贵州八角叶枯病病原菌鉴定及生物学特性研究
时间：2023-01-19 22:20:07 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
张晓勇, 邹东霞, 张 凤, 黄乃秀, 廖旺姣, 严 凯*
(1. 广西特色经济林培育与利用重点实验室, 南宁 530022; 2. 六盘水师范学院生物科学与技术学院, 六盘水 553004)
八角IlliciumverumHook.f是重要的调料和药用植物,经济价值高。在八角栽培中,炭疽病(anthracnose)[1-2]、白粉病(powdery mildew)、煤污病(sooty blotch)和藻斑病(algal leaf spot)[3]等常给八角产量和质量造成严重的影响。2020年8月,我们在对贵州省六盘水市盘州市八角林间调查发现,八角植株普遍发生叶枯病,发病初期在叶尖端、叶缘形成圆形、椭圆形或不规则形的灰褐色病斑,病健交界明显,后期随着病斑扩展，整个叶片干枯死亡,整体呈灰白色,枯死部分正面有密集的小黑点,故将该病命名为叶枯病(图1a～b)。目前,引起该病害的病原菌尚不明确。
为明确引起贵州八角叶枯病病原菌种类,本文采用形态学结合多基因分子生物学的方法对病原菌进行鉴定,并对病原菌生物学特性进行研究,旨在为八角叶枯病的田间识别及防治提供理论及实践参考。
1.1 病害标本采集与病原菌分离纯化
供试的八角叶枯病典型病害材料于2020年8月采自贵州省六盘水市盘州市大山镇嘎拉河村(104°41′E, 25°33′N,海拔2 118 m)。采集新鲜感病样品带回实验室后采用单孢分离法对患病叶片病原菌进行分离和纯化。菌株在PDA斜面上培养7～10 d后置于4℃保藏备用。
1.2 病原菌的鉴定
1.2.1形态学鉴定
1)菌株生长速率测定。将4℃保藏的菌株接种到PDA平板上,于25℃的黑暗条件下培养5 d后用直径6.0 mm灭菌打孔器打取菌落边缘菌块接入另一PDA平板中央,在25℃的黑暗条件下培养5 d后采用十字交叉法测量菌落直径,观察菌落特征。设置5次重复。
2)产孢诱导。将干松针剪成2～3 cm的小段,在121℃下灭菌15 min,3 d 后再进行第2次灭菌制得双重灭菌松针。取5～6根灭菌松针均匀撒在合成低营养琼脂培养基(synthetic nutrient poor agar,SNA)(KH2PO40.2 g,KCl 0.2 g,KNO31.0 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,葡萄糖0.2 g，蔗糖0.2 g,琼脂20 g,水1 000 mL,自然pH)平板表面作为产孢诱导培养基[4]。待菌株活化后用直径6.0 mm灭菌打孔器打取菌落边缘菌块以3点法接入上述培养基平板上,在25℃的自然光照条件下进行培养。待松针上有滴状、黑褐色子实体形成后,挑取子实体以无菌水制作临时装片,用Olympus BX51显微摄像系统拍摄产孢细胞和分生孢子的显微结构,并用SPOTCam 32绘制标尺和测量显微尺寸。
1.2.2分子生物学鉴定
1)病原菌DNA提取。将供试菌株分别接种于PDA平板培养基上,置于25℃、黑暗条件下培养7 d后刮取菌丝,用改良的CTAB法提取DNA[5]。
2)目的基因的扩增与序列测定。扩增的目的基因序列分别为内转录间隔区(ITS)、β-微管蛋白基因(TUB)和翻译延伸因子1-α基因(tef1)。ITS基因选用真菌rDNA-ITS 通用引物ITS4和ITS5[6];TUB基因选用引物BT2A和BT2B[7];tef1基因选用引物EF1-526F和EF1-1567R[8],反应体系及扩增程序参考Maharachchikumbura等的方法[9]。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后,由北京擎科生物科技有限公司进行纯化和双向测序。将所得序列输入GenBank的BLAST中进行同源序列检索,查找相似性较高的菌株(表1)。3个基因序列用Sequence Matrix 1.7.8进行拼接,用MEGA 11 软件以极大似然法(maximum likelihood method, ML)构建系统发育树,确定菌株的分类地位。
