基于UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技术的3种蒿属植物化学成分比较研究

毕玥琳，张诗芸，冯欣，杜小伟，瓮学智，孙毅坤*（.北京中医药大学中药学院，北京 0400；
.北京市药品检验研究院，北京 006；
3.北京市丰台区食品药品安全监控中心，北京 0007）

蒿属（

Artemisia

）为菊科（Compositae）春黄菊族（Anthemideae）蒿亚族（Artemisiinae）植物，是该族中第一大属。我国蒿属植物分布广泛，在温带、热带、山区、草原、荒漠等地区均有分布，种类众多，且大部分均为草本植物，常具有特殊香气。该属中的许多植物具有抗炎、止血、利尿、解毒等功效，在医药业具有较高的经济价值。茵陈（Artemisiae scopariae herba）、艾叶（Artemisiae argyi

folium）、藏龙蒿（Artemisia waltonii）同为蒿属植物，形态相似，不易从外表进行鉴别，且3种药材经炮制过后更加难以区分，经常在中药材市场及临床应用中发生混淆。茵陈是一种代表性的蒿属植物药，来源于茵陈蒿（

Artemisia capillaris

Thunb

.

）或滨蒿（

Artemisia scoparia

Waldst

.

et Kit

.

）的干燥地上部分，主要分布于陕西、山西、河北等地，其味微苦微辛，能泄能降，在治疗肝胆湿热、清利脾胃、通利小便方面疗效显著，也常用于治疗热结黄疸等症。艾叶来源于植物艾（

Artemisiae argyi

Levl

.

et

Vant

.

）的干燥叶，在我国东北、华北、华东、西南等地有广泛分布，为温性药，可以暖气血、温经脉、散寒湿，临床上多以复方配伍使用，善于安胎，治疗痛经等妇科疾病，同时，艾叶也是灸法的主要药用材料之一。藏龙蒿是菊科蒿属的植物，与牛尾蒿和野艾蒿同为野艾蒿的原植物，是中国的一种特有植物，分布于青海、四川、云南、西藏，其地上部分可以用来治疗皮肤病、疫疽、炭疽、虫病等疾病。近年来的研究表明，3种药材的功效有一定程度的相似，但其成分是否存在差异，差异是否影响到药理作用，尚未见有相关文献报道。

UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技术具有高灵敏度、高分离能力的特点，常被用于中药材及中药复方复杂化学成分的鉴定。

目前，蒿属植物之间的差异鉴别研究主要集中于外观鉴别，本研究采用UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技术，依据相关数据库及相关文献，结合化合物准分子离子峰、碎片离子及保留时间分别鉴别3种蒿属植物中所含有的化合物，为3种蒿属植物之间的鉴别提供了新的思路与方法。

1.1 仪器

Thermo Scientific Q Exactive质谱仪、Xcalibur工作站、Vanquish Duo UHPLC System for Dual LC Workflows液相系统、Pico 17 高速离心机（美国Thermo Scientific公司）；
CPA225D 电子天平（德国SARTORIUS公司）；
KQ5200DA 超声波清洗机（中国昆山舒美公司）。

1.2 试药

质谱级乙腈（中国赛默飞世尔科技有限公司）、质谱级甲酸（美国ROE公司）；
水为屈臣氏饮用水；
茵陈（批号：67248413259）、艾叶（批号：10036376822278）（北京同仁堂）及藏龙蒿（河北安国药材市场）均由北京市药品检验研究院常增荣主任药师鉴定。

2.1 样本制备

将3种植物样品剪碎（直径0.1～0.2 cm），临用前分别称取0.2 g，加75%的甲醇10 mL浸没，超声30 min，将提取液于4828 g离心10 min后取出上清液，将上清液稀释5倍后，再次于4828 g离心10 min后取出上清液，即得。

2.2 检测条件

2.2.1 色谱条件 Waters ACQUITY UPLC BEH C色谱柱（1.7 µm，2.1 mm×150 mm，Milford，MA，USA），柱温40℃，进样量5 μL，流速0.3 mL·min。流动相为 0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B），洗脱程序：0～2 min，5%B；
2～17 min，5%～98%B；
17～20 min，98%B。

