牛膝多糖通过Notch1,通路影响骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化的机制

岳宗进，刘汝银，于 露，王新立，徐向阳

（河南省中医院/河南中医药大学第二附属医院脊柱科，河南郑州 450000）

椎间盘退变（intervertebral disc degeneration,IDD）是中老年人的常见病和多发病，源于髓核组织退变，特点为髓核细胞数量、髓核含水量及蛋白多糖含量减少等[1]。IDD 加重引起腰痛、下肢疼痛麻木、腰椎支撑功能下降、间歇性跛行，甚至导致尿便失禁及性功能障碍[2]。临床通过手术和保守方法治疗IDD 具有一定效果，但不能逆转病理进程、恢复椎间盘组织。目前，通过注射椎间盘细胞、软骨细胞或干细胞治疗IDD 的再生医学在各种动物模型中得到广泛研究[3]。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells, BMSCs）可在不同诱导条件下分化为髓核样细胞[4]，BMSCs 向髓核样细胞分化的诱导剂及作用机制研究对治疗IDD 具有重要意义。牛膝多糖（achyranthes bidentata polysaccharides, ABPS）是从牛膝中提取的多糖类化合物，具有抗肿瘤、抗衰老、抗凝血及免疫调节等多种药理作用[5]。近年研究显示，ABPS 可以影响骨髓源破骨细胞的分化[6]。Notch 通路是一条高度保守的信号通路，在骨骼发育过程中起重要作用。Notch1 是Notch 家族中重要成员之一，既往研究显示，Notch1敲低后，可促进新西兰兔间充质干细胞向髓核样细胞分化[7]。基于以上研究，推测ABPS可影响BMSCs向髓核样细胞分化，但其具体作用机制报道甚少。因此，本研究以BMSCs 为对象，探讨ABPS 是否可通过调控Notch 通路，进而影响BMSCs 向髓核样细胞分化。

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF 级 SD 雄性大鼠 5 只，4 周龄，体质量80～100 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK（京）2016-0011。饲养条件：温度20～25 ℃，相对湿度45%～55%，明暗循环时间比1∶1，按照国家实验动物管理条例喂养。

1.1.2 药品、主要试剂和仪器 ABPS（纯度99.9%）由中国科学院上海有机化学研究所提供，脂质体LipofectamineTM2000 购自美国 Invitrogen 公司，编码Notch1 胞内域的真核表达质粒pcDNA3.1（+）及空载质粒由广州锐博生物合成，MTT、阿尔新蓝购自美国Sigma 公司，兔抗鼠Ⅱ型胶原（collagenⅡ）、聚集蛋白聚糖（aggrecan）、Notch1 抗体、Hes1、β-actin 抗体、山羊抗兔辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记二抗购自英国Abcam 公司，Hes1 抗体购自美国Santa Cruz 公司，酶标仪购自美国BioTek 公司，荧光定量PCR 仪购自美国Bio Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs 的分离与培养[8]取 5 只 SD 大鼠，颈椎脱臼法处死，750 mL/L 乙醇中浸泡5 min，剥取大鼠双侧后肢，750 mL/L 乙醇中浸泡2 min。无菌操作剔除大鼠后肢肌肉及骨膜，取出股骨和胫骨，无菌骨钳剪开两端骨骺使骨髓腔暴露。用不含血清的DMEM 冲洗骨髓数次至骨色发白，收集冲洗液至无菌离心管中，1 800 r/min（离心半径10 cm）离心10 min，用含100 mL/L 胎牛血清的干细胞专用培养基重悬细胞。调整细胞密度为1×106/mL 接种至培养皿，恒温细胞培养箱中 37 ℃、50 mL/L CO2、95% 湿度条件下培养。24 h 后全量更换细胞培养液，之后每3 d换液1 次。贴壁细胞融合度达90%，按1∶3 传代培养，反复贴壁纯化。取生长良好的干细胞，胰酶消化，1 000 r/min（离心半径10 cm）4 ℃离心5 min，PBS洗涤3 次，不同流式管分别加入FITC 标记的CD34、CD44、CD45 和CD90 抗体，同时设置同型阴性对照，冰上避光孵育 45 min，PBS 洗涤 3 次，500 μL PBS 重悬，流式细胞仪检测，结果显示细胞CD44、CD90 阳性表达率分别为99.27%、98.15%，CD34、CD45 阳性表达率分别为3.39%、2.52%，证实所分离细胞为BMSCs。

