非洲猪瘟病毒抗原检测试纸条检测方法的建立及初步评价
时间：2022-12-02 13:20:04 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
蒋 菲，杨春江，汪葆玥，张 昕，张 莹，王睿男，赵荣茂，吴佳俊，王传彬，倪建强*
(1.中国动物疫病预防控制中心，北京 102618；
2.北京纳百生物科技有限公司，北京 100176)
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一种猪的急性、热性高度接触传染性疾病[1-4],发病率和病死率可高达100%，是世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health,OIE)法定报告的动物疫病之一，也是我国农业农村部《一、二、三类动物疫病病种名录》中规定的一类动物疫病[2]。2018年8月，我国首次发生ASF疫情，截至2020年6月31日，全国31个省(市、自治区)已报道191起疫情，对我国养猪业造成巨大危害。目前尚无有效的疫苗可用于ASF的免疫预防，快速早期诊断及对疫情的及时处置，是预防和控制该病的主要手段。
ASFV属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，为双链DNA病毒，ASFV P72蛋白位于病毒衣壳表面，在ASFV感染中起重要作用[6-8]。研究表明，P72蛋白对自然感染具有免疫原性且其免疫原性较为稳定，因此P72蛋白是血清学检测的主要靶抗原[9-11]。ASFV感染48 h后，病原学检测即可转阳，但抗体转阳时间较晚，通常在7～9 d后抗体检测为阳性[12]。同时ASFV感染的特急性和急性病例致死时间较早，因此，对于感染的早期诊断以病原学检测为主。目前，荧光PCR被广泛应用于ASFV检测，但是，该检测方法需要有荧光PCR仪以及一定的操作经验和实验室条件，限制了该方法在基层实验室或养殖场的使用。试纸条检测技术不仅特异、灵敏、快速，而且不需要复杂的仪器设备，是基层养殖场户和兽医机构开展ASFV感染早期检测最为方便的技术，基于该优点以及ASFV临床和基层实验室检测的实际需求，本研究建立了ASFV快速检测试纸条方法，并对其进行了系统评价和初步应用，以期为基层实验室和养殖场ASFV现场检测提供有力的技术支撑。
1.1 蛋白、病毒、单克隆抗体和临床样品ASFV P72重组蛋白、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)由中国动物疫病预防控制中心实验室保存，ASFV临床样品由中国动物疫病预防控制中心实验室采集和保存。抗ASFV P72蛋白单克隆抗体7A7株和3E1株由北京纳百生物科技有限公司制备保存。猪瘟活疫苗、猪伪狂犬疫苗购自武汉科前科生物股份有限公司、高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗购自中牧实业股份有限公司。
1.2 主要试剂及仪器设备商品化羊抗鼠IgG购自杭州索莱尔博奥生物技术有限公司；
乳胶微球购自苏州为度生物技术有限公司；
硝酸纤维素膜购自长沙博优生物科技有限公司；
玻璃纤维滤膜购自上海金标生物科技有限公司；
PVC板购自北京金材生物科技有限公司；
其他胶体金试纸条制备材料购自上海捷宁生物工程有限公司。ASF检测试剂盒购自西班牙INGENASA(英吉纳)公司。ASFV荧光PCR检测试剂盒(兽药生字010628858)购自北京森康生物技术开发有限公司。
ABIStepone荧光定量PCR仪购自ABI公司；
划膜仪购自上海捷宁生物科技有限公司；
切条机购自杭州峰航科技有限公司。
1.3 ASF抗原试纸条检测方法的建立
1.3.1乳胶微球标记单克隆抗体 以抗ASFV P72蛋白单克隆抗体7A7株作为捕获抗体，使用乳胶球标记法进行标记。取100 μL粒径为300 nm的乳胶微球按说明书进行活化，活化后加入15 μg单克隆抗体，快速混匀，室温孵育3 h。加入100 μL封闭液(20 g/L的BSA，用终浓度为100 mmol/L乙醇胺溶液充分溶解)，室温孵育1 h。17 000 r/min离心10 min，弃上清，加入1 mL标记缓冲液(50 mmol/L MES，pH 6.0)重悬微球，重复2次，去除未结合的抗体。最后加入1 mL标记缓冲液重悬微球，即为抗体微球标记复合物，4℃备用。
