新型冠状病毒肺炎细胞因子的动态变化及与主要临床结局的关系
时间：2022-12-03 09:55:05 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
张宏英， 方素芳， 王婷， 黄明翔， 王垚， 陈力舟
新型冠状病毒肺炎(Coronavirus disease 2019, COVID-19)是由严重呼吸道综合征冠状病毒 2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)引起的新型呼吸道传染性疾病，首例病例于2019年12月报道，随后各国相继出现大规模的病例报告，成为重大全球卫生公共事件，彻底改变了社会秩序。SARS-CoV-2感染后临床表现差别巨大，病情严重程度不一，病情危重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征或多器官功能衰竭等[1-2]。研究表明，淋巴细胞亚群的变化与病情密切相关[3]，细胞因子水平失衡所致细胞因子风暴可能参与了疾病发展过程。本研究拟探讨病情不同严重程度的COVID-19 患者住院期间及出院后1个月的辅助性T细胞(helper T cell, Th，包括Th1、Th2和Th17)分泌的细胞因子水平的动态变化，了解COVID-19病情发展的免疫机制，制定有效的治疗策略以改善临床主要结局。
1.1 对象 收集2020年1月25日—5月2日在福建省福州肺科医院确诊的COVID-19患者，所有患者收住院前均经过至少2次核酸检测证实为阳性，诊断及病情分型标准参考国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》[4]。轻型和普通型为轻症组，重型和危重型为重症组。排除孕妇及儿童。本研究为前瞻性、单中心研究，遵循赫尔辛基宣言，研究方案通过笔者医院伦理委员会审核[2020-001(科研)-01]，患者均签署知情同意书。
1.2 方法 入组患者分别于入院后第4—6天、第7—10天、第11—15天及出院后1个月留取外周静脉血，3 000 r/min离心15 min后冻存于-80 ℃冰箱，留待批量检测。收集入组患者的人口学特征(性别、年龄、体质量指数、吸烟史)，临床特征(如合并症、入院时症状等)，入院时的检验及检查资料，治疗方案(如抗病毒、免疫调节治疗等)，预后(生存、死亡)。
1.3 细胞因子检测 白细胞介素(interleukin， IL) 2、IL-4、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)、干扰素(interferon, IFN) γ、IL-17A及IFN-α检测采用细胞微球芯片技术(cytometric bead array, CBA)，试剂盒为BD CBA Human Th1/Th2/Th17 Cytokines Kit(批号560484，美国BD公司)及 Human IFN-Alp CBA Flex Set (批号560379，美国BD 公司)，流式细胞仪(BD FACS Calibur，美国BD公司)检测、CBA专用分析软件(FCAP Array v1.0，美国BD公司)进行标准曲线绘制及数据分析。操作步骤按照说明书进行。
2.1 基本情况 共入组36例患者，重症组5例，均为重型COVID-19，其中男性2例，女性3例，年龄(69.0±12.4)岁(57～85岁)。轻症组31例，其中轻型2例，普通型29例，女性15例，男性16例，年龄(42.6±14.4)岁(20～72岁)。重症组年龄大于轻症组，差别有统计学意义(P<0.001)。两组患者的男女性别组成、体质量指数、吸烟史方面比较，差别无统计学意义(P>0.05)。两组患者最常见的症状为发热(21/36，58.3%)和咳嗽(19/36，52.8%)，气促、咳痰、胸闷和乏力肌痛发生率低，两组患者呼吸道相关症状发生率比较，差别无统计学意义(P>0.05)。重症组5例均合并心脑血管病史，比例高于轻症组(100.0%vs25.8%，P=0.003，表1)。
表1 两组患者基线特征比较Tab.1 Comparison of base data between mild and severe patients
2.2 辅助检查 重症组白细胞(white blood cell, WBC)及中性粒细胞(counting and neutrophil, NEU)计数低于轻症组，差别有统计学意义(P<0.001，P=0.049)；
重症组乳酸脱氢酶(higher lactate dehydrogenase, LDH)、D-二聚体(D dimer, D-D)、C反应蛋白(C reactive protein, CRP)的值均高于轻症组，差别具有统计学意义(P<0.05)；
