抗HIV药物齐夫多定、拉夫米定和克力芝联合用药的急性经口毒性和致突变作用

时间：2022-11-18 12:05:03　来源：柠檬阅读网本文已影响人

葛宪民，李彬，黄超培*，高玉秋，罗海兰，杨慧，王彦武，温平镜，蓝光华，陈欢欢，孟琴，罗柳红，邓月琴，刘帅凤，吴秀玲

（广西壮族自治区疾病预防控制中心，广西南宁 530028）

感染人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的育龄妇女可以在妊娠、分娩和哺乳阶段将HIV传播给婴儿，这种母婴传播是导致我国近年15岁以下儿童感染HIV的主要原因。因此，采取有效措施阻断HIV母婴传播（prevention of mother-to-child transmission，PMTCT）是控制HIV感染进一步扩散蔓延的关键。目前，以高效抗反转录病毒药物联合治疗的干预措施，已经可使HIV母婴垂直传播率大幅降低，阻断效果显著；
但在服药过程中会出现一些药物的不良反应，如消化系统症状、肝肾毒性、骨髓抑制、高脂血症和皮疹等。为了评价抗HIV联合用药的安全性，本文对抗HIV PMTCT的常用联合药物方案进行急性毒性和遗传毒性研究。

1.1 受试物及处理

选择目前较常用的抗HIV PMTCT用药方案的联合药物，齐夫多定（zivdodine，AZT）、拉米夫定（lamivudine，3TC）和克力芝（kaletra，LPV/r）作为研究对象，3种药均为片剂，其中AZT规格为520 mg/片（批号为AM18029），3TC为618 mg/片（批号为AZ19011），两者每片的有效成分含量均为300 mg，均为上海迪赛诺生物医药有限公司产品。LPV/r由德国AbbVie Deutschland GmbH&Co.KG公司生产，规格为1 250 mg/片（批号为1104498），每片含洛匹那韦200 mg和利托那韦50 mg。每日推荐孕产妇服用量为：AZT 2片+3TC 1片+LPV/r 2片，3种药品的有效成分摄入量合计1 400 mg，按体质量60 kg计算，折合剂量为23.3 mg/kg。试验前，按上述比例将3种药片混在一起，粉碎成粉末（有效成分含量为33.67%），密封保存备用，临用前用纯水配成需要的浓度。

1.2 试验动物与菌株

SPF级健康成年昆明种小鼠，由广西医科大学实验动物中心繁殖，动物生产许可证号：SCXK（桂）2014-0002，合格证号：45000300000932/958。动物饲料由广东省医学实验动物中心生产，许可证号：SCXK（粤）2013-0002。动物房为屏障系统，使用许可证号：SYXK（桂）2016-0002。动物实验室温度为22～25℃，相对湿度55%～70%。鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535共5种菌株均购于美国MOLTOX公司，贮存于4℃冰箱，使用前经生物特性鉴定符合试验要求。

1.3 代谢活化系统及阳性物

肝微粒体酶S购自瑞德肝脏疾病研究（上海）有限公司，贮存于-70℃液氮中。阳性对照物2-氨基芴购自国药集团化学试剂有限公司，敌克松购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，柔毛霉素购自加拿大TRC。

1.4 试验方法

1.4.1 急性经口毒性试验

采用最大给药量法，选体质量为18～22 g的昆明种成年小鼠20只，雌、雄性各10只，试验前禁食16 h，不限饮水。用纯水将联合药物混合配成有效成分浓度为250 mg/mL的混悬液，然后按0.02 mL/g给小鼠灌胃1次，剂量为5 000 mg/kg（有效成分），灌胃后观察、记录小鼠的中毒表现和死亡情况，观察14 d。

1.4.2 细菌回复突变试验

采用平板掺入法，设50、158、500、1 581、5 000μg/皿（有效成分）5个剂量组，同时设自发回变对照（不加受试物）、阴性对照（纯水）和阳性突变剂对照。用纯水将联合药物配成相应浓度的混悬液，经过高压灭菌（0.103 MPa作用20 min）处理后供试验用。将试验菌株增菌液0.1 mL、受试溶液0.1 mL（需代谢活化者再加入10%S混合液0.5 mL）依次加入保温的顶层培养基试管内，混匀后倒入底层培养基平板上，迅速均匀铺开。每个剂量组的每种菌株设3个平行皿，在37℃恒温培养48 h，计数每皿的回变菌落数并计算每组平均菌落数。当受试物回变菌落数超过自发回变菌落数的2倍并存在剂量-反应关系者为阳性结果。重复试验1次。

1.4.3 哺乳动物体内微核试验

采用30 h两次给受试物法，间隔24 h。设3个剂量组，分别设为500、1 000、2 000 mg/kg（有效成分），1个阴性对照组（等体积的纯水）和1个阳性对照组（2 mg/mL环磷酰胺溶液）。每组10只小鼠，雌、雄性各半。用纯水将联合药物分别配成有效成分浓度为25、50、100 mg/mL的混悬液，按0.02 mL/g分别给予试验组动物灌胃。第2次给受试物后20 h处死动物，取股骨骨髓用小牛血清稀释涂片，经甲醇固定和Giemsa染色后在显微镜下观察，每只动物计数2 000个嗜多染红细胞（polychromatic erythrocyte，PCE），微核率以含微核的PCE千分率表示。同时每只小鼠观察200个嗜多染红细胞，计算嗜多染红细胞与成熟红细胞（normochromatic erythrocyte，NCE）的比值PCE/NCE。

