和YWHAQ干扰片段、双荧光素酶报告载体（GenePharma）；
Bax、Bcl-2和β-actin抗体（Proteintech）；
YWHAQ抗体（Abclonal）；
细胞周期与凋亡检测试剂盒（Beyotime）；
双荧光素酶报告检测试剂盒（Promega）。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 SKBR-3和SKBR-3/PR细胞均使用含10%的FBS（胎牛血清）的完全培养基。SKBR-3/PR细胞培养过程中使用低浓度紫杉醇维持耐药性。当细胞融合度培养至80%～90%可传代。
1.2.2 细胞转染 取8×104对数生长期的SKBR-3/PR细胞接种于六孔板内；
当培养细胞融合度达到70%左右时，更换无血清培养基，按各实验分组要求添加相应的转染片段，6 h后更换含10%FBS的完全培养基。
1.2.3 qRT-PCR检测RNA表达水平 Trazol裂解细胞提取总RNA，逆转录合成cDNA，稀释后进行qRT-PCR。U6和GAPDH分别为miR-16-5p与YWHAQ的内参。U6和miR-16-5p的引物由广州易锦生物（GeneCopoeia）公司合成提供，GAPDH和YWHAQ引物由生工（上海）公司合成提供。qRT-PCR反应程序：首先设置95 ℃预变性10 min，然后以95 ℃10 s、55 ℃20 s与72 ℃10 s为一个循环，进行40～55 个循环，结果取平均Ct值，相对表达量以2-ΔΔCt法计算。
1.2.4 Western blot检测细胞蛋白水平 在细胞转染48 h后收集各处理组细胞，依细胞量加入裂解液，于冰上充分裂解。样品变性后电泳，200 mA转膜2 h。室温封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗（1∶8000）孵育2 h 后曝光。蛋白条带经灰度值扫描得到结果，经归一化处理后统计作图。实验中使用的各蛋白抗体稀释比如下：YWHAQ（1∶1500），Bax（1∶5000），Bcl-2（1∶6000），β-actin（1∶4000）。
1.2.5 Transwell实验 将小室放入加了完全培养基的24孔板内，向上室缓慢加入6×103个转染培养24 h后的SKBR-3/PR细胞。培养24 h后取出小室，经固定、染色、晾干后，拍照并计数穿孔细胞数。
1.2.6 CCK-8实验 向96孔板中加入SKBR-3/PR细胞悬液（2×103/孔），当密度达到70%左右进行转染。依次在培养24、48、72 h与96 h时拿出培养板，各孔加入CCK-8试剂，37 ℃孵育1 h后在450 nm处测定吸光度值A450nm。
1.2.7 细胞周期实验 在转染24 h后，收集各处理组细胞，PBS洗涤，1000g离心5 min，70%乙醇重悬并4 ℃固定，过夜后弃去固定液，加入RNaseA和碘化丙啶，37 ℃避光30 min后，使用流式细胞仪检测各期细胞比例。PBS与乙醇均需提前冰浴预冷处理。
1.2.8 细胞凋亡实验 使用无EDTA胰酶将各实验组细胞消化下来，2000 r/min离心5 min，PBS重悬，离心弃上清，吸取结合液和染液将细胞混匀。室温避光10 min后，使用流式细胞仪观察各实验处理下细胞凋亡情况。
1.2.9 双荧光素酶实验 实验以YWHAQ-WT+miRNA阴性对照组/miR-16-5p 类似物组、YWHAQ-MUT+miRNA阴性对照组/miR-16-5p类似物组分4 组。转染培养24 h后，依据试剂说明书测出各组荧光值。实验结果以两种荧光素酶荧光活性比值作为基因的活性值。
1.3 统计学方法
采用SPSS16.0进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，两组采用独立样本t检验，多组采用单因素方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。
2.1 miR-16-5p 在乳腺癌组织中表达水平较低
通过qRT-PCR检测miR-16-5p在乳腺癌临床样本间的差异表达，结果发现乳腺肿瘤组织中的miR-16-5p表达水平相对于癌旁组织显著降低（-1.19±1.90vs1.59±1.76，P＜0.01，图1A）。通过Kaplan Meier-plotter数据库分析发现，在乳腺癌患者中，miR-16低表达的患者预后较差（P＜0.01，图1B）。
图1 miR-16-5p在乳腺癌中的表达与预后Fig.1 Expression of miR-16-5p in breast cancer tissues and outcomes of the patients.A:Ex-pression of miR-16-5p in breast cancer tissue and adjacent tissue.B: Kaplan-Meier survival curves of breast cancer patients with high and low expressions of miR-16-5p.**P＜0.01 vs adjacent tissue.
