新生儿呼吸窘迫综合征并发支气管肺发育不良风险基因巢式病例对照研究
时间：2023-01-18 09:25:11 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
陈辉耀 董欣然 杨 琳 卢宇蓝 胡黎园 蒋思远 钱莉玲 周文浩
支气管肺发育不良(BPD)是新生儿呼吸窘迫综合征(RDS)最常见的并发症之一[1]，严重RDS患儿需机械通气支持，但高浓度吸氧和高吸气峰压却大幅增加了患BPD的风险[2]。国外研究表明，胎龄<34周的RDS新生儿中BPD发生率为12.5%～14%[3]。一旦发生BPD的，会导致持续肺功能障碍(慢性哮喘、反复呼吸道感染)和神经发育迟缓。
影响RDS患儿并发BPD的因素较多，如胎龄、出生体重、动脉导管未闭、机械通气模式等[4-6]。除临床因素外，多项研究通过全外显子组测序和罕见变异分析确定了大量BPD的风险基因[7-9]，表明遗传因素会增加早产儿患BPD的风险。本研究假设RDS并发BPD人群具有较高的BPD遗传易感基因罕见变异负荷，从而作为筛选RDS并发BPD的遗传风险基因，为准确预测患儿预后和精准医疗提供参考。
1.1 研究设计 巢式病例对照研究。以RDS为队列人群，以生后28 d为队列终点，诊断为BPD患儿为BPD组，在非BPD患儿中采用倾向性评分策略产生非BPD的组，通过罕见变异关联分析和基因差异表达分析，探索具有高变异负荷基因表达特征的暴露因素。
1.2 伦理和知情同意 本研究方案获得复旦大学附属儿科医院(我院)伦理委员会批准(伦理审批号：2016-235)。在基因检测前所有患儿父母均签署书面知情同意。
1.3 BPD组纳入和排除标准 同时符合以下条件：①2016年1月1日至2021年8月1日我院信息管理系统中符合RDS诊断标准[10]的病历，②胎龄≤34周，③生后24 h内入院且住院时间≥28 d，④临床怀疑有遗传性疾病并行临床外显子检测，⑤排除严重遗传疾病(如先天性畸形、染色体异常)的患儿，⑥出院诊断中合并BPD[11]。
1.4 非BPD组纳入标准 同BPD组纳入和排除标准①～⑤，并排除出院诊断中合并BPD的患儿。复习文献[4, 6, 11]显示，BPD高危因素研究中胎龄是最重要和确切的因素，本研究使用R软件包MatchIt对BPD组和非BPD组的胎龄进行倾向性评分匹配，采用临近匹配方法，匹配比例为1∶2，在匹配中使用的卡尺宽度为0.5。
1.5 临床信息采集 复习文献[4, 6, 11]，从病历中采集BPD影响因素，①出生史：剖宫产分娩、产前使用糖皮质激素、1和5 min Apgar评分、出生体重、胎龄、性别、小于胎龄儿；
②住院期间发病情况：低蛋白血症、肺动脉高压(新生儿持续性肺动脉高压/继发性肺动脉高压)、气胸、动脉导管未闭、新生儿肺炎、早发性败血症，侵入性通气(有创机械通气、高频通气)。
1.6 遗传风险基因检测、采集和分析
1.6.1 临床外显子测序 采集患儿外周静脉血行外显子检测，使用的遗传性疾病试剂盒(Agilent ClearSeq Inherited Disease Kit)可捕获2 742个已知的致病基因的罕见有害变异(包括潜在的有害变异)。罕见变异筛选具体步骤参考文献[12]。
1.6.2 生物学过程基因集采集 下载MSigDB(www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/)数据库中定义的基因集，选择7.4版中的生物学过程(BP)组别中的7 481个基因集进行后续的功能富集分析。
1.6.3 基因功能富集分析 使用Fisher精确检验进行风险基因功能富集分析，背景基因选取所有检测的3 203个基因，显著性阈值是P< 0.01。
1.6.4 基因集罕见变异关联分析 将不同样本中同一基因集的罕见(最小等位基因频率<1%)有害变异合并到同一基因集区域中，对具有此基因集有害变异的基因个数进行累加计数。将有害变异分为4种类型：蛋白质截断变异(移码突变、终止密码子突变和经典剪接供体/受体突变)、错义/非同义变异、同义变异和非编码变异[13]。将同义变异和非编码变异作为协变量，应用Logistic多因素回归分析BPD组中携带蛋白质截断变异和错义/非同义变异的基因数是否明显高于非BPD组。以因变量y表示是否患BPD，以样本在相应基因集中携带罕见变异基因的个数为自变量，相应的logistic回归模型为：
