生物炭施用对节水灌溉稻田甲烷产生菌与氧化菌的影响
时间：2022-12-02 13:35:04 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
彭灯云，杨士红，李伟征，李 明，戴惠东，周姣艳
（1.河海大学农业科学与工程学院，南京 211100；
2.昆山市城市水系调度与信息管理处，江苏昆山 215300）
稻田是甲烷排放的重要来源[1]，约占农业生产活动的15%左右[2]，作为主要温室气体之一，其排放对环境气候的影响大，稻田的甲烷减排成为了相关领域研究热点。近年来大量研究表明节水灌溉与生物炭施用均能降低稻田甲烷排放。汪勇等研究表明了生物炭的施用能够降低南方双季稻稻田甲烷的排放量，氮肥配施20 t/hm2生物炭和氮肥配施40 t/hm2生物炭能使甲烷累积排放量分别下降32.43%和41%[3]。有研究发现，不同种类的生物炭也能够不同程度降低甲烷的排放[4]。刘珂纯等研究发现生物炭在大田中施用降低了20%左右的甲烷排放，且其甲烷排放量随着生物炭施用量的增加先增大后减小[5]。也有研究表明水分管理对于稻田甲烷的排放具有重要作用[6-9]。王永明等发现间歇灌溉和控制灌溉这两种灌溉方式均能显著减少稻田甲烷的排放，间歇灌溉能显著降低62.5%～88.0%的甲烷排放总量，控制灌溉的甲烷排放总量降低了68.1%～95.2%[10]。已有研究更多关注减排规律、减排量等，较少关注两种措施对甲烷产生、排放相关微生物的影响。因此，本文开展节水灌溉与生物炭施加的田间试验，基于荧光定量PCR 方法研究两者联合应用对稻田产甲烷菌和甲烷氧化菌丰度的影响，以期能为稻田甲烷的减排提供科技支撑。
1.1 试验区条件
试验地位于河海大学水文水资源与水利工程科学国家重点实验室昆山试验研究基地，试区属亚热带南部季风气候区，年平均气温15.5 ℃，年降雨量1 097.1 mm，年蒸发1 365.9 mm，日照时数2 085.9 h，平均无霜期234 d。当地习惯稻麦轮作，土壤为潴育型黄泥土，耕层土壤质地为重壤土，0～18 cm土层土壤有机质21.71 g/kg，全氮1.79 g/kg，全磷1.4 g/kg，全钾20.86 g/kg，pH值7.4，0～30 cm土壤容重1.32 g/cm3。
1.2 试验设计
试验中灌溉模式采用无水层控制灌溉(C)和常规灌溉(F)2种方式。控制灌溉下水稻秸秆生物炭施用量设置3个水平，分别为对照0(A)、中等生物炭施用量20 t/hm2(B)和高生物炭施用量40 t/hm2(C)，常规灌溉下设置高生物炭施用量水平40 t/hm2(FC)，试验共4 个处理(CA、CB、CC 与FC)，每个处理设3 次重复。水稻秸秆生物炭于2016年水稻移栽前一次性施入，其基本性状见表1。试验在蒸渗仪中进行，为小区域尺度的稻田，每个蒸渗仪面5 m2( 2.5 m×2 m)。淹水灌溉在整个生育期均保留3～5 cm 的水层。控制灌溉处理在返青期田面保留10～30 mm薄水层，以后的各个生育期灌溉后稻田不建立水层，以根层土壤水分占饱和含水率60%～80%的组合为灌水控制指标。试验水稻品种为南粳46，株距13 cm，行距25 cm，每穴苗量为3～4 株。2018年6月23日插秧，10月25日收割。施肥量和施肥时间按照当地农民习惯进行，见表2。
表1 所用生物炭的基本性质Tab.1 the basic properties of the biochar used
表2 施肥时间及施用量Tab.2 the fertilizer time and usage
1.3 样品采集与分析
供试土样于水稻分蘖期、抽穗开花及乳熟期分别采集一次。取0～20 cm 表层土壤，用五点法混匀，装入自封袋中，立即带回实验室放在-80 ℃冰箱保存，用于DNA的提取。
1.4 DNA的提取和标准曲线的制作