2.2.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子化源（ESI）；
正负离子交替扫描；
扫描模式为：全扫描/数据依赖的二级扫描（Full scan/ddMS），扫描范围为

m/z

100～1300 Da，毛细管温度为350℃。正模式下的喷雾电压为3800 V，负模式下的喷雾电压为3200 V，鞘气为35 arb，辅助气15 arb，MS采用低、中、高的3种碰撞能量对母离子进行二级碎裂。考虑到不同结构化合物在正负离子模式下需要的能量不一样，同时为了增加碎片离子的多样性，正离子模式碰撞能为20 V、40 V、60 V，负离子模式碰撞能为30 V、50 V、70 V。一级质谱分辨率：70 000 FWHM（Full Width at Half Maximum），二级质谱分辨率：17 500 FWHM。

3种蒿属植物样品按照“2.2”项下条件进行UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS分析，在正离子模式下和负离子模式下对其进行检测，得到3种植物在正、负离子模式下的BPI图，分别见图1、2。将检测所得的准分子离子峰、碎片离子、保留时间等信息与相关文献数据进行分析和鉴定，得出茵陈、艾叶、藏龙蒿的化学成分，并对这三者的化学成分进行比较，若是化合物响应值低于1×10，则认定化合物未检出，鉴定结果见表1、2，图3为3种蒿属植物中化合物成分差异的韦恩图。结果共鉴定出45种化合物，包括有机酸类17个，黄酮类17个，香豆素类4个，氨基酸类2个，萜类2个等。

图1 茵陈（A）、艾叶（B）、藏龙蒿（C）正离子模式下离子流图及其对比图（D）Fig 1 Total ion current chromatograms of Artemisiae scopariae herba（A），Artemisiae argyi folium（B）and Artemisia waltonii（C）in positive ion mode and their comparison（D）

图2 茵陈（A）、艾叶（B）、藏龙蒿（C）负离子模式下离子流图及其对比图（D）Fig 2 Total ion current chromatograms of Artemisiae scopariae herba（A），Artemisiae argyi folium（B）and Artemisia waltonii（C）in negative ion mode and their comparison（D）

图3 茵陈、艾叶、藏龙蒿差异化合物韦恩图Fig 3 Venn diagram of differential compounds in Artemisiae scopariae herba，Artemisiae argyi folium and Artemisia waltonii

表1 3种植物中化学成分的UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS正离子鉴定结果
Tab 1 Identified chemical constituents of Artemisiae scopariae herba，Artemisiae argyifoliumand Artemisia waltonii by UHPLC-QExactive-Orbitrap-MS in positive ion mode

No.理论值（m/z） 碎片离子（m/z） 分子式 化合物名 tR（error）/min（×10－6）茵陈 艾叶 藏龙蒿1 116.0706102.1556，87.1049，70.0659 C5H9NO2 脯氨酸[13] 1.18（－2.58）1.18（－2.58）1.26（－2.58）2 165.0546123.0443，119.0494，95.0496 C9H8O3 对香豆酸[15] 1.64（－1.21） － －3 166.0862120.0810，103.0546，149.0599 C9H11NO2苯丙氨酸[17] 2.82（－0.60）2.84（0.60） 2.80（－1.20）4 207.0652190.0767，163.0390，135.0442 C11H10O4 滨蒿内酯[14] 4.95（0.00） 4.96（2.41） －5 355.1024163.0390，145.0286，135.0442 C16H18O9 1-咖啡酰奎宁酸[13] 5.56（0.28） 5.61（0.00） 5.60（0.28）6 355.1021163.0390，135.0442，117.0337 C16H18O9 绿原酸[14] 5.59（0.00） 5.61（0.00） 5.60（－0.56）7 179.0339151.0391，135.0441，123.0442 C9H6O4 7，8-二羟基香豆素[13] － 6.38（0.51） －8 177.0546163.0392，145.0284，135.0443 C10H8O3 7-甲氧基香豆素[18] 6.55（－1.96）6.54（0.00） －9 369.1180177.0546，161.1324，145.0286 C17H20O9 阿魏酰奎宁酸[15] － 6.55（－1.08） －10 465.1028303.0498，285.0389 C21H20O12 金丝桃苷[14] 6.75（－1.08）6.85（－1.51）6.63（－1.51）11 433.1129415.1017，397.0920，379.0811，337.0704，323.0912，313.0706，295.0603，283.0601 C21H20O10 牡荆素[14] 6.79（1.15） － －12 611.1606345.0605，303.0497，153.0181 C27H30O16 quercetin-3-O-robinoside[17] － － 6.83（－1.31）13 595.1657287.0549，153.0184，85.0296 C27H30O15 山柰酚-3-O-芸香糖苷[20] 6.95（－1.51）6.95（－0.67）6.97（－1.51）14 465.1028303.0498，285.0410，229.0497 C21H20O12 异槲皮苷[15] 7.01（－1.08）7.06（－1.51）7.05（－1.51）15 625.1763479.2037，317.0654，302.0420 C28H32O16 水仙苷[13] 7.29（－0.96）7.32（－0.32）7.32（－0.48）16 517.1341355.1515，163.0389，135.0441 C25H24O12 二咖啡酰奎尼酸或其同分异构体[20] － 7.48（－0.19）7.43（0.19）17 479.1184317.0653，302.0419，153.0181 C22H22O12 异鼠李素-3-O-葡萄糖苷[15] 7.50（－1.46）7.59（－2.09）7.64（－0.42）18 355.1016377.0844，163.0391，135.0442 C16H18O9 隐绿原酸[16] 7.71（0.00） 7.74（0.00） 7.75（－2.54）19 179.0339135.0438，119.0493，105.0702 C9H6O4 6，7-二羟基香豆素[13] － 7.76（0.00） －20 146.0600118.0654，117.0571，91.0547 C9H7NO 4-甲酰基吲哚[14] 7.94（－1.37）7.95（－0.68）7.95（－0.68）21 317.0652302.0420，285.0391，168.0054 C16H12O7 茵陈色原酮[13] 7.98（－0.95）8.03（－0.95）7.98（－1.63）22 593.1865477.0523，447.1283，285.0755 C28H32O14 genkwanin-4’-O-glucosy-Rhamnoside[19]8.67（－0.51）8.67（－1.52）8.7（－2.87）23 285.0758270.0523，242.0547，229.1225，153.0109 C16H12O5 芫花素[21] － 11.54（0.35） 11.53（0.70）