1.3.2乳胶微球垫的制备 吸取1 mL 恢复至室温的抗体微球标记复合物溶液，用其均匀润湿切好的玻璃纤维膜。室温晾干12～16 h，置于装有干燥剂的密封袋中，密封备用。
1.3.3检测线和质控线的包被 选择抗ASFV P72蛋白单克隆抗体3E1株作为硝酸纤维素膜上检测线的检测抗体，并以羊抗鼠IgG抗体作为质控线检测抗体。用划膜包被液(含1%蔗糖、0.05%叠氮钠的50 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.4)分别将检测线抗体及质控线抗体稀释至1.5，0.3 g/L，用划膜仪以0.1 μL/mm喷涂于黏附在PVC板的硝酸纤维素膜上，40℃烘干16 h，室温干燥备用。
1.3.4样品垫的制备 将裁剪好的玻璃纤维样品垫用样品垫溶液(含0.5% 吐温20的20 mmol/L 磷酸盐缓冲液，pH 7.4)浸泡，室温干燥16 h，备用。
1.3.5试纸条组装及检测方法 试纸条组装方法如图1所示，最底层为划有检测线(T线)及质控线(C线)的NC膜。T线一侧的NC膜，由下至上分别为贴有样品垫1、乳胶微球垫、滤血膜、样品垫2、样品垫3。在C线一侧，NC膜上方贴有吸水纸。将组装好的检测板修剪整齐，送入切条机，切成宽为(4.0 ± 0.1)mm的试纸条，挑取无划痕、无污渍，边缘整齐的试纸条，放入卡的底卡中，盖上卡壳的盖，送入压盖机中压盖，放入干燥剂后密封，2～8℃保存。
图1 试纸条结构示意图
检测时，取1滴(约30 μL)样品至加样孔，随后垂直缓慢滴入3滴样本稀释液，等待10～20 min判定结果，超过20 min后结果无效。若质控线显色，检测线显色，判定为阳性结果；
若质控线显色，检测线不显色，则判定为阴性结果。
待检样品可为全血、脾脏或淋巴结样本，其中全血样品应为抗凝血样品，脾脏、淋巴结等组织采样时需同时在3个不同位置分别取样，称取样品约1 g，剪碎混匀，再取0.1 g进行研磨，加入1.5 mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5 mL灭菌离心管中，8 000 r/min离心2 min，取上清液100 μL待检。样品的采集和处理应遵循相应的生物安全规定，处理好的血清、全血或研磨破碎后的组织样品应连同EP管在生物安全柜中60℃水浴灭活30 min。
1.4 试纸条的检测、灵敏度、特异性和稳定性试验
1.4.1对照样品的制备 阴性对照样品的制备：将经ASFV荧光PCR检测试剂盒检测为ASFV核酸阴性的仔猪，无菌采集抗凝血，加入0.01%硫柳汞，定量分装，置-70℃以下保存。阳性对照样品的制备：将ASFV P72重组蛋白用ASFV核酸阴性的仔猪抗凝血稀释至0.25 g/L，定量分装备用。
1.4.2灵敏度试验 将阳性对照样品用ASFV核酸阴性抗凝血作倍比稀释，使其样品中ASFV P72重组蛋白质量浓度分别为25 000.00，2 500.00，250.00，25.00，2.50，0.25 μg/L。随机选取本研究试制的3批试纸条进行检测，确定该检测方法灵敏度。
1.4.3特异性试验 特异性样品制备：使用猪瘟活疫苗、高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗、猪伪狂犬疫苗按照说明书稀释后经0.45 μm微孔滤膜过滤后无菌分装，500 μL/管。PPV、PCV2细胞培养样液样品分别经0.45 μm微孔滤膜过滤后无菌分装，500 μL/管。随机选取本研究试制的3批试纸条进行检测，确定该检测方法特异性。
1.4.4稳定性试验 随机选取本研究试制的3批试纸条于2～8℃保存，在第0，3，6，9，12，15个月进行稳定性试验，检测质量浓度分别为250.00，25.00，2.50 μg/L的阳性对照样品，阴性对照样品及特异性试验样品。检测样品均在-20℃保存。
1.4.5临床样品的检测 采用3个批次的ASFV抗原检测试纸条对100份的临床样本(全血50份、脾脏25份、淋巴结25份)进行检测，并同时进行荧光定量PCR检测，比较2种方法的符合率。
2.1 ASF抗原试纸条的制备和鉴定