土壤DNA 用土壤DNA 快速提取试剂盒（MP Biomedicals，美国）提取，每个处理取0.5 g 土壤，操作步骤按照试剂盒操作说明进行。以提取的DNA 为模板，合成特异性引物，对其进行切胶纯化，用pMD™19-T Vector Cloning Kit（大连TaKaRa公司）试剂盒克隆，取100µl 菌液均匀涂在含Ampicillin 的琼脂培养基上过夜培养。随机取阳性菌株，接种到含氨苄抗性的LB 培养基中过夜培养，然后提取质粒DNA 并用1.0% 的琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的提取质量，并用NanoDrop 分光光度计（NanoDrop Technologies，美国）测定DNA 浓度及纯度，并根据目的片段和质粒片段大小计算DNA 中的目的基因拷贝数，通过原始质粒DNA 中目的基因的拷贝数，以10倍梯度稀释8个梯度浓度。以基因浓度的对数为横坐标，定量PCR测出的阈值循环次数Ct值为纵坐标绘制标准曲线，见图1，根据标准曲线计算出DNA 样品中的pmoA和mcrA基因拷贝数。
图1 pmoA和mcrA基因标准曲线Fig.1 pmoA and mcrA gene standard curve
1.5 实时荧光定量PCR
本试验选取产甲烷菌的mcrA基因、甲烷氧化菌的pmoA基因进行实时荧光定量PCR 分析，反应在荧光定量PCR 仪（杭州BIOER，Lightcycle K）上进行。通过实时荧光定量PCR，采用SYBR染料法，根据获得的标准曲线和定量PCR测出的阈值循环次数Ct值，对样品进行绝对定量。反应体系总体积为20µL，其中包含10µl SYBR Premix Ex TaqⅡ（Bµlk，宝生物工程（大连）有限公司），正向引物（10µmol/L）、反向引物（10 µmol/L）各0.8 µL，1 µL 的模板DNA，ddH2O 补足至20µL。每个样本3 个重复。根据基因序列，设计合成引物的信息见表3。扩增条件：94 ℃预变性30 s，94 ℃变性10 s，60 ℃退火12 s，72 ℃延伸30 s，循环40 次，最后72 ℃单点检测信号。
表3 引物信息Tab.3 The primer information
1.6 数据统计与分析
采用Excel 2016 进行初步分析，结果用3 次重复的平均值±标准误表示，并对所得到的数据进行柱状图的绘制；
用SPSS 19.0统计分析软件的单因素分析和独立样本t检验来判断显著性水平（p=0.05）。
2.1 生物炭施用对节水灌溉稻田甲烷氧化菌和产甲烷菌的影响
各个生育期生物炭施用水平对pmoA和mcrA基因的影响见图2，本文选取基因拷贝数对数来表征基因丰度。总体来看，除乳熟期CA处理pmoA基因数量低于mcrA基因数量外，3个生育期各处理的pmoA基因丰度均高于mcrA基因丰度，并且在水稻分蘖盛期两种基因的丰度最大。随着生育期的延长，各处理的两种基因的丰度分别呈递减趋势。与不施加生物炭相比，施加不同水平的生物炭均增加了稻田土壤pmoA基因和mcrA基因的拷贝数对数。
图2 不同生育期各处理土壤中pmoA和mcrA基因丰度Fig.2 The abundance of pmoA and mcrA genes in soils of different growth stages and treatments
在乳熟期，高水平(40 t/hm2)和中等水平（20 t/hm2）生物炭的添加均显著提高了pmoA基因和mcrA基因的丰度。相较于无生物炭添加，CB 和CC 处理的pmoA基因丰度分别显著增加了26.7%和36.6%（p＜0.05），mcrA基因丰度分别显著增加了3.6%和8.6%（p＜0.05）。在分蘖期拔节孕穗期，施加中等水平生物炭均可以显著增加pmoA和mcrA的基因拷贝数对数（p＜0.05），高等水平生物炭的添加也能增加两种基因的数量，但效果并不显著。