表1 参与多基因系统发育分析的菌株及序列登录号信息1)
1.3 致病性测定
选取健康无损伤的离体成熟八角叶片,先用75%乙醇擦拭叶片表面,无菌水清洗5次,再用灭菌吸水纸擦干表面水珠。叶柄切口处用无菌湿棉球包住后平置于培养皿内进行保湿培养。用灭菌大头针在直径5 mm的叶片区域内刺伤5点形成微创伤口。吸取50 μL的106个/mL病原菌孢子悬浮液滴于微创伤口上,另一组在微伤口处接种等体积无菌水,以在未进行损伤处理叶片的相同部位接种50 μL病原菌孢子悬浮液为对照。接种后盖好皿盖放置于20℃、光照条件下培养7 d观察发病情况,试验设置5次重复。
1.4 病原菌适宜生长温度及pH测定
在活化菌株菌落边缘打取6 mm菌饼接种于PDA平板,分别置于0、5、10、15、20、25、30℃和35℃等8个温度环境中,黑暗条件下培养5 d后测量各温度下的菌落直径(mm)。用1.00 mol/L的NaOH或HCl调节PDA培养基的 pH,配制成初始pH分别为4、5、6、7、8、9、10、11和12等9个梯度的培养基,灭菌后倒平板,从菌落边缘打取6 mm菌饼接种于不同pH值的PDA平板中央, 25℃黑暗条件下培养5 d后测量各个处理菌落直径(mm)。用移液枪吸取100 μL 106个/mL孢子悬浮液加入PDA平板,均匀涂布后分别置于上述几个温度和pH环境中。24 h后将平板置于光学显微镜的10×10低倍镜下随机选取10个视野统计分生孢子萌发情况。每处理设置5次重复。孢子萌发率=视野中孢子萌发数/孢子总数×100%。
1.5 病原菌菌丝和孢子致死温度测定
用灭菌打孔器在菌株菌落边缘打取4 mm的菌饼装入1.5 mL无菌离心管中,加入1.0 mL无菌水后盖上离心管,分别放入35、40、45、50、55、60、65℃和70℃水浴中,精确计时10 min后取出菌饼,用无菌滤纸吸干水珠后以单点法接于PDA平板中央,25℃、黑暗条件下培养5 d后测量菌落直径。取1.0 mL 的106个/mL孢子悬浮液加入1.5 mL无菌离心管中,盖好盖子后分别投入上述7个温度的水浴中精确计时处理10 min,取各温度处理的100 μL孢子悬浮液均匀涂布于水琼脂(WA)平板上,25℃、黑暗条件下培养24 h后将平板置于光学显微镜的10×10低倍镜下随机选取10个视野统计分生孢子萌发情况。每个温度设置5次重复。
2.1 八角叶枯病症状观察
在八角叶片上,病害初期在叶片尖端、叶缘或叶上形成圆形、椭圆形或不规则形的灰褐色病斑,病健交界明显,后期随着病斑扩展导致整个叶片干枯死亡,整体呈灰褐色。叶片干枯坏死部分向上卷曲,几乎不形成穿孔(图1a～b)。发病后期在病斑处可见密集的小黑点状分生孢子盘,单生或连成片(图1c)。
图1 八角叶枯病症状及菌株致病性测试Fig.1 Symptoms of Illicium verum leaf blight and pathogenicity test
2.2 病原菌分离与致病性鉴定
通过单孢分离法从典型病斑部位共分离获得3个纯化菌株(编号为IP202082702、IP202082705和IP202082706)。将菌株IP202082702孢子悬浮液接种于健康八角叶片上,20℃下培养7 d 后,与刺伤不接种处理相比,接种处形成6～7 mm的灰褐色坏死病斑,与田间早期症状一致(图1d～e)。继续培养待病斑上产生子实体后,再次挑取分生孢子进行单孢分离,所得菌株形态特征与原菌株一致。无伤接种处理则未出现病斑(图1f),说明该病原菌主要靠伤口或叶片边缘结构侵入叶片而致病。
