克服萝卜自交不亲和性的化学试剂筛选
时间：2023-01-15 18:05:03 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
倪 萌， 王 娟， 王 爽， 梅 燚， 柳李旺， 徐 良， 王 燕
(1.南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业农村部华东地区园艺作物生物学与种质创新重点实验室/园艺学院，江苏 南京 210095；
2.江苏沿海地区农业科学研究所，江苏 盐城 224002)
萝卜(RaphanussativusL.)为十字花科重要根菜类作物，营养丰富、药用价值高[1-2]，属于典型异花授粉植物，杂种优势明显，多具有自交不亲和性(Self-Incompatibility，SI)，保证了遗传多样性[3-4]。利用自交不亲和系进行杂交制种是利用杂种优势的重要途径之一，避免了去雄操作，具有优势强、选育易、周期短等优点。然而在实际生产中，萝卜自交结籽困难限制了自交不亲和系的繁殖与保存，不利于其在优势育种中的广泛应用。
为提高自交不亲和系的繁殖效率，育种工作者对克服SI的物理方法、化学方法、生物方法进行了研究。目前广泛应用的CO2处理[5]、高温处理[6]、钢刷授粉[7]、射线辐射[8]等方法均可在一定程度上提高自交结实率，但操作困难，且效果不稳定，难以实现广泛应用。近年来，研究人员尝试利用多种化学方法进行SI的克服，如利用盐硼溶液(5%的氯化钠与2%的硼酸的复合溶液)、植物激素处理。结果表明，化学试剂能够明显提高甘蓝、白菜等芸薹属作物的亲和性[9-10]。汪骞等[11]发现，3%的NaCl溶液能有效提高萝卜的亲和性，可接近人工蕾期授粉效果。花期喷施NaCl溶液虽然具有价格低廉、节省人力物力的优点，但是效率不高，且在应用上易造成作物盐胁迫。此外，吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、细胞分裂素(6-BA)、赤霉素(GA3)等植物激素被发现可有效抑制芸薹属植物、百合和矮牵牛等植物的自交不亲和性，但不同作物之间差异较大，且在萝卜属作物上克服自交不亲和性的效果尚未明确。因此，急需寻找一种提高萝卜自交不亲和系亲本繁殖效率的方法。
孢子体自交不亲和主要表现为花粉水合与花粉管进入柱头受到阻碍，导致受精过程不能完成。近期研究报道，孢子体SI植物的自交不亲和性与柱头活性氧(ROS)强度呈正相关[12-15]。在大白菜柱头发育后期，自花花粉能够诱导花期柱头产生过量ROS，从而阻止花粉的萌发与花粉管的生长[15]。而在亲和拟南芥中，自花授粉后ROS在柱头中含量显著降低，花粉能够正常水合。因此，花粉管生长情况与柱头ROS强度可作为判断自交不亲和性的依据。
本研究利用不同浓度的槲皮素(Quercetin，QUE)、油菜素内酯(Bassinolide，BR)、褪黑素(Melatonin，MT)和激动素(Kinetin，KT)对3份萝卜高代自交系花期柱头进行喷施处理，比较不同处理下萝卜的结荚率和亲和指数。同时结合花粉管体外萌发及柱头ROS强度变化的差异，筛选克服自交不亲和性的最优化学方法，以建立克服萝卜自交不亲和性技术体系，进一步提高萝卜自交不亲和材料的繁殖效率，促进萝卜杂种优势的大面积应用。
1.1 试验材料
本研究选用3个萝卜高代自交系为试验材料(表1)。种子消毒后在培养皿中催芽1～2 d，4 ℃春化30 d，2020年8月播种于南京农业大学白马教学科研基地的温室大棚。化学处理及授粉试验于2020年11月至2021年5月进行。
表1 供试萝卜材料
1.2 试验方法
1.2.1 化学处理 本试验设置不同浓度的QUE、BR、MT和KT共10个处理(表2)，其中100 mg/L激动素为本研究室前期筛选，空白对照组为去离子水处理，同时进行花期自交(Flowering pollination，FP)与蕾期自交(Bud pollination，BP)处理。选取各自交系长势一致的植株，提前套袋，隔离授粉。于盛花期选取当天开的花进行喷施处理，每个处理5次重复，每个重复处理20～30朵花，柱头干后进行人工自花授粉。其中MT易光解，处理后需要进行遮光处理。授粉5 d后拆袋，30～45 d后，待种子成熟后收获。
表2 化学试剂及其处理浓度
1.2.2 亲和性测定 待种荚成熟后，计算各处理与对照的结荚率及亲和指数。萝卜自交不亲和性判定参照标准：亲和指数小于0.5为强自交不亲和，0.5～2.0为弱自交不亲和，大于2.0为自交亲和[16]。