1.2.2 MTT 法检测细胞增殖 取第3 代BMSCs，调整细胞密度为1×105/mL 接种至96 孔板，每孔180 μL，培 养 过 夜 ，加 20 μL 不 同 浓 度 ABPS 使 其终质量浓度分别为 0、6.25、12.5、25、50、100、200、400 mg/L，每组设置 3 个复孔培养 48 h，不加 ABPS 作为空白组。每孔加20 μL MTT（5 mg/mL），培养箱中孵育4 h，弃上清，每孔加150 μL DMSO，室温避光孵育5 min。酶标仪检测490 nm 波长各孔吸光度A 值，计算细胞存活率。细胞存活率（%）＝实验组A 值/空白组A 值×100%。实验重复3 次，选择对BMSCs 生长无毒性的ABPS最高浓度作为后续实验干预浓度。

1.2.3 细胞转染及分组 将BMSCs 使用胰酶消化，按1×106/mL 密度接种到6 孔板，放入培养箱中培养，待细胞贴壁后，使用脂质体转染：将50 nmol/L 编码Notch1 胞内域的真核表达质粒pcDNA3.1（+）及空载质粒用50 μL Opti-MEM 稀释混匀，室温孵育5 min，另外将 3 μL LipofectamineTM2000 使用 50 μL Opti-MEM 稀释混匀，室温孵育5 min；
之后将两种稀释液混匀，室温孵育20 min，加入6 孔板中，混匀后放入培养箱继续培养，根据转染物质不同，分别设为Notch1 组和Notch1 阴性对照组。另设对照组（常规培养）、ABPS 组（200 mg/L ABPS）、ABPS+Notch1组（转染Notch1后加入200 mg/L ABPS）。培养48 h 后按照1.2.2 项方法用MTT 法检测各组细胞A 值。

1.2.4 阿尔新蓝法检测培养基内葡糖胺聚糖（glucosaminoglycan，GAG）含量 收集第1、4、7、10、14 天各组细胞培养基，阿尔新蓝法检测培养基内GAG 含量。配制不同浓度硫酸软骨素分别加50 μL/孔于96孔板中，设置 3 个复孔，再加 50 μL 阿尔新蓝溶液，振荡混匀，酶标仪激发光波长490 nm 检测各孔吸光度（A）值，以硫酸软骨素为横坐标，相对应浓度为纵坐标绘制标准曲线。将不同时间点收集的培养基按照上述方法检测培养基A 值，根据标准曲线方程计算不同时间点培养基内GAG 含量。

1.2.5 qPCR 检测 collagenⅡ、aggrecan 和 Notch1 通路相关基因mRNA 表达水平 收集各组细胞，PBS清洗，Trizol 试剂提取RNA，超微量分光光度计检测RNA 浓度和纯度。反转录体系：4 μL 5×Mix，1 μg RNA，RNase-free ddH2O 补 齐 20 μL。

反 应 程 序 ：25℃，10 min；
42℃，30 min；
85℃，5 min，产物稀释至1 mL 作为模板。荧光定量 PCR 反应体系：10 μL 2×SYBR Green Master Mix，1 μL 2.5 μmol/L 上、下游引物，2 μL 模板 cDNA，6 μL RNase-free ddH2O。反应 程 序 ：95 ℃ 预 变 性 60 s；
95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，循环 40 次。Primer3.0 软件设计目的基因qPCR 引物，序列见表 1。

表1 qPCR 引物序列Tab. 1 Primer sequences for qPCR

1.2.6 Western blotting 检测 collagenⅡ、aggrecan 和Notch1通路相关蛋白表达水平 收集各组细胞，提取总蛋白，BCA 法检测蛋白浓度，蛋白变性，100 mL/L SDS-PAGE 电泳分离蛋白，转膜仪转至PVDF 膜，50 mL/L 脱脂牛奶室温封闭 1 h，分别加 1∶1 000 稀释的 collagen Ⅱ、aggrecan、Notch1、Hes 和 β-actin 抗体4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜 10 min×3 次，再加 1∶2 000稀释的HRP 标记二抗室温孵育1 h，TBST 洗膜10 min×3 次，加ECL 化学液，于暗室曝光显影，Image 软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值/内参β-actin 蛋白条带灰度值的比值，作为目的蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析

使用SPSS 24.0 统计软件对实验数据进行统计学分析。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两间比较采用LSD-t检验，重复测量资料的比较采用重复测量方差分析。P＜0.05代表差异有统计学意义。