Logit(P) = ln(P/(1-P))=β0+β1X1+β2X2+β3X3
式中P=(y=1|x1,x2,x3)；
y=1表示患BPD，y=0表示未患BPD；
X1表示携带蛋白质截断变异(或错义和非同义变异)基因的个数；
X2表示携带同义变异基因的个数；
X3表示携带非编码变异基因的个数。
针对测序的2 742个基因富集的生物学过程相关基因集(P<0.01)进行关联分析。
1.6.5 基因罕见变异关联分析 将不同样本中同一基因的罕见有害变异合并到同一基因区域中，对具有此基因有害变异的样本进行累加计数。在基因水平上应用单侧Fisher检验分析BPD组中携带蛋白质截断变异和错义/非同义变异的总人数是否明显高于非BPD组。
1.6.6 RDS并发BPD候选风险基因差异表达验证方法 研究[14]表明，基因外显子在不同人群的相同组织中表达水平不同，这些表达差异可能意味着不同的罕见变异可以造成不同的表型结果。因此，本研究从GEO(Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)数据库检索RDS并发BPD高度相关基因表达数据，验证本文高变异负荷基因的表达特征。行机械通气的RDS患儿肺巨噬细胞的基因表达数据GSE149490[15]包含了62例(重度BPD 34例、中度BPD 5例、轻度BPD 9例、无BPD 9例)。行机械通气的RDS患儿113份气道内吸引物样本,胎龄23～28周54例，～30周8例，每例患儿在生后24 h内获取第1份气道内吸引物，对持续机械通气患儿从生后第7 d起每周采样1次。基因表达模式的时间序列分析具体步骤参考文献[15]，显著性阈值为P<0.01。
1.7 统计学分析 采用R软件 v 4.0.3(http://cran.r-project.org)进行统计分析。符合正态分布且方差齐性的计量资料采用两独立样本t检验；
不符合正态分布或方差不齐的计量资料采用非参数检验的Kruskal-WallisH检验。分类变量采用双侧Fisher确切概率法进行统计学检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 一般情况 符合本文纳入和排除标准的RDS患儿581例，包括中期早产儿97例、极早产儿362例、超早产儿122例。表1显示，匹配前BPD组224例，非BPD组357例，匹配前2组患儿除产前使用糖皮质激素治疗比例、性别构成比、气胸发生率外，其余因素差异均有统计学意义。匹配后BPD组111例，非BPD组157例，2组患儿除肺动脉高压、动脉导管未闭、新生儿肺炎，侵入性通气中有创机械通气、高频通气比例差异有统计学意义外，余因素差异均无统计学意义。
表1 BPD组和非BPD组患儿的临床特征比较[n (%)]
2.2 RDS并发BPD样本中罕见变异显著富集的相关生物学过程 基于2 742个背景基因显著富集的1 558个生物学过程(P<0.01)，对其相关基因集进行罕见变异关联分析。图1A显示，蛋白质截断变异最显著富集的基因集与蛋白激酶活性有关(P=0.011)；
BPD组中携带蛋白质截断变异的基因总数最多的是阳离子跨膜转运相关基因(P=0.027，n=22)。图1B显示，错义/非同义变异最显著富集的基因集与生长发育的调节有关(P=0.001)。
2.3 RDS并发BPD候选风险基因 表2显示，对2 742个测序基因进行罕见变异关联分析，在BPD组中26个基因的错义/非同义罕见变异负荷显著高于非BPD组(P<0.05)，为BPD候选风险基因。其中3个基因(ARSB、B9D2和UVSSA)差异有统计学意义(P<0.01)
表2 26个BPD候选风险基因 (n)