续表1

No.理论值（m/z） 碎片离子（m/z） 分子式 化合物名 tR（error）/min（×10－6）茵陈 艾叶 藏龙蒿24 149.1325131.0856，121.1014，107.0860 C11H16 Carvacrol或其同分异构体[14] 12.91（0.00） 12.91（0.00） 12.91（－0.67）25 279.231995.0860，119.0860，105.0703 C18H30O2 亚麻酸或其同分异构体[13] 14.63（2.15） 14.65（0.00） 14.68（2.15）26 135.1168107.0859，105.0703，91.0548 C10H14 p-Cymene[19] － － 20.06（－0.74）

表2 3种植物中化学成分的UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS负离子鉴定结果
Tab 2 Identified chemical constituents of Artemisiae scopariae herba，Artemisiae argyifoliumand Artemisia waltonii by UHPLC-QExactive-Orbitrap-MS in negative ion mode

No.理论值（m/z） 碎片离子（m/z） 分子式 化合物名 tR（error）/min（×10－6）茵陈 艾叶 藏龙蒿1 191.0561191.0558，93.0335，87.0077 C7H12O6 奎宁酸[18] 1.23（2.09） 1.23（2.09） 1.22（1.57）2 353.0878191.0558，179.0347，173.0454，135.0442，85.0284 C16H18O9新绿原酸[14] 3.35（－4.25）3.36（－3.97） －3 593.1512593.1528，473.1101，383.0783，353.0677，325.0727，297.0774 C27H30O15apigenin-6，8-Di-C-hexoside[19] 6.03（－2.70）5.98（－4.72）6.07（0.84）4 353.0878191.0558，179.0351，173.0088，161.0244，135.0444 C16H18O9绿原酸[14] 6.13（－4.25）6.14（－3.97）6.11（0.28）5 367.1034193.0504，191.0558，173.0452 C17H20O95-freuoylquinicacid[13] 6.54（－2.72）6.55（－1.91）6.54（－2.18）6 153.0193109.0286，91.0179，65.0385 C7H6O4 原儿茶酸[18] 6.83（3.92） － －7 431.0984341.0676，311.0569，283.0618，269.0466，161.0240 C21H20O10牡荆素[14] 6.97（－2.09） － －8 463.0882301.0355，300.0283，271.0257 C21H20O12quercetin-3-O-glucoside[21] 6.98（－2.38）6.90（－2.59）7.07（－3.89）9 461.0725341.0669，298.0495，285.0410 C21H18O12luteolin-7-glycuronicacid[15] － 7.15（－2.60） －10 593.1501593.1525，285.0410，284.0333 C20H34O20kaempferol-3-O-rhamnosyhexose[21]7.24（－3.71） － 7.24（－4.05）11 515.1195353.0892，191.0558，179.0346，161.0238，135.0444 C25H24O12异绿原酸b[17] 7.38（－1.36）7.33（－0.97）7.43（－1.55）12 353.0878191.0558，179.0345，173.0452，161.0237，135.0443 C16H18O9隐绿原酸[17] 7.47（－4.25）7.47（－1.98）7.49（－0.85）13 515.1196353.0884，191.0558，179.0346，173.0451，135.0444 C25H24O12异绿原酸a[21] 