1.2.3 花粉萌发试验 取各处理及对照自交授粉后4.0 h及48.0 h花柱，固定于FAA固定液(50% 乙醇∶冰乙酸∶甲醛=18∶1∶1，体积比)中，4.0 h后倒掉固定液，用ddH2O清洗干净并转入10 mol/L NaOH中，42 ℃软化0.5 h,用去离子水冲洗3次左右，加入适量0.1%苯胺蓝染液(苯胺蓝溶于1%的K3PO3)染色0.5 h以上[17-18]。样品置于荧光显微镜奥林巴斯 BX53©DAPI通道，观察花粉萌发状态。每个处理至少取5个柱头。
1.2.4 柱头ROS测定 取各处理花柱浸入MES-KCl(各试剂终浓度为:10 mmol/L MES，5 μmol/L KCl，5 μmol/L CaCl2，pH=6.5)缓冲液中，抽真空10 min后，移至新鲜MES-KCl缓冲液中。用50 μmol/L的2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2′，7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，H2DCF-DA,购自索莱宝科技有限公司)荧光染料黑暗染色1 h[19]。样品于奥林巴斯BX53©荧光显微镜GFP通道下观察ROS强度，曝光时间为800～900 ms[17]，每个处理至少取5个柱头。
1.3 数据处理
数据的统计整理采用Image J及Excel软件，差异显著性分析采用IBM SPSS Statistics Base V20.0软件和GraphPad Prism软件。
2.1 化学试剂类型对萝卜自交结实性的影响
与对照相比，本试验所选用的4种化学试剂均能在一定程度上克服萝卜自交不亲和性，可有效提高结荚率和亲和指数(表3)。其中100 mg/L KT处理后亲和指数可达2.45，接近于BP处理(2.85)，与王琴[20]的试验结果一致；
QUE试剂不同浓度处理平均亲和指数可达2.10，亲和性显著提高；
BR和MT处理后亲和指数分别是1.26和1.73，也提高了自交亲和性。结荚率的平均效应与亲和指数趋势基本一致，各试剂处理后，结荚率高于FP处理和CK(表3)。
表3 化学试剂对萝卜自交亲和指数和结荚率的平均效应
所选用的化学试剂虽然均能不同程度地提高萝卜自交亲和性，但也受品种基因型的影响。在NAU-YXYB和 NAU-LV791中，KT克服萝卜自交不亲和性的效果最显著，亲和指数分别提高至2.90与2.58；
其次为QUE、MT；
BR效果不明显。而对自交系NAU-WXQ，QUE处理效果较好(图1)。
FP、BP、CK、QUE、BR、MT、KT见表3注。不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。图1 不同化学试剂处理下萝卜自交亲和指数(A)和结荚率(B)Fig.1 Self-compatibility index(A)and podding rate(B)of radish under different chemical reagents treatments
2.2 化学试剂浓度对萝卜结实性的影响
适宜的试剂浓度对提高萝卜的亲和性至关重要。本研究选用的3个浓度的QUE处理均能在一定程度上提高萝卜亲和性，其中1.5 mmol/L QUE效果最显著，3个自交系处理后其亲和性均大幅提高；
不同浓度的MT效果差异较大，100 μmol/L为最优处理浓度，可大幅提高不亲和自交系的结荚率和亲和指数，过高或过低的浓度效果不理想。100 mg/L KT在各基因型萝卜中克服自交不亲和性的效果显著，普适性较好。BR在不同基因型中效果差异较大，广谱性也未得到证明(表4、图2)。
表4 不同浓度化学试剂对萝卜自交亲和性的影响
图2 强自交不亲和系NAU-YXYB自花授粉4.0 h(A)及48.0 h(B)后花粉管生长情况Fig.2 Pollen tube growth of the strongly self-incompatible line NAU-YXYB after self-pollination for 4.0 h(A)and 48.0 h(B)
综上所述，克服萝卜自交障碍的最优化学试剂为1.5 mmol/L QUE、100 μmol/L MT和100 mg/L KT，这些化学试剂处理均能有效克服萝卜自交障碍，提高萝卜自交亲和性。
2.3 化学试剂对萝卜自花授粉后花粉管生长的影响
采用苯胺蓝染色法进一步探究化学试剂对萝卜自花授粉后花粉管生长的影响。结果发现，自花授粉后，强不亲和系NAU-YXYB柱头上几乎无萌发的花粉粒；
而蕾期授粉4.0 h后，柱头上可清楚看到大量花粉粒萌发，并随时间的延长花粉管成束穿过柱头乳突细胞进入花柱组织。说明供试材料花期自交不亲和性明显。