2.3 病原菌的鉴定
2.3.1病原菌形态学鉴定
菌株在PDA上于25℃、黑暗条件下培养5 d后,菌落平均直径为(61.67±0.58)mm(n=3)。菌落表面平整,白色至淡黄色,绒毛状,有明显的轮状花纹,质地相对紧密,背面中央呈浅橙色,至边缘逐渐减淡为白色(图2a～b);培养12 d以后,菌株在SNA培养基中的松针上形成黑色子实体,球形,泪滴状,200～500 μm(图2c)。
分生孢子梗透明,表面光滑,亚圆柱状,长为17.22～37.09 μm,产孢细胞安瓿瓶状、透明,长12～23.2 μm(图2d～e)。分生孢子纺锤状,直或略微弯曲,4个隔5个细胞,分生孢子长19.21～29.65 μm,平均(22.95±2.56)μm (n=30),宽6.47～9.77 μm,平均(8.73±0.51)μm (n=30)。基部细胞倒圆锥形,长3.27～6.61 μm,无色、透明;中间3个细胞瓮形,表面具有密集的小疣点,同色,浅棕色到棕褐色,长12.79～17.18 μm,平均(14.87±2.21)μm (n=30),隔比孢子外侧壁厚,黑褐色。顶部细胞无色、透明、倒圆锥形,长2.16～4.08 μm;顶端附属丝1～4根,多为3根,从孢子顶端不共点分出,长14.56～31.97 μm,平均(21.13±3.48)μm (n=30),透明丝状,不分支;中生式基部附属丝1根,长4.26～7.33 μm,平均(5.53±1.26)μm (n=30)(图2f～k)。通过与该属已知种进行比较,初步将3株菌株鉴定为庐山拟盘多毛孢PestalotiopsislushanensisF.Liu & L. Cai[8]。
图2 八角叶枯病病原菌形态特征Fig.2 Morphological characteristics of Pestalotiopsis lushanensis
2.3.2病原菌分子生物学鉴定
将3个病原菌菌株的ITS、TUB和tef1序列与GenBank中下载的20个菌株相关基因序列进行同源性比对,以SequenceMatrix1.7.8进行拼接,用MEGA 11以SeiridiumcamelliaeSD096为外群构建的ML系统发育树如图3所示。本研究分离的3株菌株IP202082702、IP202082705和IP202082706与庐山拟盘多毛孢P.lushanensis以99%的高支持率聚为一支,支持形态学鉴定结果,故基于形态学和分子生物学特征将3个菌株鉴定为庐山拟盘多毛孢P.lushanensisF. Liu & L. Cai。
图3 基于ITS、TUB和tef1构建的庐山拟盘多毛孢及其相关菌株的ML系统发育树Fig.3 ML phylogenetic tree based on combined sequences of ITS, TUB, and tef1 genes of Pestalotiopsis lushanensis and relative strains
2.4 不同培养温度和 pH 对病原菌生长及孢子萌发的影响
不同培养温度和 pH 对病原菌菌丝生长及孢子萌发影响如图 4所示。在10～35℃范围内该菌菌丝均可生长,孢子可萌发,适合菌丝生长和孢子萌发的温度范围为20～30℃,最适为25℃,当温度超过 35℃后菌丝基本停止生长(图4)。该菌对培养基 pH的要求不严格,在 pH 4～12 范围内孢子可部分萌发,菌丝可生长,但在pH 6～7时菌落直径最大;分生孢子在 pH 6～10萌发率均较高(图4)。说明该菌菌丝生长和孢子萌发最佳温度为25℃,最适pH为6～7。
