体外产气法评价不同物理状态苜蓿干草营养价值的研究
时间：2023-01-17 13:50:13 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
■唐文浩 张养东* 黄国欣 杨继勇 刘凯珍 郑 楠 王加启
（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京100193；
2.农业农村部奶及奶制品质量安全控制重点实验室，北京100193）
苜蓿作为一种富含丰富的蛋白质、矿物质和微量元素的优质牧草，被广泛应用于畜牧业养殖中[1]。并且随着畜牧业生产集约化水平和养殖水平的不断提高，人们对优质苜蓿的需求日益增加[2]。目前，我国苜蓿来源主要依赖进口，2020年我国全年干草进口量为169.4万吨，其中全年累积进口苜蓿干草135.81万吨，占比80.17%，根据中国海关最新数据，2021年，我国累积进口干草199.24 万吨，其中苜蓿干草178.03 万吨，占比89.35%，苜蓿干草占比进一步加大。发展我国苜蓿产业的任务迫在眉睫，因此准确评价我国苜蓿消化营养价值成为第一限制性因素。
体外产气法是由德国Menke等[3]等建立的一种通过测定饲料样品在体外与瘤胃液混合消化后所产生的气体的多少及其他发酵指标来评估饲料品质的快速方法。该方法选择的发酵底物一般是先烘干处理然后进行粉碎并过40 目筛，但与奶牛真实采食饲料状态差异很大，且有研究表明，饲料长度会影响反刍动物的干物质采食量[4]、咀嚼时间[5]、瘤胃pH[6]等。因此，在体外产气试验上选择过于细碎的发酵底物可能不能与其真实饲喂价值相一致，从而影响体外产气法对饲料样品消化营养价值的评价准确性，故针对现状本文拟采用瘤胃体外产气法评价传统方法处理饲料状态（粉碎至0.425 mm）和动物采食饲料真实状态（切短至20 mm），将0.425 mm 苜蓿干草和20 mm 苜蓿干草作为发酵底物，对其产气量和瘤胃发酵特性进行比较研究，以期初步探寻不同物理状态苜蓿干草对体外产气法评价其消化价值的影响，旨在为我国苜蓿的合理高效应用提供技术支撑和理论依据。
1.1 试验时间和地点
试验于2021 年11 月1 日至2021 年12 月31 日在中国农业科学院昌平试验基地进行。
1.2 试验材料
试验所用的苜蓿干草饲料由赤峰澳亚现代牧场有限公司通希牧场提供。参照张丽英[7]的方法对采集到的苜蓿干草样品的干物质（DM）、粗蛋白（CP）、中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）和粗脂肪（EE）等常规营养成分进行测定。苜蓿干草的营养成分详见表1。
表1 苜蓿干草常规营养成分（%）
1.3 试验动物与试验设计
选择3 头年龄、体重、产奶量和胎次都相近的装有瘤胃瘘管的健康荷斯坦奶牛作为瘤胃液供体，供体牛每天8：00 和20：00 饲喂两次，期间自由饮水。将苜蓿干草样品用四分法分为两份，每份取500 g，将其中一份粉碎并过40 目（0.425 mm）筛网，另一份苜蓿干草用铡刀切短至20 mm，作为发酵底物备用。试验采用单因素设计，每组设计5个重复，共发酵72 h。
1.4 体外发酵试验
1.4.1 发酵底物
用四分法将采集到的苜蓿干草样品分为两份，每份500 g，将其中一份放于65 ℃烘箱烘干24 h，而后粉碎并过40 目（0.425 mm）筛网，另一份用铡刀铡短至20 mm，备用。将两处理组分别准确称取200 mg样品，置于干燥且密封良好的120 mL 透明玻璃发酵注射管（最小刻度为1 mL）底部，活塞涂抹凡士林。
1.4.2 发酵培养液
按照Menke 等[8]的方法配制试验所需人工唾液，并按照比例依次加入1 200 mL 纯化水、0.3 mL 微量元素溶液、600 mL缓冲溶液、600 mL常量元素溶液和3 mL刃天青指示剂溶液，配制同时持续通入CO2保持厌氧，放于水浴锅中预热至39 ℃，约30 min后，向其中再加入120 mL还原剂溶液，用前新鲜配制上述溶液，此时混合溶液应由红色褪至完全无色（无氧状态）即可使用。于晨饲前2 h采集3头供体牛瘤胃液各1 L，4层纱布过滤混合，置于39 ℃预热后的保温壶中迅速带回实验室。按照1∶2的比例将瘤胃液与人工唾液进行混合，配成人工瘤胃培养液，其间持续39 ℃水浴，持续通入CO2保持厌氧。转移30 mL 人工瘤胃培养液于提前预热39 ℃的装有发酵底物的发酵管中，并用夹子夹住前端乳胶管后，置于39 ℃恒温培养摇床中，分别记录发酵2、4、8、16、24、48 h和72 h的产气量，同时将相对应的发酵管迅速取出，置于冰上停止发酵，收集发酵液，进行分装，立即测定发酵液pH，其余-20 ℃保存，备测。