2.4 RDS并发BPD候选风险基因差异表达验证 肺巨噬细胞的基因差异表达分析发现，与无/轻度BPD的RDS患儿相比，ARSB在机械通气7～21 d的重度BPD患儿中表达水平均显著降低(P<0.001，图2A)。时间序列方法分析发现，ARSB在无/轻度BPD的RDS患儿肺巨噬细胞中表达与通气时间存在依赖性变化(图2B)，且其表达在RDS发生1周后动态上调(P<0.01)，但在重度BPD患儿中未见明显上调。
本研究筛选并验证了在RDS并发BPD患儿中，ARSB基因为较高的有害变异负荷基因，其在验证数据中有独特的表达模式，可作为RDS并发BPD尤其是重度BPD的遗传风险因素。
国内外研究已从患儿和临床护理角度阐述了多种临床因素对于评估RDS预后的价值，其中比较明确的因素包括胎龄、出生体重、新生儿肺炎和机械通气等[16-18]。在本研究中只匹配了胎龄进行后续的遗传分析，一是因为胎龄[6,11,17]是所有BPD风险因素研究中证实的高危因素，二是因为大部分BPD影响因素都与胎龄相关。匹配胎龄后BPD组 与非BPD组间肺动脉高压、动脉导管未闭、新生儿肺炎、有创机械通气、高频通气差异仍有统计学意义，但其差异的显著性均减小。而且本研究确定的BPD风险基因中没有报道与肺动脉高压[19]和动脉导管未闭[20]有关，说明只匹配胎龄在一定程度上减弱了混杂因素对结果的影响。
基因集的罕见变异关联分析发现，BPD风险基因集主要与蛋白激酶活性、阳离子通道和生长发育的调节相关。最近，Elsaie等[21]通过小鼠实验证明蛋白激酶AMPKα1可以减少高氧诱导的新生小鼠BPD和肺动脉高压的发生率，并促进人类肺微血管内皮细胞的再生从而减弱肺损伤。一项研究[22]表明，阳离子通道Piezo1通过增加一氧化氮和钙流入减少肺血管收缩可以减弱呼吸机诱导的肺损伤，促进Piezo1活性和表达，可能有助于治疗RDS。Rozycki[23]也发现I型肺泡上皮细胞上的离子通道和转运功能可能与肺损伤、修复以及BPD的发展有关。另外，肺部血管生长和发育与BPD的关系研究较为透彻[24]。以上研究均提示蛋白激酶、离子通道和生长发育相关基因的罕见变异对RDS患儿的转归有重要影响。
本研究从基因水平的罕见变异关联分析筛选出26个BPD候选风险基因，与既往3项BPD遗传风险的研究[7, 8, 25]相比，有4个基因(TBP、ACAN、SEC23B和LAMB2)曾被报道。以往罕见变异关联研究多通过声明显著性较高的变异负荷或基因干扰实验来验证变异对基因的作用，但最近有研究使用大规模转录组测序数据集表明基因外显子表达可纳入对罕见变异的解释[14]。本研究通过基因差异表达验证，明确了高负荷罕见变异基因ARSB对RDS患儿预后的重要性，可作为BPD遗传风险基因。
ARSB相关的疾病包括黏多糖贮积症，该病遗传方式通常为常染色体隐性遗传，由位于5号染色体(5q13-5q14)上的ARSB基因突变引起，临床表现为肺功能降低[26]。目前已有研究[27]利用人类支气管上皮细胞和小鼠模型证明ARSB的活性与低氧血症有关。Seo等[28]随访331例慢性阻塞性肺疾病患者的预后，发现ARSB的表达和SNPs与慢性阻塞性肺疾病患者对长期吸氧的反应有关，SNPs是ARSB表达的定量性状位点。一项有关囊性纤维化的研究发现，ARSB与支气管上皮细胞膜上调节配体门控阴离子通道的功能有关[29]，而囊性纤维化与BPD患者往往具有相似的表型，在婴儿期常有反复的呼吸道症状和/或发育不全[30]。这些证据表明，BPD患儿中ARSB较高的变异负荷可能干扰离子通道的稳态，影响了RDS患儿对氧疗的反应。
本研究局限性：①研究对象为有遗传风险的RDS并发BPD人群，结论外推到其他人群应谨慎；
②基线数据中未包括患儿母亲详细的围生期疾病史、患儿吸氧时间和吸氧浓度等BPD的高危因素；
③RDS并发BPD遗传风险基因的验证不是来自于本研究人群的验证，而是来源于GEO数据库数据验证。
利益冲突声明作者和文章内容不存在商业或非商业资助利益冲突。
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