2.2 miR-16-5p在乳腺癌化疗耐药细胞中表达水平较低
通过qRT-PCR 实验检测发现，相对于SKBR-3，SKBR-3/PR 细胞中miR-16-5p 的表达水平明显降低（P＜0.01，图2A）。通过qRT-PCR实验验证miR-16-5p类似物与抑制剂的作用效果，结果显示，相对于对照组，阴性对照组的miR-16-5p的表达量变化无统计学意义，而miR-16-5p 类似物能够显著上调SKBR-3/PR 细胞miR-16-5p的表达量（P＜0.01，图2B），miR-16-5p抑制剂能够显著下调细胞miR-16-5p表达量（P＜0.01，图2C）。
图2 qRT-PCR检测miR-16-5p在不同组中的差异表达Fig.2 Expression of miR-16-5p in SKBR-3 and SKBR-3/PR with different treatments detected by qRT-PCR.A: Expression of miR-16-5p in SKBR-3 and SKBR-3/PR cells.B,C:Transfection efficiency of miR-16-5p.##P＜0.01 vs SKBR-3,**P＜0.01 vs control.
2.3 miR-16-5p对乳腺癌耐药细胞的增殖、迁移及凋亡的影响
通过CCK-8实验，在耐药细胞中转染miR-16-5p类似物48 h 后，耐药细胞的活性开始降低（P＜0.01，图3A）。此外，细胞周期实验结果显示，相对于对照组，转染miR-16-5p类似物后，SKBR-3/PR细胞周期停滞在G0/G1期[（55.61±1.99vs43.06±1.53）%，P＜0.01，图3B]。细胞凋亡实验结果显示，相对于对照组，miR-16-5p类似物能够促进耐药细胞凋亡[（10.37±0.23vs3.10±0.97）%，P＜0.01，图3C]。同时，Transwell 结果显示miR-16-5p 类似物组的穿膜细胞数较空白对照组明显减少，细胞迁移能力被抑制（125.25±6.34vs250.75±20.84，P＜0.01，图4A）。而在转染了miR-16-5p抑制剂以后，miR-16-5p抑制剂组耐药细胞的凋亡率较空白对照组未见明显变化[（4.66±1.12）%vs（3.47±0.79）%，P=0.31，图3D]，miR-16-5p 抑制剂组的SKBR-3/PR细胞的穿膜数较空白对照组显著增多（125.25±6.34vs250.75±20.84，P＜0.01，图4B）。此外，通过Western blot实验，发现与空白对照组相比，miR-16-5p类似物不仅能够上调SKBR-3/PR细胞内Bax的蛋白水平（1.57±0.35vs1.00±0.07，P＜0.05，图4C），还能够下调SKBR-3/PR细胞内Bcl-2的蛋白水平（0.59±0.16vs1.00±0.12，P＜0.01，图4C），而miR-16-5p抑制剂能够逆转miR-16-5p类似物对凋亡蛋白的作用效果，与空白对照组相比，miR-16-5p抑制剂能够下调Bax蛋白水平，上调Bcl-2蛋白水平（0.73±0.05vs1.00±0.06，1.42±0.12vs1.00±0.05，P＜0.01，P＜0.01，图4D）。
图3 miR-16-5p对乳腺癌耐药细胞周期和凋亡的影响Fig.3 Effect of miR-16-5p mimics and inhibitor on cell cycle and apoptosis of SKBR-3/PR cells.A:Effect of miR-16-5p overexpression on proliferation of SKBR-3/PR cells assessed by CCK-8 assay.B: Effect of miR-16-5p overexpression on cell cycle of SKBR-3/PR cells analyzed by flow cytometry.C,D:Effect of miR-16-5p on proliferation of SKBR-3/PR cells analyzed by flow cytometry.**P＜0.01 vs control,◆P＞0.05 vs control.