其他检验指标如淋巴细胞、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、肌酸激酶及降钙素等比较，差别均无统计学意义(P>0.05，表2)。
表2 两组患者检验结果比较Tab.2 Comparison of laboratory findings between mild and severe patients
2.3 治疗及转归 入院后所有患者均给予抗病毒治疗，药物包括阿比朵尔、α-干扰素、洛匹那韦/利托那韦，免疫治疗药物包括胸腺法新、人血白蛋白、糖皮质激素及恢复期血浆。重症组中，4例应用胸腺法新，1例应用人血白蛋白，2例应用糖皮质激素，1例应用恢复期血浆；
轻症组中9例应用胸腺法新。重症组4例应用氧疗(4/5， 80.00%)，轻症组2例应用氧疗(2/31， 6.45%)。两组患者入院后的热退时间、核酸阴转时间、住院天数比较，差别均无统计学意义(P>0.05，表3)。无死亡病例。
表3 两组患者主要临床结局比较Tab.3 Comparisons of main clinical outcome between mild and severe patients
2.4 细胞因子检测结果 轻症组和重症组的IL-2、IFN-γ、IFN-α、TNF、IL-4及IL-17A值比较，差别均无统计学意义(P>0.05)。重症组IL-6、IL-10水平高于轻症组，差别有统计学意义(P=0.001，P<0.001)。两组患者IL-6、IL-10值在不同时间段、不同时间段的变化率两两比较，可见IL-6值在入院后逐渐升高，第7—10天时达高峰，随后逐渐下降，到出院1个月时达最低水平。重症组在第7—10天时为91.95(39.60，146.65) pg/mL，第11—15天时为106.41(75.71，125.19) pg/mL，第4—6天时为70.08(41.14，71.66) pg/mL，出院后1个月时为3.95(3.85，6.91) pg/mL；
IL-10则是入院第4—6天即达高峰，随后逐渐下降，入院第11—15天降至最低水平并维持到出院后1个月，重症组在第4—6天时为(13.42±9.02) pg/mL，第7—10天时为(9.70±3.06) pg/mL，第11—15天时为(7.10±5.90) pg/mL，出院后1个月时为(5.99±4.50) pg/mL(表4—6，图1，2)。
表4 两组患者细胞因子检测结果Tab.4 Cytokines level in mild and severe patients
表5 两组患者细胞因子重复测量方差分析结果Tab.5 Results of repeated measure ANOVA for cytokines level in two groups
表6 两组患者细胞因子广义线性模型固定效应结果Tab.6 Fixed effect results of generalized linear model for cytokines level in two groups
图1 两组患者的白细胞介素6水平比较Fig.1 The IL-6 level of mild and severe patients
图2 两组患者的白细胞介素10水平比较Fig.2 The IL-10 level of mild and severe patients
2.5 细胞因子与临床主要结局直线回归分析 将各细胞因子各时间段的值与主要临床结局(包括热退时间、核酸阴转时间、住院天数)进行直线回归分析，结果提示，入院第4—6天的IL-6水平与热退时间相关(r=0.539)，提示IL-6值越高热退时间越长；
而第4—6天的IL-10水平与核酸阴转时间相关(r=0.466)，提示IL-10值越高核酸阴转时间越长(图3，4)。
图3 患者第4—6天IL-6水平与热退时间散点图Fig.3 Correlations between IL-6 (Day 4-6) and time of fever relieving
图4 患者第4—6天IL-10水平与核酸阴转时间散点图Fig.4 Correlations between IL-10 (Day 4-6) and time of virus acid negative conversion