2.1 ABPS 对 BMSCs 增 殖 的 影 响

MTT 结 果 显 示 ，400 mg/L ABPS 作 用 BMSCs 48 h，与空白组比较细胞存活率降低（P＜0.05）。ABPS浓度≤200 mg/L 时，细胞存活率与空白组无统计学差异（P＞0.05）。因此，选择200 mg/L ABPS 进行后续实验（图1）。

图1 ABPS 对 BMSCs 增殖的影响Fig.1 Effect of ABPS on the proliferation of BMSCs

2.2 各组BMSCs 细胞增殖能力的比较

MTT 结果显示，BMSCs 细胞 A 值组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；
与对照组比较，Notch1组细胞 A 值降低，ABPS 组细胞 A 值升高（P＜0.05）；
ABPS+Notch1 组细胞 A 值高于 Notch1 组而低于ABPS 组（P＜0.05）；
Notch1 组细胞 A 值较 Notch1 阴性对照组降低（P＜0.05，表2）。

表2 各组BMSCs 细胞A 值的比较Tab. 2 A value of BMSCs in various groups （）

表2 各组BMSCs 细胞A 值的比较Tab. 2 A value of BMSCs in various groups （）

与对照组比较，*P＜0.05；
与Notch1 阴性对照组比较，#P＜0.05；
与Notch1 组比较，△P＜0.05；
与 ABPS 组比较，▽P＜0.05。

A 值0.79±0.13 0.76±0.11 0.37±0.09*#0.96±0.18*0.51±0.13△▽16.05＜0.001组别对照组Notch1 阴性对照组Notch1 组ABPS 组ABPS+Notch1 组F P

2.3 各组BMSCs 培养基内GAG 含量

随着诱导培养时间延长，各组BMSCs 培养基内GAG 含量增加。第 1、4 天各组 BMSCs 培养基内GAG 含量比较差异无统计学意义（P＞0.05），第7、10、14 天 BMSCs 培养基内 GAG 含量组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，Notch1 组培养基内GAG 含量减少，ABPS 组培养基内GAG 含量增加（P＜0.05）；
ABPS+Notch1 组培养基内 GAG含量较 Notch1 组增加，而较ABPS 组减少（P＜0.05）；
Notch1 组培养基内GAG 含量较Notch1 阴性对照组减少（P＜0.05，图2）。

图2 各组BMSCs 培养基内GAG 含量的比较Fig.2 GAG content in the medium of BMSCs in various groups

2.4 各 组 BMSCs 中 collagen Ⅱ 、aggrecan、Notch1和Hes1 mRNA 表达水平

qPCR 结 果 显 示 ，BMSCs 中 collagen Ⅱ 、aggrecan、Notch1 和 Hes1 mRNA 相对表达量组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，Notch1组collagen Ⅱ、aggrecan mRNA 相对表达量降低，Notch1 和 Hes1 mRNA 相 对 表 达 量 升 高 ，ABPS 组collagenⅡ、aggrecan mRNA 相对表达量升高，Notch1和 Hes1 mRNA 相对表达量降低（P＜0.05）；
ABPS+Notch1 组 collagenⅡ、aggrecan mRNA 相对表达量高于 Notch1 组而低于 ABPS 组，Notch1 和 Hes1 mRNA相对表达量低于Notch1组而高于ABPS 组（P＜0.05）；
与 Notch1 阴性对照比较，Notch1 组 collagenⅡ、aggrecan mRNA 相对表达量降低，Notch1 和Hes1 mRNA相对表达量升高（P＜0.05，图3）。

图3 各组 BMSCs 中 collagenⅡ、aggrecan、Notch1 和 Hes1 mRNA相对表达量Fig. 3 Relative expressions of collagenⅡ,aggrecan,Notch1 and Hes1 mRNA in BMSCs of various groups

2.5 各 组 BMSCs 中 collagen Ⅱ 、aggrecan、Notch1和Hes1 蛋白表达水平

Western blotting结果显示，BMSCs 中 collagenⅡ、aggrecan、Notch1 和 Hes1 蛋白相对表达量组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，Notch1 组collagenⅡ、aggrecan 蛋白相对表达量降低，Notch1 和Hes1 蛋白相对表达量升高，ABPS 组collagen Ⅱ 、aggrecan 蛋 白 相 对 表 达 量 升 高 ，Notch1 和Hes1 蛋白 相 对表 达 量降 低（P＜0.05）；
ABPS+Notch1 组collagenⅡ、aggrecan 蛋白相对表达量高于Notch1 组 而 低 于 ABPS 组，Notch1 和 Hes1 蛋 白 相对表达量低于 Notch1 组而高于 ABPS 组（P＜0.05）；
与Notch1 阴性对照比较，Notch1 组 collagenⅡ、aggrecan蛋白相对表达量降低，Notch1 和Hes1 蛋白相对表达量升高（P＜0.05，图4）。