图4 miR-16-5p对乳腺癌耐药细胞迁移与凋亡蛋白的影响Fig.4 Effects of miR-16-5p mimics and inhibitor on migration and apoptotic proteins in SKBR-3/PR cells.A,B: Effect of miR-16-5p mimics and inhibitor on migration of SKBR-3/PR cells (Original magnification: ×100).C,D: Effect of miR-16-5p mimics and inhibitor on expressions of Bcl-2 and Bax in SKBR-3/PR cells detected by Western blotting.*P＜0.05 vs control,**P＜0.01 vs control.
2.4 miR-16-5p能够靶向调控YWHAQ的表达
为确定miR-16-5p靶向调节的基因，我们首先对4个miRNA数据库（targetscan、starbase、mirdip和mirtarbase）取交集进行分析，发现有106 个基因与miR-16-5p存在结合位点（图5A、B）；
其次，通过STRING数据库进行蛋白质互作分析后，筛选出4 个潜在靶基因（YWHAQ、RTN4、VEGFA和MFN2）与Bcl-2及Bax存在相互作用关系（图5C）；
通过生信预测发现，靶基因YWHAQ与miR-16-5p之间存在结合位点（图5D），而且YWHAQ在乳腺肿瘤中的表达水平较正常组织偏高（P＜0.01，图5E），乳腺癌患者中YWHAQ高表达者的预后较差（P＜0.01，图5F、G）。最后，通过双荧光素酶活性实验，发现YWHAQ-WT（野生型质粒）与miR-16-5p类似物共同转染组的荧光素酶信号比YWHAQ-WT 和miRNA阴性对照（NC）共同转染组的显著降低（0.59±0.01vs1.00±0.04，P＜0.01，图6A），而YWHAQ-MUT（突变型质粒）与miR-16-5p类似物共同转染组的荧光素酶信号与YWHAQ-MUT和miRNA阴性对照（NC）共同转染组相比无明显变化，差异无统计学意义（0.96±0.03vs1.00±0.02，P=0.13，图6A)；
qRT-PCR实验结果显示，SKBR-3/PR细胞中YWHAQ表达水平高于SKBR-3（P＜0.05，图6B）。此外，相比于空白对照组，转染miR-16-5p类似物能够下调耐药细胞中YWHAQ的蛋白水平（0.11±0.04vs1.00±0.11，P＜0.01，图6C），而miR-16-5p 抑制剂能够上调YWHAQ 的蛋白水平（1.93±0.85vs1.00±0.27，P＜0.01，图6D）。
图5 生物信息学分析预测miR-16-5p的靶基因Fig.5 Bioinformatics analysis for predicting the target gene of miR-16-5p.A:Target gene prediction map of miR-16-5p.B: Network diagram of miR-16-5p and target gene.C:Analysis of protein-protein interaction (PPI) between the target gene and Bcl-2 and Bax.D: Potential binding sites of miR-16-5p and YWHAQ in targetscan database.E: Differential expression of YWHAQ in tumor tissue and normal tissue in TCGA database and GTEx database.F,G: Kaplan-Meier survival curves of breast cancer patients with high and low expressions of YWHAQ.***P＜0.001.
图6 miR-16-5p直接靶向调节YWHAQ表达Fig.6 miR-16-5p directly targets YWHAQ.A:Double luciferase reporter gene assay for verification of YWHAQ as the target gene of miR-16-5p.B: Expression of YWHAQ in SKBR-3 and SKBR-3/PR cells detected by qRT-PCR.C,D: Effect of miR-16-5p mimics and inhibitor on expression of YWHAQ protein in SKBR-3/PR cells detected by Western blotting.**P＜0.01 vs control,#P＜0.05 vs SKBR-3.