图4 不同温度和 pH 对庐山拟盘多毛孢菌丝生长及孢子萌发的影响Fig.4 Effects of different temperatures and pH values on mycelial growth and conidia germination of Pestalotiopsis lushanensis
2.5 病原菌致死温度
病原菌菌丝和孢子在不同温度下处理10 min后其菌落直径和孢子萌发率如图5所示。随着处理温度的升高,菌落直径和孢子萌发率均随之急剧降低,当处理温度达到50℃时菌丝停止生长,达到55℃时孢子萌发率降为0。说明病原菌的菌丝致死温度为50℃处理10 min,分生孢子致死温度为55℃处理10 min。
图5 庐山拟盘多毛孢菌丝和分生孢子在不同温度下处理10 min的效果Fig.5 Effects of treatment for 10 min under different temperatures on mycelial growth and conidia germination of Pestalotiopsis lushanensis
拟盘多毛孢属中很多真菌是植物病原菌,常危害植物叶片、枝条、果实和根系,引起叶斑、叶枯、枝枯、果实黑斑病、软腐病和根腐病等[10-14],对很多植物的生长造成严重影响。本文基于形态学结合ITS、TUB和tef1多基因序列分析,将八角叶枯病病原菌鉴定为庐山拟盘多毛孢Pestalotiopsislushanensis。庐山拟盘多毛孢是Liu等[8]在2017年报道的新种,其模式标本采自江西庐山国家公园的山茶属植物。到目前为止,已报道庐山拟盘多毛孢引起茶Camelliasinensis的灰枯病[15]和草珊瑚Sarcandraglabra的褐斑病[16],这是庐山拟盘多毛孢在八角上的首次报道。
传统上,拟盘多毛孢属真菌的分类主要基于分生孢子形态特征,如分生孢子3个中间细胞颜色、分生孢子大小及顶端附属丝、基部中生式柄的形态和数量等[17]。但随着对该属研究的深入,报道的种越来越多,以分生孢子颜色和大小来进行分类是非常困难的,多基因序列分析也证明仅靠形态学分类很难鉴定到种,而且形态特征与菌株培养条件有关[4]。多基因分子鉴定是对传统形态学鉴定的有效补充。本文结合ITS、TUB和tef1多基因序列分析(图3)发现,庐山拟盘多毛孢P.lushanensis近缘种有杜鹃拟盘多毛孢P.rhododendri和P.clavata,3个种的分生孢子大小和颜色相近,但是杜鹃拟盘多毛孢顶端附属丝(7.5～14.9 μm)和基部附属丝(2.8～4.9 μm)都明显短于庐山拟盘多毛孢(12.79～17.18 μm和4.26～7.33 μm)[18],P.clavata基部附属丝(7～9 μm)明显长于庐山拟盘多毛孢[9]。前人在八角上报道的拟盘多毛孢属真菌有八角拟盘多毛孢P.ilicis和金毛狗拟盘多毛孢P.cibotii,两个种的分生孢子大小、颜色及基部附属丝、顶端附属丝长度与庐山拟盘多毛孢也有显著差异[17,19]。
本研究还对八角叶枯病新病原菌庐山拟盘多毛孢生物学特性进行了研究。结果表明,该菌在10～35℃和pH 4～12范围内其菌丝均可生长,孢子均可萌发,说明该菌株对环境的适应性较强,但10℃以下的低温和35℃以上的高温对该菌菌丝生长和孢子萌发影响较大,说明温度是影响该菌侵入、扩展和发病的关键因素之一。致死温度测试表明,50℃处理10 min后菌丝停止生长,55℃处理 10 min 后孢子无法萌发,说明孢子对高温的耐受性高于菌丝,与李阳的研究结果一致[20]。本文对八角叶枯病新病原菌的生物学特性进行研究,为该病害的田间流行监测、发生规律和防治方法提供理论和实践参考。
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