基于上转换能量共振转移的纸芯片检测三磷酸腺苷
时间：2022-12-08 13:50:04 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
李田霞, 陈 峰
(1.武汉职业技术学院生物工程学院,湖北武汉 430074；
2.武汉职业技术学院机电工程学院,湖北武汉 430074)
三磷酸腺苷(ATP)可促使机体各种细胞的修复和再生，增强细胞代谢活性，在细胞新陈代谢调节和细胞生理环境的生化通道中扮演着举足轻重的角色。ATP的检测始于上世纪60年代，Mcelroy等人[1]用荧光素酶与ATP的化学反应来检测其含量。此外，还有层析法、荧光法、生物发光、化学发光和电化学生物传感器等方法[2，3]。然而，这些方法都不能避免复杂基质组分产生的一系列副反应，特别是生物发光中用到的酶很不稳定，所以急需探索出一种新的检测手段。
纸芯片的检测方法中，比色法灵敏度不高；
化学发光法由于现有的化学发光体系较少，限制了其应用范围；
常规荧光法灵敏度高但又有很强的背景干扰。上转换荧光共振能量转移(UC-FRET)法本质上是一种反斯托克斯发光，在近红外光的激发下，可以很好地消除来自生物样品的本底荧光和散射光的干扰[4]。目前，UC-FRET技术主要用于均相检测体系中，将其应用于纸基分析装置依然是一个全新的方向。
本研究采用一步水热法[5]制得了上转换纳米颗粒(UCPs)作为FRET体系的能量供体，以超声法[6]合成氧化碳球(OCNPs)作为FRET体系的能量受体，构建了基于UC-FRET的纸基检测装置来检测ATP。利用ATP与适配体的特异性结合，实现了缓冲溶液中ATP的快速定量测定。该方法有效地避免了纸质背景荧光和散射光的干扰，成本低，灵敏度高。
1.1 仪器和试剂
980 nm近红外激光器(北京海特光电有限责任公司)；
离心机(TGL-16G，上海安亭科学仪器厂)；
空气恒温振荡器(TH2-C，太仓市实验设备厂)；
微型漩涡混合仪(WH-2，上海沪西分析仪器厂)；
低温离心机(LEGEND Micro 17R，美国Thermo scientific公司)；
高压反应釜(济南恒化科技有限公司)。
5′-NH2-ACCTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3′三磷酸腺苷适配体、三磷酸腺苷为分析纯，上海生工生物工程有限公司；
碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl盐)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)为分析纯，Sigma-Aldric；
2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)为分析纯，济南恒化科技有限公司；
三羟甲基氨基甲烷(Tris)为生化试剂，上海如吉生物科技发展有限公司。实验用水为超纯水。
1.2 实验方法
1.2.1 UCPs标记ATP适配体UCPs与ATP适配体的偶联过程参考文献方法[7]。取5 mg PAA修饰的UCPs，溶于2 mL pH=5.5的MES缓冲溶液中，小心滴加0.76 mg EDC·HCl，2.2 mg Sulfo-NHS。然后在恒温孵育箱中以30 ℃、150 r/min的条件恒温孵育2 h，再在9 000 r/min条件下离心6 min，分离得到固体沉淀用超纯水洗涤3次。将固体沉淀溶于2 mL pH=7.2的HEPES缓冲溶液中，向该缓冲溶液中小心滴加5 nmoL ATP适配体。在恒温孵育箱中以30 ℃、150 r/min孵育4 h后，加50 mg Tris除去多余的Sulfo-NHS。在9 000 r/min条件下离心6 min，用超纯水洗涤3次，将沉淀分散于pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，配制成0.02 mg/mL的UCPs-aptamer溶液，储存于4 ℃的冰箱里待用。
图1 纸芯片的制作Fig.1 Fabrication of paper chips
1.2.2 纸芯片的制备纸芯片采用一步绘图法进行制备，具体操作步骤如下:在电脑上设计纸芯片图案(检测区域形状为圆形，直径为4 mm，呈阵列状排列)，然后在办公用纸上打印图案，将模具(孔径略大于检测区域直径)覆盖在纸张表面，用油性笔沿模具孔径边缘在纸张表面绘制检测区域，然后将纸张翻转过来在反面同样位置进行绘制。利用油墨中残留的有机试剂形成疏水壁垒，分隔出直径约为4 mm的检测区域，如图1所示。将绘制完成的纸芯片置于干燥箱中干燥2 h，密封保存。
1.2.3 纸芯片的检测用移液枪移取2 μL上述UCPs-aptamer溶液滴加到纸芯片反应区内，将纸芯片轻轻置于恒温振荡反应器(30 ℃)中30 min使溶剂挥发。然后滴加0.03 mg/mL的OCNPs 2 μL，置于恒温振荡反应器(30 ℃)中孵育90 min，让供受体充分结合，使供体荧光完全猝灭。然后，再向上述UCPs-aptamer-OCNPs复合物中加入不同浓度的ATP，然后在30 ℃ 下反应30 min，让荧光得到充分的恢复。待样品冷却至室温后，将其置于980 nm近红外半导体激光器测定其上转换荧光强度，装置功率设定为600 mW。