7.64（－1.36）7.67（－0.39）7.70（－1.55）14 529.1563179.0347，161.0293，135.0443 C23H30O143-caffeoyl-5-feruoylquicinicacid[16] － － 7.79（－1.32）15 187.0976143.1071，125.0963，97.0648，83.0491 C9H16O4 壬二酸[19] 8.04（1.60） － 8.04（2.14）16 515.1197353.0884，191.0557，179.0345，173.0450，161.0238，135.0443 C25H24O12异绿原酸c[13] 8.19（－1.36）8.20（－1.16）8.20（－1.55）17 677.1512515.1190，353.0886，191.0557，135.0443 C34H30O153，4，5-三咖啡酸奎宁酸[13] 8.64（－1.51） － 8.65（－2.66）18 287.0561151.0038，135.0443，107.0128 C15H12O6eriodictyolchalcone[19] － 8.88（－1.39） －19 345.0616330.0388，315.0147，287.0196，271.0243，165.9898 C17H14O85，7，3’，5’-tetrahydroxy-6，4’-dimethoxyflavone[14]－8.96（－1.74） －20 345.0616330.0387，315.0152，287.0201，259.0252，136.9871 C17H14O85，7，4’，5’-tetrahydroxy-6，3’-dimethoxyflavone[16]－9.28（－3.19）9.30（－1.74）21 329.0667314.0436，299.0201，271.0252 C17H14O7棕矢车菊素[21] － 9.90（－1.52）9.91（0.00）22 343.0823328.0595，313.0362，298.0125 C18H16O7异泽兰黄素[13] 10.99（0.87） 11.00（－1.46）10.98（－1.75）

3.1 有机酸类化合物

3种植物中均含有大量的有机酸类化合物，经数据库相关数据比对，发现负离子模式下化合物2、4、12为绿原酸及其同分异构体，经本课题前期工作及大量文献验证，化合物2、4、12分别为新绿原酸，绿原酸及隐绿原酸。隐绿原酸由一分子的奎尼酸和一分子的咖啡酸酯化生成，一级质谱结果显示，在负离子模式下准分子离子

m/z

353.0878 [M-H]，二级碎片离子信息为

m/z

191.0558、179.0345、173.0452、161.0237、135.0443，其裂解途径为酯键断裂得到奎尼酸碎片离子峰

m/z

191.0558 [M-CHO-H]以及咖啡酸碎片离子峰

m/z

179.0345 [M-CHO-H]，奎尼酸继续脱去一分子HO生成

m/z

173.0452[M-CHO-HO-H]，而咖啡酸继续脱去CO得到碎片离子

m/z

135.0443 [M-CHO-CO-H]，其可能的裂解途径见图4。

图4 隐绿原酸的裂解途径Fig 4 Fragmentation pathways of cryptochlorogenic acid

茵陈、藏龙蒿共有的化合物壬二酸是一种有机酸化合物，分子式为CHO，其在负离子模式下准分子离子峰

m/z

187.0976 [M-H]峰强高达1.24×10，二级质谱图中所显示的碎片分别为

m/z

143.1071、125.0963、97.0684、83.0491，推测其裂解途径为化合物先脱去一分子CO，生成

m/z

143.1071 [M-CO-H]，再脱去一分子HO生成

m/z

125.0963 [M-HO-CO-H]，进而脱去甲基生成

m/z

97.0684 [M-CH-HO-CO-H]以及

m/z

83.0491 [M-CH-HO-CO-H]。其可能的裂解途径见图5。

图5 壬二酸的裂解途径Fig 5 Fragmentation pathways of azelaic acid

3.2 黄酮类化合物

金丝桃苷是一种黄酮醇类化合物，是3种植物的共有化合物，与异槲皮素苷互为同分异构体，结合数据库与相关文献及两峰保留时间，确定正离子模式下化合物10为金丝桃苷，化合物14为异槲皮苷。金丝桃苷在正离子模式下，准分子离子峰为