2.1.1乳胶微球标记捕获抗体 选择7A7株单克隆抗体作为捕获抗体，3E1抗体作为检测抗体用于建立ASF抗原试纸条检测方法。标记好的7A7单抗乳胶微球复合物为红色的不溶性颗粒，可稳定保存于4℃。
2.1.2试纸条的检测结果验证 将7A7单抗乳胶微球复合物包被在结合垫上，并将3E1单抗包被在硝酸纤维素薄膜表面作为检测线(T线)。7A7单抗乳胶微球复合物与待测样品中的抗原结合后，通过毛细作用在层析条上渗滤、移行并与膜上的3E1单抗反应，从而以颜色直观显示检测结果。该试纸条对ASFV阳性对照样品和阴性对照样品的检测如图2所示。结果表明，本研究制备的试纸条可特异性检测ASFV阳性对照品，在质控线和检测线位置均出现清晰的条带；
而阴性对照品仅在质控线(C线)位置有显色。
A.阳性对照样品；
B.阴性对照样品；
C.质控线；
T.检测线
2.2 特异性试验本研究试制的3批试纸条可与ASFV P72重组蛋白反应，均不与猪瘟病毒(CSFV)、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、PRV、PPV和PCV2产生交叉反应(表1)，试纸条特异性良好。
表1 特异性试验结果
2.3 灵敏度试验结果表明,3批试纸条检测结果一致，试纸条的灵敏度可达到2.50 μg/L(表2)。
表2 灵敏度试验结果
2.4 稳定性试验结果显示，ASFV P72重组蛋白质量浓度为250.00，25.00，2.50 μg/L的阳性对照样品检测结果均为阳性，特异性对照样品检测结果均为阴性，表明试纸条存放15个月时仍能保持良好的灵敏度和特异性(表3)。
表3 稳定性试验结果
2.5 临床样品的检测随机抽取100份临床样品(50份全血、25份脾脏、25份淋巴结)进行检测，同时与商品化荧光PCR试剂盒进行比较。结果显示，试纸条检测出阳性全血样品20份、脾脏样品8份、淋巴结样品7份，共35份阳性样品，检出率为35%(35/100)。荧光PCR试剂盒检出阳性全血样品30份、脾脏样品10份、淋巴结样品10份，检出率为50%(50/100)，3种样品使用2种方法进行检测的符合率分别为80%，92%，88%，总体符合率为70%(表4，5，6)。
表4 试纸条和荧光PCR试剂盒方法检测结果比较(全血样品) 份
表5 试纸条和荧光PCR试剂盒方法检测结果比较(脾脏样品) 份
表6 试纸条和荧光PCR试剂盒方法检测结果比较(淋巴结样品) 份
2020年以来，我国共发生29起ASF疫情，虽然疫情发生强度低于2018年，但2020年5月22日OIE通报印度首次发生ASF疫情，加之韩国、缅甸等周边国家近2年ASF疫情仍在发展，我国ASF疫情防控工作仍然十分艰巨。有较多研究在灭活病毒疫苗、减毒活疫苗重组亚单位疫苗等方向进行了尝试，但疫苗保护效果都不甚理想，疫苗研究仍存在一定难点[13]。由于目前尚无商品化的疫苗可用于ASF的预防，因此该病的防控措施仍以扑杀为主，力争做到早发现、早控制。
本试验建立的检测试纸条方法为乳胶微球免疫层析法(DLIA)，使用染色的乳胶微球作为标记物，通过乳胶微球的羧基与抗体等蛋白质分子胺基共价结合形成稳定的结合物，其颗粒大小均一程度和结构稳定程度均优于通过静电吸附物理结合制备的胶体金抗体复合物。因此与传统的胶体金免疫层析试纸条相比，DLIA显色更加稳定，成本相对较低，试纸条保存时间更长[14]。目前，DLIA方法在PRV gE蛋白抗体检测、牛日本血吸虫病抗体检测或动物源性食品莱克多巴胺、盐酸克仑特罗、磺胺及喹诺酮等药品检测的领域均有应用[15-18]。
本研究制备的ASFV-DLIA试纸条灵敏度可达到2.5 μg/L，且特异性良好，在2～8℃保存有效期长达15个月。对100份临床样品进行检测，试纸条检测出阳性样品35份，检出率为35%(35/100)。荧光PCR试剂盒检出阳性样品50份，检出率为50%(50/100)，2种方法的符合率为85%，一致性良好。
虽然荧光PCR相较试纸条检测技术的敏感性更高。但是，鉴于ASFV-DLIA试纸条不需要复杂的仪器设备，操作简便，对检测操作人员实验技术要求低，同时检测耗时短且检测成本低等特点，该方法在临床样品快速检测上具有一定优势，更适合现场和基层实验室应用，尤其在大规模养殖场、屠宰场、散养户、畜牧兽医站或运输环节等ASF防控前端的推广使用。
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