1.4.4 哺乳动物精原细胞染色体畸变试验

分组设计和处理同1.4.3。2 000 mg/kg剂量组10只雄性小鼠，其余组均为5只雄性小鼠，仅给药1次。给予受试物后20 h，每组各取5只小鼠，按0.01 mL/g腹腔注射0.5 mg/mL的秋水仙素；
给予受试物后44 h，以相同方法给2 000 mg/kg剂量组另5只动物注射秋水仙素。在注射秋水仙素4 h后，用颈椎脱臼法处死动物，取两侧睾丸。将睾丸放在1%柠檬酸三钠中分离曲细精管，之后在甲醇/冰乙酸（3∶1，

V/V

）固定液中固定2次，在60%冰乙酸中软化并打匀离心。将收集到的细胞混悬液滴于冰水冷却的玻片上，制成2～3张片，经Giemsa染色后在光学显微镜下镜检。每只动物计数100个中期分裂相细胞，观察精原细胞染色体数目和结构改变，记录含染色体结构畸变的细胞数，统计各组不同类型的染色体结构畸变数目和频率（染色体裂隙不计入畸变率）。

1.5 统计学方法

应用SPSS 17.0统计软件，微核试验中数据按Poisson分布的两样本均数比较法进行统计分析；
染色体畸变试验采用

检验进行分析。

2.1 急性经口毒性试验

给予5 000 mg/kg的联合药物后，小鼠的饮食和活动正常，14 d观察期间小鼠的体质量增长未受到明显影响，未见中毒体征和死亡，试验结束解剖小鼠，肉眼观察主要器官组织未见异常病变，联合药物对小鼠的急性经口毒性LD大于5 000 mg/kg。

2.2 细菌回复突变试验

在加和不加S代谢活化系统的两种条件下，各试验菌株阳性对照组的回变菌落数均远超自发回变菌落数的2倍，试验体系可靠。联合药物各剂量组5种试验菌株的回变菌落数与自发回变菌落数及阴性对照组的回变菌落数接近，且不存在剂量-反应关系，见表1。重复试验的结果也与其一致，表明该联合药物未诱发试验菌株基因突变。

表1 联合药物的细菌回复突变试验结果（±s，n=3）

2.3 体内微核试验

从表2可见，阳性对照组的微核率均高于阴性对照组（

P＜

0.01），各组的PCE/NCE值均在正常值（0.6～1.2）范围且差异无统计学意义（

P＞

0.05），表明在本试验剂量范围未出现骨髓抑制作用，试验体系可靠。联合药物各剂量组的微核率均高于阴性对照组，差异有统计学意义（

P＜

0.01），试验结果为阳性。

表2 联合药物对小鼠骨髓细胞微核的影响

2.4 精原细胞染色体畸变试验

结果见表3。阳性对照组可见染色体断裂、断片、微小体、环形等改变，染色体畸变细胞率显著高于阴性对照组（

＜0.01），表明试验体系可靠。联合药物各剂量组小鼠的精原细胞染色体的多倍体数目和染色体畸变类型（断裂和裂隙），及畸变细胞率（畸变细胞数/观察细胞数×100%）与阴性对照组比较，差异均无统计学意义（

＞0.05）。

表3 联合药物对小鼠精原细胞染色体畸变率的影响（n=500）

抗病毒药物联合治疗是我国目前实行免费治疗使用的HIV PMTCT治疗方案，实行多年以来，已经明显降低HIV的母婴传播率，但不时有服药后引起不良反应的报道，如胃肠道反应、疲乏、肝和肾脏毒性、骨髓抑制、皮疹等。为了评价联合药物AZT+3TC+LPV/r的安全性，本研究对该联合药物的急性毒性进行检测，并采用体外细菌回复突变试验、哺乳动物体内骨髓细胞微核试验和精原细胞染色体畸变试验，研究该联合药物的致突变性。

在给予该联合药物后，小鼠未出现中毒体征和死亡，小鼠的急性经口毒性LD大于5 000 mg/kg，表明联合药物无急性经口毒性作用。体外试验，在加和不加S代谢活化系统两种条件下，该联合药物5个剂量组的5种试验菌株的回变菌落数与自发回变的菌落数相接近，回复突变试验结果为阴性。该联合药物3个剂量组雌、雄性动物的微核细胞率在4.4‰～5.2‰之间，与阴性对照组比较差异均有统计学意义（

＜0.01），并高出本实验室的正常本底值（0.4‰～3.6‰），为阳性试验结果，但试验检测结果显示微核率与阴性对照组的微核率上限值5‰很接近，故其毒理学意义尚不确定。本试验未观察到受试物对骨髓的抑制作用（PCE/NCE比值未降低），与临床观察到的骨髓抑制不良反应不一致，原因可能与用药时间、剂量不同及种属间敏感性差异等因素有关。微核率增高通常是受到染色体断裂剂作用的结果，而骨髓抑制是化疗药物对骨髓的毒性反应，两者产生的机制不同，后者一般对粒细胞系影响最大，其次为血小板，而红细胞系由于半衰期长，所以影响不明显。该联合药物3个剂量组的精原细胞畸变细胞率与阴性对照组比较未见明显增高，试验结果为阴性。

综上结果，联合药物AZT+3TC+LPV/r无急性经口毒性作用，体外细菌回复突变试验和小鼠精原细胞染色体畸变试验结果均为阴性，而骨髓细胞微核试验结果为阳性，该联合药物的致突变性有待进一步探讨和验证。