m/z

465.1028，其二级碎片离子信息为

m/z

303.0498、285.0389。推测其裂解途径为准分子离子

m/z

465.1034 [M+H]失去一个半乳糖，得到碎片离子

m/z

303.0498 [M-CHO+H]，再失去一个羟基得到碎片离子

m/z

285.0389[M-CHO-OH+H]，其可能的裂解途径见图6。

图6 金丝桃苷的裂解途径Fig 6 Fragmentation pathways of hyperoside

从3种植物中均鉴定出异泽兰黄素，该化合物二级质谱主要丢失-CH，-OCH等基团。负离子模式中的化合物22准分子离子峰为

m/z

343.0823，其脱去一分子的-CH生成碎片离子

m/z

328.0595 [M-CH-H]，再脱去一分子-OCH则生成碎片离子

m/z

298.0125 [M-CH-OCH-H]。同时，该化合物还可以直接脱去一分子-OCH生成 [M-OCH-H]，其裂解途径见图7。

图7 异泽兰黄素的裂解途径Fig 7 Fragmentation pathways of isozelanthin

茵陈特有的牡荆素，其在正离子模式下的准分子离子峰为

m/z

433.1129，该化合物有3种裂解方向，其一为A环上所连接的葡萄糖苷发生裂解，生成碎片

m/z

313.0706 [M-CHO+H]，再脱去一分子羰基生成黄酮苄基离子

m/z

283.0601[M-CHO-CHO+H]，黄 酮B环 发 生RDA裂解，裂解为

m/z

119.0494，165.0184两个碎片离子。其二为化合物连续脱掉三分子水，分别生成碎 片

m/z

415.1017，397.0920以 及379.0811。其三为化合物B环所连接的糖被破坏生成碎片

m/z

337.0704 [M-CHO+H]，进而失去一个亚甲基生成碎片

m/z

323.0912[M-CHO-CH+H]。其裂解途径见图8。

图8 牡荆素的裂解途径Fig 8 Fragmentation pathways of vitexin

本研究从3种蒿属植物中共鉴定出45种化学成分，其中3种植物的共有成分有23种，包括绿原酸、异泽兰黄素、金丝桃苷等化合物。茵陈特有成分3种（对香豆酸、原儿茶酸、牡荆素），艾叶特有成分6种（阿魏酰奎宁酸、7，8-二羟基香豆素、6，7-二羟基香豆素、luteolin-7-glycuronic acid、eriodictyol chalcone、5，7，3’，5’-tetrahydroxy-6，4’-dimethoxyflavone），藏龙蒿特有成分3种（quercetin-3-

O

-robinoside、

p-

cymene、3-caffeoyl-5-feruoylquicinic acid）。3种蒿属植物虽为同属，但其基原不同，成分也不相同。茵陈特有成分对香豆酸可以增加细菌膜外的渗透性，有利于药物通过细胞膜进入内部，以增强药物抗菌作用。近期，有学者证实茵陈与艾叶共有成分6，7-二甲氧基香豆素对苯丙氨酸代谢路径中的苯丙氨酸羟化酶、氨基酸氧化酶及酪氨酸转氨酶的活性具有调节作用，从而干预酒精诱导的原代肝细胞损伤，可能是两种蒿属植物发挥保肝利胆功效的物质基础。茵陈色原酮为3种蒿属植物所共有成分，有研究发现，茵陈色原酮可以通过提高体内肝细胞乙醛脱氢酶（ALDH）水平，提升肝脏将乙醛降解为乙酸的能力，对急性肝损伤具有良好的保护作用。同时，茵陈色原酮可以通过抑制MyD88和TIRAP介导的Akt、脂多糖（LPS）诱导的核因子

κ

B（NF-

κ

B）和促分裂原活化的蛋白激酶（MAP）激活的炎症基因的表达来发挥抗炎作用。

本试验采用UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技术建立了一种快速区别茵陈、艾叶与藏龙蒿的方法，与传统的色谱方法相比，本方法虽然受提取方法及质谱检测限的限制而无法鉴别出更多的化合物，但其用时更短，对碎片离子具有更高的准确性，更强的灵敏度，常用于中药或复杂物质中化合物的鉴定、筛选及定量分析，该法可为3种蒿属植物的鉴别研究及质量标准的建立提供参考，同时也为更多蒿属植物的开发以及药源植物的拓展提供了思路。

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