2.2 灌溉模式对稻田土壤甲烷氧化菌与产甲烷菌的影响
由图3可以看出，水分管理在一定程度上显著影响了稻田土壤中甲烷氧化菌和产甲烷菌的基因丰度，见图3。在3 个生育期中，甲烷氧化菌pmoA基因数量均大于产甲烷菌mcrA基因数量。淹灌处理中，pmoA基因和mcrA基因均在拔节期达到峰值，而控灌处理的pmoA基因和mcrA基因丰度则在分蘖期达到最大。除拔节孕穗期控灌稻田土壤中pmoA和mcrA基因拷贝数对数小于淹灌稻田外，在分蘖期和乳熟期，控制灌溉稻田土壤的pmoA基因和mcrA基因丰度均大于淹水灌溉稻田土壤。
图3 不同生育期灌溉模式对土壤中pmoA和mcrA基因丰度的影响Fig.3 The effects of irrigation patterns at different growth stages on the abundance of pmoA and mcrA genes in soil
在分蘖期和乳熟期，与FC 处理相比，CC 处理的pmoA基因丰度显著增加了25.2%和70.5%（p＜0.05），mcrA基因丰度分别显著增加了12.7%和42.2%（p＜0.05）。在拔节孕穗期，CC处理两种基因拷贝数对数略低于FC处理，淹水灌溉处理稻田土壤中pmoA基因和mcrA基因拷贝数对数均值分别为4.54 g/µL 和3.95 g/µL，控制灌溉稻田土壤中两种基因拷贝数对数均值分别为4.21 g/µL和3.67 g/µL。
2.3 稻田土壤pmoA/mcrA比
总体来看，随着生育期的推移，pmoA/mcrA比有不断增加趋势，但各个生育期内pmoA/mcrA比值变化规律不一致，见图4。控制灌溉条件下，与CA 处理相比，生物炭的施加使分蘖期pmoA与mcrA的比值显著降低了7.9%左右（p＜0.05）。相反，乳熟期施加生物炭则使pmoA/mcrA比显著升高了23.3%和26.3%（p＜0.05），而随着生物炭施用量的增加，比值没有发生显著变化。同时，生物炭的施加在拔节孕穗期也并没有使比值发生显著变化。在生物炭施加水平一定的情况下，与淹水灌溉处理相比，控制灌溉处理在拔节期的pmoA与mcrA比值略微降低，但效果不显著。在分蘖期和乳熟期控制灌溉处理则显著增加了pmoA/mcrA比值（p＜0.05）。
图4 不同生育期各处理间pmoA和mcrA基因拷贝数对数的比值Fig.4 The ratio of pmoA and mcrA gene copy number logarithms between treatments at different growth stages
3.1 生物炭对稻田土壤甲烷氧化菌和产甲烷菌丰度的影响
本实验发现在分蘖期两种基因丰度达到峰值，且随时间逐渐减小，推测可能由于分蘖期水稻生长旺盛，甲烷氧化菌和产甲烷菌活性较强[13]，导致两种基因丰度随之增强。李大明等发现在一定条件下产甲烷菌和甲烷排放存在一定正相关关系[14]，且也已有研究表明在水稻分蘖期甲烷排放骤然增多而后消减[15,16]，这与本研究的发现一致。通过测定稻田土壤中的pmoA基因和mcrA基因，发现生物炭的施加能显著提高甲烷氧化菌和产甲烷菌基因丰度（p＜0.05），这些与许欣等的研究结果基本一致[17]。甲烷氧化菌基因丰度的提高可能是因为生物炭发达的孔隙结构能够更好的增加土壤的氧气含量[18,19]，土壤的通气性大大改善，为甲烷氧化菌提供了良好的生长环境[20]。
控制灌溉条件下，生物炭的添加也显著增加了产甲烷菌基因丰度，但小于生物炭对甲烷氧化菌基因的促进程度。这可能是由于生物炭提高了土壤中微生物生物量碳的浓度[21]，通过消耗可利用的土壤碳源，产甲烷菌的更迭演替速度加快，所以mcrA基因拷贝数对数能够显著增加。这说明了生物炭的加入相当于为土壤中加入了营养物质，微生物可利用底物增加[22]，各种生物量都有可能增加。但各处理在不同生育期甲烷氧化菌pmoA基因拷贝数对数高于产甲烷菌mcrA基因（图2），这与刘少文等研究的水稻移栽后不同天数pmoA基因拷贝数总小于mcrA基因拷贝数的结果不一致[23]，也有研究表明mcrA基因丰度与甲烷通量的动态关系更为密切[24]，与pmoA基因拷贝数负相关，说明甲烷排放量并不完全局限于产甲烷菌或甲烷氧化菌基因其中的任何一个[25]，可能与pmoA/mcrA比的变化关系密切[26]。