分别用1.5 mmol/L QUE、100 μmol/L MT和100 mg/L KT处理新鲜花朵后，柱头上粘附的花粉粒与未处理相比增多，苯胺蓝染色结果(图3)显示，花粉能正常在柱头上萌发，授粉48.0 h后能在柱头下部观察到延伸的花粉管。以上试剂均能打破柱头屏障，使花粉粒正常水合、萌发，且花粉管伸长进入子房，完成受精作用。
2.4 不同化学试剂处理对萝卜花期柱头ROS强度的影响
有研究结果表明，孢子体自交不亲和植物的自交不亲和性与柱头活性氧强度呈正相关。Lan等[21]对不同发育阶段柱头的蛋白组学分析发现，成熟期柱头中参与ROS代谢的多个蛋白质表达明显上调，推测柱头ROS强度是影响自交不亲和的原因之一。利用荧光ROS检测剂H2DCF-DA对对照蕾期、花期雌蕊及化学试剂处理后的花期雌蕊进行了染色并在荧光显微镜下成像记录图像，进行ROS差异分析。结果(图3)表明，对照蕾期柱头ROS强度远低于花期柱头，约为花期柱头的36%，而1.5 mmol/L QUE、100 μmol/L MT和100 mg/L KT处理后的花期柱头ROS强度均有所下降，与对照花期柱头相比，下降幅度均在40%～50%。
不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。图3 不同化学试剂处理后H2DCFDA ROS探针染色柱头照片(A)与荧光强度(B)Fig.3 Images of stigma stained with H2DCFDA ROS probe (A) and fluorescence intensity (B) after treatment with different chemical reagents
在杂交育种实践中，利用自交不亲和系配制杂交种是萝卜杂种优势利用的重要途径[22]。但是由于萝卜本身自交亲和性差，结籽率低，杂交亲本繁殖与保存工作存在一定困难。因此，如何克服萝卜的自交障碍，实现自交不亲和系的高效繁殖成为萝卜F1代杂交种生产实践中亟待解决的关键问题。为了克服自交障碍，育种工作者已尝试蕾期授粉、高温处理后授粉[6]、电助授粉[23]等多种物理及生物学方法，但均由于操作复杂、生产成本高等缺点的限制，难以广泛应用。花期喷施盐硼溶液、植物激素等方法在甘蓝、白菜等芸薹属植物中取得了很好的效果，这些方法操作简单、效率高、成本低，适合应用于大面积田间制种。
本研究对克服萝卜自交不亲和性的最优化学方法进行了筛选。通过比较不同化学试剂(QUE、BR、MT、KT)克服萝卜自交不亲和性的效应，发现1.5 mmol/L QUE、100 μmol/L MT和100 mg/L KT 3种试剂处理能够大幅提高萝卜的自交亲和性，处理后亲和指数均达到2.0以上，可有效替代剥蕾授粉法在杂交亲本繁殖中的应用。
孢子体自交不亲和细胞学反应涉及花粉与柱头的相互作用，通过阻止花粉粒的水合与活化或限制花粉管发育而发生；
反应的信号传导主要通过同一S单倍型的SRK与SCR/SP11相互识别，并激活下游信号传导通路而发生[24-26]。QUE在克服孢子体自交不亲和性上已有一定研究。作为一种蛋白激酶抑制剂，QUE可以抑制甘蓝柱头中SRK活性，克服甘蓝自交不亲和性[27-30]。本研究对QUE克服萝卜自交不亲和性能力及处理浓度进行探究，发现浓度1.0～2.0 mmol/L的QUE均能提高萝卜的自交亲和性。MT作为新型激素能增加受旱棉花雌蕊中物质和能量的供应，促进花粉管伸长和胚珠受精[31]。本研究首次应用MT克服萝卜自交不亲和性，适宜浓度的MT克服萝卜自交不亲和性的效果十分明显。100 mg/L KT对萝卜自交不亲和性的克服具有显著效果，这与松原幸子等[32]的研究结果一致。
近年来，对SI机制的研究聚焦于柱头ROS积累抑制自身花粉萌发上，Lan等[21]利用蛋白质组学的研究方法研究发现，ROS代谢相关的蛋白质在羽衣甘蓝柱头发育成熟期明显富集；
Zhang等[15]的研究结果表明，柱头活性氧强度与大白菜自交不亲和性呈正相关作用，作用分子机制为活性氧合成酶受到上游调控因子Rac/ROP小G蛋白及细胞表面受体激酶FERONIA的调控，抑制该信号通路则阻止自花授粉引起的柱头活性氧强度升高，使柱头不再抑制自花花粉的萌发。本研究利用荧光ROS检测剂H2DCF-DA对未使用化学试剂处理(对照)蕾期、花期及使用化学试剂处理后的花期雌蕊进行ROS差异分析，发现与未使用化学试剂处理的花期柱头相比，1.5 mmol/L QUE、100 μmol/L MT和100 mg/L KT处理后的花期柱头ROS强度均有所下降，下降幅度为40%～50%，这与在白菜及羽衣甘蓝中的研究结果一致；
同时与花期自交授粉相比，试剂处理后柱头胼胝质的产生明显被抑制，萌发的花粉数及伸长的花粉管显著增加。推测可能是所选化学试剂处理通过降低花期柱头ROS强度，打破了柱头对自花花粉的屏障作用，从而提高了亲和性，其具体分子机制有待进一步研究。