COVID-19为新发急性呼吸道传染病，由β属的冠状病毒感染所致，该病毒可跨种族传播。研究显示，SARS-CoV-2病毒表面S蛋白识别并结合人呼吸道上皮细胞血管紧张素转换酶Ⅱ(angiotensin converting enzyme Ⅱ， ACE2)受体后进入宿主细胞[5]。SARS-CoV-2在淋巴结和脾等免疫器官大量增殖，破坏淋巴细胞和单核细胞，从而导致淋巴细胞水平下降。病理解剖也发现，虽然肺泡腔和肺间隔内大量淋巴细胞浸润，但同时也存在CD4+和CD8+T 细胞过度激活，表现为CD4+T细胞中高度促炎性CCR4+、CCR6+和Th17增加，CD8+T细胞的高细胞毒性[6]。因此，病毒感染后适度的固有免疫和获得性免疫反应可迅速控制病毒，失衡的免疫应答会导致细胞因子风暴和高病死率。
既往研究发现，重症SARS和MERS均存在不同程度的细胞因子风暴[7-8]，并引起细胞免疫功能紊乱，表现为IFN-γ、TNF-α、IL-15、IL-17A及IFN-α升高。COVID-19和SARS、MERS均为β属的冠状病毒所致，但现有的数据表明，COVID-19的死亡率低于后两者[9]，推测参与炎症反应的细胞因子可能不尽相同，导致组织损伤程度不同。2019年12月COVID-19爆发以来，关于细胞因子在COVID-19中表达的研究[10]也证实了这一猜测，重症患者外周血的IL-6、IL-10、IL-2、IFN-γ、IL-2R、IL-8和TNF-α较轻症患者明显升高，且NEU和LYM计数的比值、NEU与CD8+T细胞的比值与患者预后密切相关，是疾病进展的重要预测标志物。本研究中，重症组的IL-6和IL-10水平高于轻症组，与上述研究结果一致。对不同时间段IL-6值两两比较发现，患者入院后IL-6进行性升高，住院第7—10天时达到高峰，随后开始下降，到出院后1个月降至最低值。与轻症组比较可见，重症组在入院第4—6天至第7—10天之间变化率为80.32%，高于轻症组的38.96%，表明这段时间重症组IL-6值上升较快，增幅明显高于轻症组。本研究直线回归分析发现，入院第4—6天的IL-6水平与热退时间呈正相关。因此，对于重症患者，入院10 d内的病情监测非常重要，动态监测IL-6对早期识别细胞因子风暴具有重要的预后和治疗意义[11]。对于存在细胞因子风暴的患者，适时启动适量的抗炎治疗可能有助于改善预后。GUARALDI等[12]报道，33例重症COVID-19 患者接受了IL-6受体单克隆抗体托珠单抗治疗，与标准治疗组比较，降低了死亡率或有创机械通气风险(HR=0.61，P=0.02)，但新发感染发生率也高于标准治疗组(13%vs4%，P<0.000 1)。一项随机、安慰剂对照的COVACTA研究证实，托珠单抗可缩短中度缺氧使用有创机械通气的COVID-19患者的住院时间[13]。IL-10的动态变化与IL-6略有不同，入院第4—6天即达高峰，随后开始下降，入院第11—15天时降到最低水平，而后一直保持稳定水平，直至出院后1个月。因此，在疾病刚刚发生阶段需重视IL-10的绝对值。本研究直线回归分析提示，IL-10水平与核酸阴转时间呈正相关，提示IL-10值越高，核酸阴转时间越长。因此，COVID-19 的传染性与其免疫功能恢复息息相关。
IL-4、IL-6和IL-10是Th2辅助T细胞分泌的细胞因子，而IL-2、IFN和TNF则是Th1辅助T细胞分泌的细胞因子，通常Th1和Th2细胞之间通过分泌细胞因子，彼此进行交叉调节、相互抑制，故在免疫应答的起动阶段，如果某一亚群免疫细胞应答占据主要地位，那么这种Th细胞就会正反馈地加强自身增殖，并抑制另一亚群发展，Th1/Th2愈来愈不平衡是细胞因子过度释放、靶器官损伤的根源。本研究组重症组IL-6和IL-10水平明显高于轻症组，说明重症组患者存在免疫失衡。但本研究两组患者间IL-2、IFN-γ、IFN-α、TNF、IL-4和IL-17A水平比较，差别无统计学意义；
而现有的文献报道[3，14-15]显示，以上部分指标在轻症和重症组间差别有统计学意义，部分指标则无统计学意义。考虑可能与以下原因有关：(1)影响Th1/Th2分化除了上述的细胞因子外，还有遗传、病原体等因素。(2)与入组患者病情组成有关，本研究重症组患者例数较少，且5例均为重型患者，无危重型患者，可能存在数据偏移。(3)与采集外周血的时间有关。(4)本研究无死亡患者，且两组患者LEU计数、动脉血氧分压比较，差别无统计学意义，也说明入组患者预后相对较好，故炎症失衡的程度可能较低。
综上所述，重症COVID-19患者的WBC和NEU计数下降，LDH、D-D和CRP升高，IL-6和IL-10水平在疾病早期即明显升高，并且与热退时间、核酸阴转时间相关，其他细胞因子水平变化不明显，提示存在免疫失衡。及时清除炎症介质、降低炎症水平可能可以改善预后，但是最佳用药时机、疗效和安全性评估还需要有大样本的研究来证实。
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