3.2 灌溉方式对稻田土壤甲烷氧化菌和产甲烷菌丰度的影响
如图3所示，在施加高水平生物炭的条件下，除拔节期外，控制灌溉显著提高了pmoA基因和mcrA基因丰度。控制灌溉导致甲烷氧化菌pmoA基因拷贝数对数的增加与前人研究一致[27]。有大量研究表明控制灌溉改变了常规灌溉稻田的厌氧环境，增加了土壤中氧气浓度[28,29]，可利用的底物增多促进了好氧菌的生长[30]，这可能是pmoA基因丰度增高的主要原因。
控制灌溉水分亏缺促进了水稻根系的生长[31]，研究表明，水稻根长、白根数量等均高于淹水灌溉稻田[32,33]，控制灌溉水稻自身调节产生大量的根系分泌物[34,35]，为产甲烷菌的生长提供了丰富有机质的类型和总量，导致节水灌溉稻田土壤产甲烷菌mcrA基因丰度有所增高。本研究结果也发现控灌处理pmoA基因和mcrA基因的峰值出现在分蘖期，而淹灌处理的峰值出现在拔节期，这与前人关于节水灌溉和常规灌溉对甲烷排放峰值的结果一致[36]，进一步说明了甲烷氧化菌及产甲烷菌基因丰度与甲烷排放有着密切联系。
3.3 生物炭施用及灌溉方式对稻田土壤pmoA 与mcrA比值的影响
施加生物炭和控制灌溉都促进了pmoA基因和mcrA基因丰度，但对mcrA基因的促进作用小于pmoA基因，因此可以用pmoA/mcrA比值来说明生物炭及灌溉方式对两种菌丰度的影响。已有研究表明，pmoA/mcrA比值可以很好的解释田间甲烷排放量的问题[37]。吴讷等研究发现，土壤甲烷的排放与pmoA基因或者mcrA基因其中任何一个有相关关系，而与二者的比值显著相关[8]。吴震等[38]、李松等[39]研究发现生物炭施用能够抑制稻田甲烷的排放。王均美等通过研究稻田产甲烷菌数量和甲烷产生率发现相较于淹水灌溉，控制灌溉可以减少土壤甲烷的排放[40]。岳进等也发现稻田土壤甲烷的排放受到甲烷氧化菌和产甲烷菌共同代谢的影响，并且节水灌溉可以减少土壤中甲烷的排放[41]。本研究发现，施加生物炭和控制灌溉在乳熟期均能够显著提高pmoA/mcrA比，表明甲烷氧化能力强于产甲烷能力，进一步说明生物炭施用和控制灌溉能够减少土壤甲烷排放。
本文通过研究了控灌条件下不同水平的生物炭施用对节水灌溉稻田甲烷氧化菌和产甲烷菌基因丰度的影响，主要结果与结论如下：
（1）生物炭施用能够提高节水灌溉稻田土壤pmoA基因和mcrA基因丰度，乳熟期高等水平生物炭添加效果更显著，而中等水平生物炭在分蘖期和拔节孕穗期效果更显著。乳熟期相较于无生物炭添加，CB 和CC 处理的pmoA基因丰度分别增加了26.7%和36.6%，mcrA基因丰度分别增加了3.6%和8.6%。分蘖期CB 处理相较于CA 处理来说，pmoA基因和mcrA基因丰度分别增加了7.8%和17.2%；
拔节孕穗期CB 处理相较于CA处理来说，pmoA基因和mcrA基因丰度分别增加了6.7%和6.9%。
（2）控制灌溉在分蘖期和乳熟期能够显著增加稻田土壤pmoA和mcrA基因丰度。在分蘖期和乳熟期，与FC 处理相比，CC 处理的pmoA基因丰度显著增加了25.2%和70.5%，mcrA基因丰度分别显著增加了12.7%和42.2%。
（3）控制灌溉和施加生物炭均能显著增加pmoA/mcrA比值，即控制灌溉和生物炭施加能够提高土壤的甲烷氧化能力，减少稻田土壤甲烷的排放。乳熟期施加生物炭使pmoA/mcrA显著升高了23.3%和26.3%；
在分蘖期和乳熟期控制灌溉处理pmoA/mcrA比值分别显著增加了11.1%和20%。