图4 各组 BMSCs 中 collagenⅡ、aggrecan、Notch1 和 Hes1 蛋白表达Fig.4 Protein expressions of collagenⅡ, aggrecan, Notch1 and Hes1 in BMSCs of various groups

椎间盘（intervertebral disk，IVD）在生命早期即表现出退化、衰老的状态，随年龄增长IDD 患病率增加[9]。IDD 发病机制主要包括髓核和纤维环含水量、胶原、蛋白多糖等减少，张力下降，弹性减小，韧性降低以及椎间隙变窄等[10]。随着组织工程和再生医学的发展，修复和再生IVD 组织成为可能[11]。其中，髓核细胞移植为IDD 治疗提供了良好的前景[12]。髓核细胞生长缓慢，体外培养难度较大。研究显示，BMSCs 可在体外诱导培养向髓核样表型分化[13]，为临床IDD 治疗提供新的思路和方法。

牛膝是一种中草药，常用于治疗骨质疏松症和骨不连，其提取物经研究证实可发挥抗炎、解热、抗风湿病、利尿和抗骨质疏松症等多种药理作用[14]。MA等[15]研究表明，牛膝提取物可通过抑制糖酵解途径和促分裂原活化的蛋白激酶/蛋白激酶B 信号通路介导的细胞凋亡保护软骨细胞功能。ABPS 是牛膝的主要有效成分之一，具有多种生物学活性且毒副作用小。XU 等[16]研究显示，ABPS 可以诱导树突状细胞的分化和成熟。SONG 等[6]研究表明，ABPS 可以通过抑制核因子κB 受体激活蛋白配体信号转导抑制破骨细胞的分化和骨吸收活性，从而预防骨质流失。目前，ABPS 对BMSCs 向髓核样细胞分化的影响及作用机制研究较少。本研究以BMSCs 为实验对象，经ABPS 诱导培养后发现，细胞增殖能力升高，培养基中 GAG 含量增加，collagenⅡ、aggrecan mRNA 和蛋白表达水平上调。collagenⅡ、aggrecan 是髓核样细胞的特征性表面标志，胞外基质中GAG 含量可作为体外培养扩增髓核样细胞分泌基质功能的判断依据。实验结果提示，ABPS 可以诱导BMSCs 向髓核样细胞分化。

BMSCs 向髓核样细胞分化过程涉及多条通路。多 项 研 究 显 示 ，NAMPT-Sirt1 通 路[17]、ERK1/2 通路[18]均与BMSCs 向髓核样细胞分化有关。Notch 通路参与细胞增殖、迁移、分化等多种生物学行为，在细胞分化发育过程中发挥重要作用[19]。Notch 家族包含4 种受体（Notch1-4），Notch1 受体是一个跨膜蛋白，配体和受体结合后，Notch1 蛋白被γ-分泌酶切并释放出胞内活性片段，入核后与Rbp-jκ 结合形成转录起始复合物，启动靶基因如Hes1 的转录，Hes1 作为信号通路下游基因的转录阻遏物发挥作用。Notch信号通路参与BMSCs 分化已被多次证实。GUO等[20]研究显示，来那度胺可通过激活Notch 信号通路恢复多发性骨髓瘤患者BMSCs 的成骨分化。LONG等[21]研究表明，抑制Notch 信号通路可促进BMSCs向神经元样细胞分化。SEMENOVA 等[22]研究发现，Notch 通路关键分子剂量依赖性促进间充质干细胞的成骨分化。本研究结果显示，经ABPS 处理后，BMSCs 中 Notch1、Hes1 mRNA 和 蛋白的表达水平降低，而过表达转染Notch1 后则呈相反的作用效果，过表达Notch1 后再用ABPS 处理后，Notch1 对相关基因转录和蛋白表达的促进作用被逆转，证实ABPS对Ntoch1 的调控作用，提示ABPS 可能通过抑制Notch 通路促进BMSCs 向髓核样细胞分化。

综上所述，ABPS 可以促进BMSCs 向髓核样细胞分化，作用机制可能与调控Notch 信号转导通路有关，为ABPS 相关药物的研发及应用于IDD 治疗提供理论支持。

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