1.5 指标测定
1.5.1 累积产气量（gas production, GP）及产气动力学参数的测定
按照Mauricio 等[9]的方法计算体外发酵累积产气量，参照Ørskov 等[10]的方法计算体外产气动力学参数，计算公式如下。
GP=B×[1-e-c（t-Lag）]
式中：GP——200 mg样品的累积产气量（mL）；
B——200 mg样品的理论最大产气量（mL）；
C——200 mg样品的产气速率（h-1）；
t——产气时间点（h）；
Lag——产气延滞时间（h）。
1.5.2 pH的测定
采用PHS-100 便携式酸度计（天奇MDT 信息技术有限公司，上海，中国）测定发酵液pH。
1.5.3 氨态氮（NH3-N）和微生物蛋白（MCP）的测定
采用苯酚-次氯酸钠比色法测定NH3-N的含量[11]。利用差速离心法测定MCP含量[12]。
1.5.4 挥发性脂肪酸（VFA）的测定
瘤胃液VFA 的测定参照Scortichini 等[13]的方法，采用气相色谱法（Agilent 7890A GC System，美国）测定，气相色谱仪内配置氢火焰离子化检测器（FID），载气为高纯氮气。色谱柱选择DB-FFAP，规格为15 m×320 μm×0.25 μm，进样口温度250 ℃，进样量为1 μL。升温程序：初始温度70 ℃，以3 ℃/min升温至125 ℃，随后以80 ℃/min 升温至180 ℃，保持5 min。检测器参数：氢气流量30 mL/min，空气流量400 mL/min，氢火焰离子化检测器温度为300 ℃。
1.6 数据分析
试验数据采用Excel 2019进行初步统计，并利用SAS 9.4 的ANOVA 程序对苜蓿干草发酵参数进行单因素方差分析，采用Duncan’s法进行多重比较，当P＜0.01 为差异极显著，P＜0.05 为差异显著，试验数据结果采用“平均值±标准误”表示。
2.1 不同物理状态苜蓿干草对体外发酵产气量及产气参数的影响（见表2）
表2 不同物理状态发酵底物对产气量及产气参数的影响
由表2 可知，随着发酵时间的延长，各组产气量都呈现上升趋势，在48 h 以后上升趋势逐渐平缓，达到了产气平台期。0.425 mm 组在2 h 至24 h 的累积产气量都高于20 mm 组，组间差异极显著（P＜0.01），在发酵48 h 至72 h 时，48 h 两组间产气量差异显著（P＜0.05），72 h 两组产气量达到相当水平，产气量没有显著差异（P＞0.05）。在两组理论最大产气量上，没有显著性差异（P＞0.05），但在产气速率上20 mm组极显著低于0.425 mm组17.91%（P＜0.01）。
2.2 不同物理状态苜蓿干草对体外发酵参数的影响（见表3）
表3 不同物理状态发酵底物对pH、NH3-N、MCP的影响
由表3可知，各组pH呈现不断波动变化趋势，但基本稳定，各个发酵时间发酵液pH 均处于正常变化范围。发酵8 h前两组pH变化差异显著（P＜0.05），但在8 h后两组pH变化差异不显著（P＞0.05）。0.425 mm组和20 mm 组发酵液NH3-N 含量都呈现上升趋势。20 mm组发酵24、48 h和72 h的NH3-N含量极显著高于0.425 mm 组（P＜0.01）。MCP 指标两组间在发酵过程中没有显著性差异（P＞0.05），都呈现上升趋势，72 h达到最大。
2.3 不同物理状态苜蓿干草对体外发酵VFA浓度的影响（见表4）
由表4 数据可知，发酵24 h 以前，0.425 mm 组和20 mm 组乙酸浓度两组间出现极显著性差异，20 mm组极显著高于0.425 mm 组（P＜0.01）。两组48 h 和72 h 发酵液中乙酸浓度差异不显著（P＞0.05）。两组间丙酸浓度呈上升趋势，发酵24 h前各时间点丙酸浓度在组间出现极显著性差异（P＜0.01）。两组丙酸含量都在发酵72 h 时达到最高，但两组48 h 和72 h 发酵液丙酸浓度组间差异不显著（P＞0.05）。丁酸含量随着发酵时间的延长，两组各时间点发酵液中丁酸含量呈现不断上升的趋势，20 mm组16 h前发酵液丁酸含量极显著高于0.425 mm 组（P＜0.01）。在24 h 和72 h 发酵液中20 mm 组发酵液中丁酸浓度也是高于0.425 mm 组，但两组间差异不显著（P＞0.05）。