2.1 纸基UCPs-FRET传感器的构建机理
本实验设计的纸芯片构造如图2所示：带羧基的UCPs与5′修饰有氨基的ATP的适配体在纸芯片检测区域中共价偶合，随着溶剂的挥发，偶联产物可以通过范德华力、氢键等作用力牢固负载在纸基检测区域中，加入OCNPs后，由于OCNPs表面带有负电荷的羧基和羟基，可以和适配体发生π-π堆叠作用使得UCPs的荧光被猝灭[8]。当加入ATP后，由于ATP与其适配体发生特异性结合，形成较OCNPs更为稳定的复合物，将OCNPs竞争下来，当用980 nm的激发光时，UCPs的荧光得以恢复。随着ATP浓度增加，UCPs的荧光恢复程度增大，由此实现ATP的定量检测。
图2 UCPs-OCNPs的FRET示意图Fig.2 Diagram of UCPs-aptamer-OCNPs FRET
2.2 最佳孵育时间的选择
用移液枪移取2 μL UCPs-aptamer溶液滴加到纸芯片反应区内，将纸芯片轻轻置于恒温振荡反应器(30 ℃)中30 min使溶剂挥发。然后滴加0.03 mg/mL的OCNPs 2 μL，置于恒温振荡反应器(30 ℃)中。分别在孵育0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 min后，测量荧光强度。由图3可得，在反应前1 h内荧光被猝灭的幅度较大，到1 h后猝灭幅度不断减小，到了90 min后，曲线基本呈现出一个平台，说明至此猝灭已经全部完成。本实验选用90 min为最佳孵育时间。
图3 孵育时间对荧光强度的影响Fig.3 Effect of incubation time on fluorescence intensity
2.3 OCNPs浓度的选择
用移液枪分别移取2 μL UCPs-aptamer溶液滴加到纸芯片的不同反应区内，将纸芯片轻轻置于恒温振荡反应器(30 ℃)中30 min使溶剂挥发。加入2 μL不同浓度的OCNPs溶液(0、0.005、0.01、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04 mg/mL)，加完后立即放到恒温孵育箱中以30 ℃，150 r/min的条件孵育90 min，然后在相同条件下，从低浓度至高浓度测量荧光强度。如图4所示，向体系中加入不同浓度的OCNPs后，UCPs的荧光不断减弱。当OCNPs的浓度为0.04 mg/mL，荧光猝灭程度达到平台，其荧光被猝灭的幅度达到最大60%，这样的猝灭效率使OCNPs成为一种新型的猝灭剂。
图4 不同浓度的OCNPs对UCPs-aptamer的猝灭Fig.4 Upconversion fluorescence spectra of UCPs-aptamer at different concentrations of OCNPs
2.4 ATP的检测
当向UCPs-aptamer-OCNPs体系(0.03 mg/mL UCPs-aptamer，0.04 mg/mL OCNPs)中加入ATP后，Aptamer会被诱导形成一个口袋型结构[9]，ATP与之发生了特异性结合，形成更稳定的复合物，这种结合力明显削弱了Aptamer与OCNPs之间的π-π堆叠作用[10]，从而使能量供体与能量、受体分开，能量供体UCPs的荧光得以恢复。
在最优实验条件下，纸芯片对0、0.05、1、5、50、100、200 nmol/mL ATP的响应如图5所示，能量供体UCPs的荧光恢复强度与ATP的浓度呈线性相关，线性浓度范围为0.5～200 nmol/L。线性方程为:y=0.0065x+0.0974(R2=0.9985)。根据公式3Sb/k计算，ATP的检测限低至0.36 nmol/L。
图5 UCPs荧光强度恢复与ATP浓度的线性图Fig.5 Linear relationship between UCPs fluorescence intensity recovery and ATP concentration
2.5 纸芯片对ATP的选择性
为了考察纸芯片对ATP的特异性，选用了三磷酸鸟嘌呤(GTP)、三磷酸尿苷(UTP)、三磷酸胞嘧啶(CTP)进行干扰实验，干扰物质浓度均为80 nmol/L，是ATP的4倍，结果如图6所示。从图6可以看出，只有加入ATP后，荧光强度才有明显的回升，而干扰物质对纸芯片的荧光没有明显的恢复作用，从而证明了纸芯片对ATP的特异性识别。
图6 纸芯片对ATP的选择性Fig.6 Selectivity of paper chips for ATP
本实验以上转换荧光纳米颗粒(UCPs)为能量供体，氧化碳球(OCNPs)为能量受体，构建了基于能量共振转移的纸芯片，利用适配体与目标物的特异性结合作用实现了缓冲溶液中ATP含量的检测。UCPs的荧光恢复强度与ATP的浓度在0.5～200 nmol/L内呈线性关系，检测限为0.36 nmol/L。该纸芯片制作简单，能够很好地克服纸质背景荧光，有很大的发展空间，也可将UCPs的表面修饰上不同的核酸适配体或者功能分子，以实现多种目标物的检测。
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