2.5 miR-16-5p通过靶向调节YWHAQ调控乳腺癌耐药细胞的凋亡和转移能力
为深入研究YWHAQ对乳腺癌耐药细胞的作用机制，本研究构建了YWHAQ的小干扰片段，通过qRTPCR技术检测，构建得到的3 条小干扰片段均能够降低SKBR3/PR 细胞中YWHAQ 的表达水平（P＜0.01，图7A）。我们选取敲低效果最好的YWHAQ homo1进行后续实验。Western blot 结果显示，相对于空白对照组，YWHAQ干扰组Bax蛋白表达量增加（P＜0.01，图7B、C），YWHAQ和Bcl-2的蛋白表达量减少（P＜0.01，图7B、C）；
将YWHAQ干扰片段与miR-16-5p类似物联合转染时，相对于类似物组，联合组对各个蛋白的作用效果都更显著（图7B、C）。细胞凋亡实验与Transwell实验表明，YWHAQ干扰组耐药细胞凋亡率增加、迁移能力减弱（图8），在与miR-16-5p类似物联合作用时，联合组耐药细胞的凋亡率与迁移抑制率被进一步上升（P＜0.01，图8）。
图7 敲低YWHAQ 对乳腺癌耐药细胞蛋白的影响Fig.7 Effect of YWHAQ knockdown on protein expression in drug-resistant breast cancer cells.A:Effect of YWHAQ knockdown on expressions of YWHAQ in SKBR-3/PR cells detected by qRTPCR.B,C: Effect of YWHAQ knockdown on expressions of YWHAQ,Bcl-2 and Bax in SKBR-3/PR cells detected by Western blotting.**P＜0.01 vs control,#P＜0.05 vs miR-16-5p mimics,##P＜0.01 vs miR-16-5p mimics.
图8 YWHAQ对乳腺癌耐药细胞生物活性的影响Fig.8 Effect of miR-16-5p overexpression and YWHAQ knockdown on biological activity of drug-resistant breast cancer cells.A,C:Effect of miR-16-5p overexpression and YWHAQ knockdown on apoptosis of SKBR-3/PR cells analyzed by flow cytometry.B,D: Effect of miR-16-5p overexpression and YWHAQ knockdown on migration of SKBR3/PR cells(×100).*P＜0.05 vs control,＊＊P＜0.01 vs control,##P＜0.01 vs miR-16-5p mimics.
乳腺癌是严重威胁女性生命健康的全球性问题，微小RNA（miRNA）因其高度的特异性、可重复性和准确性，被广泛认为是恶性实体瘤的生物标志物和预后指标。本研究通过对乳腺癌病理样本进行检测发现，miR-16-5p在肿瘤组织中表达水平偏低，表明miR-16-5p在乳腺癌的恶性转变中可能扮演着抑癌的角色。结合当前研究发现，miR-16-5p在多种肿瘤中表达量发生异常变化，而且与多种重要的细胞生物学过程调控有关，比如细胞增殖、转移和血管生成［14］。miR-16-5p在膀胱癌细胞中能够通过调控癌细胞自噬诱导细胞发生凋亡［15］。还发现miR-16-5p与HIF-α和VEGFA的表达呈负相关，提示miR-16-5p 对血管生成有抑制作用［16］。此外，miR-16-5p的差异表达影响临床恶性肿瘤的放化疗敏感性，研究报道miR-16-5p可通过调节糖酵解和介导代谢重编程来增强宫颈癌细胞对化疗药物的敏感性［17］，还能通过调节CyclinD1/E1-pRb-E2F1 通路提升前列腺癌细胞对放疗的敏感性［18］；
当在肝癌细胞中抑制了miR-16-5p 的表达水平后，肝癌细胞对索拉非尼（SOR）的耐药性显著增加［5］。在乳腺癌细胞中，当下调miR-16-5p表达后，癌细胞基因合成速率加快，其增殖能力变强，与此同时，上调的miR-16-5p则能够降低裸鼠模型中乳腺癌肺转移率［19］。但目前尚无研究报道miR-16-5p对乳腺癌耐药的影响与作用机制。