发酵2、4、8 h 和16 h 时，20 mm 组发酵液中戊酸浓度极显著高于0.425 mm组（P＜0.01）。发酵24 h时，20 mm组显著高于0.425 mm 组（P＜0.05）。发酵48 h 和72 h时，两组戊酸浓度没有显著性差异（P＞0.05）。总挥发性脂肪酸浓度两组间都呈现随发酵时间的增加而逐渐上升的趋势，在发酵前24 h，20 mm 组总挥发性脂肪酸浓度极显著高于0.425 mm 组（P＜0.01），在发酵48 h 和72 h 时发酵液中总挥发性脂肪酸浓度两组间没有显著的差异（P＞0.05）。
表4 不同物理状态发酵底物对体外发酵VFA浓度的影响(mmol/L)
体外发酵产气量和产气速率是反映降解率和瘤胃微生物活性的重要体现，产气量越多，产气速率越快，表示底物降解和微生物活性越高[14]，另外总产气量也是反映底物可发酵程度的体现[8]。本试验结果表明，48 h前累积产气量和总产气速率，0.425 mm组皆高于20 mm组，说明饲料经过粉碎，其底物降解率变快。其原因可能是饲料经过粉碎，增加了饲料的表面积，使其与细菌和酶类接触增多，使其更容易被消化[15]。但72 h累积产气量和理论最大产气量，两组没有显著性差异，这一结果产生的原因可能因为两组发酵底物的基本营养物质相同，只有物理状态的区别，随着发酵时间的延长，都能到达发酵的平台期，从而产生最大产气量基本相同。乔富强[16]通过对比蒸汽压片玉米处理前后对其产气量的影响，得出了相同的结果，研究表明玉米经过蒸汽压片处理后并未改变其可利用的营养物质量，发酵底物中总营养物质含量并未发生波动，因此试验结果两组体外总产气量上无显著性差异。
瘤胃液pH 可以反映瘤胃内环境变化、瘤胃微生物和机体代谢状态，以及判断瘤胃功能状态是否稳定，是瘤胃生理功能是否健康的最直接体现[6]。反刍动物正常的瘤胃液pH变化范围一般是6.0～7.0[17]。本试验中，各组pH 均在6.73～6.88 内变化，处在正常的波动范围，发酵16 h后组间无显著性差异。
NH3-N 浓度反映了饲料在瘤胃发酵过程中利用蛋白质的情况[18]，是瘤胃微生物的主要能量来源。NH3-N被瘤胃微生物合成为MCP，作为反刍动物主要的氮来源供机体利用[19]。本试验中两组不同物理状态苜蓿干草产生的NH3-N浓度在发酵2、4 h和16 h时并没有显著差异，在发酵4 h之后，20 mm组NH3-N浓度略高于0.425 mm组，在发酵72 h时，20 mm组产生的NH3-N浓度极显著高于0.425 mm组。从MCP产量上看，两组均是由少变多的过程，在发酵16 h 到48 h，MCP 产 量0.425 mm 组 高 于20 mm 组。0.425 mm 组NH3-N浓度低于20 mm组的合理解释可能是粉碎状态的饲料更容易被微生物附着，使其饲料中的蛋白质快速分解，迅速被瘤胃微生物合成为MCP，导致0.425 mm组MCP浓度较高而NH3-N浓度较低；
而未经粉碎处理的饲料，其蛋白质分解利用较粉碎组慢，导致瘤胃微生物合成MCP速度慢，导致20 mm组MCP浓度较低而NH3-N浓度较高，说明饲料物理状态会影响瘤胃氮利用。
瘤胃VFA 浓度是反刍动物瘤胃代谢最重要的体现，VFA 作为反刍动物重要的能量来源，约占80%以上[20-21]。其中乙酸、丙酸和丁酸占总TVFA 的95%以上[22]。本试验中，两处理组其瘤胃VFA浓度都呈现上升的趋势，并且两处理组的VFA中乙酸浓度均高于丙酸浓度，这与Copani等[23]的研究结果相同。在48 h以后两组的TVFA 浓度没有显著性差异，说明两组底物存在的潜在碳水化合物含量不受物理状态的改变而改变，但在发酵24 h以前，TVFA浓度除丁酸外20 mm组都显著高于0.425 mm 组，说明对饲料进行粉碎加工，会对瘤胃VFA 产生速度也造成改变，从而影响对饲料的评价。
试验结果表明，不同物理状态会影响苜蓿干草的发酵特性，20 mm 苜蓿干草的产气速率极显著低于0.425 mm 苜蓿干草，但对发酵液pH 的波动影响较小，发酵前24 h，TVFA 浓度除丁酸外，20 mm 苜蓿干草均显著高于0.425 mm 苜蓿干草。因此，建议选择20 mm苜蓿干草作为发酵底物进行营养价值评价，更能体现其真实营养价值，并为饲料营养价值准确评价和日粮配方设计提供数据支撑。
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