细胞凋亡是肿瘤治疗研究中的热点，肿瘤的恶化、转移和耐药都与癌细胞凋亡过少有关［20］。促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之间的平衡决定是否启动细胞凋亡，癌细胞中过表达的抗凋亡蛋白Bcl-2 蛋白使平衡失衡，利于癌细胞存活并对抗放化疗药物的治疗效果［21］。而Bax蛋白是常见的促凋亡蛋白，能够拮抗Bcl-2蛋白的效果。研究发现，对乳腺癌细胞使用抗肿瘤药物处理后，细胞Bax表达水平和Bax/Bcl-2比值都显著升高［22,23］。通过本课题组的前期研究，我们发现，相对于乳腺癌亲本细胞，乳腺癌耐药细胞中Bax蛋白表达量降低，Bcl-2蛋白表达量升高，Bax/Bcl-2比值降低［13］。所以细胞凋亡与乳腺癌耐药形成过程关系密切。
而在本实验研究中，我们证实了miR-16-5p在耐药细胞中表达量降低，说明其可能参与乳腺癌耐药诱导调控。为了能够进一步了解miR-16-5p对乳腺癌耐药细胞的影响，我们通过转染miR-16-5p 的类似物，上调SKBR-3/PR细胞中miR-16-5p的表达水平。结果发现，miR-16-5p能够将SKBR-3/PR细胞周期阻滞在G0/G1期，抑制细胞生长。CCK-8实验与Transwell实验还显示miR-16-5p能够有效的抑制耐药细胞的增殖和迁移能力。不仅如此，miR-16-5p类似物能够上调乳腺癌耐药细胞凋亡蛋白Bax/Bcl-2的比值。通过流式细胞技术，我们发现在耐药细胞过表达miR-16-5p后，细胞凋亡率显著升高。所以，miR-16-5p能够通过上调Bax/Bcl-2比值促进乳腺癌耐药细胞凋亡。
为了能够深入阐明miR-16-5p在乳腺癌耐药细胞中的作用机制，本研究通过对4个miRNA数据库中的数据取交集，从中挑选出了106个潜在的miR-16-5p靶基因，并通过与受miR-16-5p调控的Bax与Bcl-2蛋白共同构建蛋白互作网络图，我们发现YWHAQ可能是miR-16-5p的潜在靶基因。结合生物信息数据分析，发现YWHAQ在乳腺癌中高表达。结合双荧光素酶实验的结果，miR-16-5p类似物与YWHAQ野生型质粒共同转染细胞时，荧光活性比值降低，而与YWHAQ突变型质粒共同转染细胞时，荧光活性比值无明显变化，证实在乳腺癌耐药细胞中YWHAQ受到miR-16-5p的直接调控。miR-16-5p/YWHAQ调节轴在乳腺癌耐药中有很大可能起着关键性作用。
YWHAQ属于14-3-3家族，14-3-3蛋白几乎能够在所有真核细胞中被检测到，由7 个不同的基因编码（YWHAB，YWHAE，YWHAG，YWHAH，YWHAQ，YWHAZ 和SFN），参与生命中几乎所有的生理过程，如调节细胞周期、凋亡和细胞信号传递［24］。YWHAQ主要通过磷酸化依赖性相互作用与靶蛋白结合，在多种细胞生物学过程中发挥关键作用。过表达YWHAQ能够抑制由RFX5敲低诱导的肝癌细胞的凋亡［25］，还能够抑制由他莫昔芬诱导的MCF-7细胞生长停滞现象［26］。本研究通过对Kaplan Meier-plotter数据库的数据进行分析发现，高表达的YWHAQ与乳腺癌患者的不良预后有着很大的相关性。此外，Hodgkinson 等［27］还提出YWHAQ具有作为乳腺癌新辅助化疗耐药预测生物标志物的巨大潜能。通过本实验研究，我们发现在乳腺癌耐药细胞SKBR-3/PR中YWHAQ表达水平变高。为能够更好的研究YWHAQ对乳腺癌耐药细胞的影响，我们构建了YWHAQ的干扰片段，从而达到降低SKBR-3/PR细胞内YWHAQ表达水平的效果。实验结果证明，在下调YWHAQ的水平后，耐药细胞内的Bax/Bcl-2比值随之升高，细胞的迁移能力减弱，凋亡率随之增加，说明YWHAQ在乳腺癌耐药细胞内拥有着十分关键的作用。在SKBR-3/PR细胞内过表达miR-16-5p的同时，继续干扰YWHAQ的表达，结果发现耐药细胞的迁移抑制率以及细胞凋亡率再一次升高，Bax/Bcl-2比值也随之变得更大，结果进一步提示miR-16-5p是通过调节YWHAQ表达来改变Bcl-2和Bax蛋白水平，从而调控乳腺癌耐药细胞的生物学活性。
综上所述，本研究证实在乳腺癌耐药诱导发展中，耐药细胞中miR-16-5p 下调而YWHAQ 蛋白上调；
miR-16-5p/YWHAQ调节轴能够通过改变Bcl-2和Bax的表达以抑制乳腺癌耐药细胞的增殖和迁移能力。因此，miR-16-5p/YWHAQ调节轴极有可能成为治疗乳腺癌耐药的突破点及耐药评估的生物标志物。
