脑梗死复发患者血小板活化及阿司匹林抵抗研究 阿司匹林肠溶片的作用

　　[摘要] 目的 探讨在脑梗死复发的治疗中血小板白细胞聚集体（PLA）、血小板聚集和阿司匹林抵抗（AR）的重要作用。 方法 在入院当天对58例复发组脑梗死患者和116例初发组脑梗死患者采用1∶2配对法，对其血小板聚集率和PLA水平进行测定。每晚开始顿服拜阿司匹林200 mg，连续顿服7～10 d后，通过再次测量患者的血小板聚集率，挑选出具有阿司匹林抵抗的患者。 结果 在入院当天的血小板聚集率测定结果和PLA水平均表现为复发组高于初发组患者，在持续顿服7～10 d的拜阿司匹林后，阿司匹林抵抗发生率也表现为复发组高于初发组患者，差异均有统计学意义（P ＜ 0.05）。 结论 阿司匹林抵抗和血小板活化在脑梗死复发过程中可能起着重要作用，可能是脑梗死复发的重要危险因素之一。因此在脑梗死患者的二级预防中服用阿司匹林期间有必要进行血小板聚集率的检查，尽早发现和识别AR，及时调整二级预防策略。
　　[关键词] 阿司匹林抵抗；血小板活化；血小板白细胞聚集体；脑梗死；复发
　　[中图分类号] R743.3[文献标识码] B[文章编号] 1673-9701（2012）10-0053-03
　　The study of platelet activation and aspirin resistance in patients with recurrent cerebral infarction
　　PAN Xiaoyun1 YI Xingyang2 CHI Lifen2 PAN Jibao3
　　1.Department of Internal Medicine, Ruian Hospital of Traditional Chinese Medicine, Ruian 325200, China; 2.Department of Neurology, Ruian People’s Hospital, Ruian 325200, China; 3.Department of Laboratory, Ruian People’s Hospital, Ruian 325200, China
　　[Abstract] Objective To investigate roles of platelet-leukocyte aggregation, platelet aggregation and aspirin resistance in patients with recurrent cerebral infarction. Methods The platelet aggregation rate and the levels of PLA were performed in 58 patients with recurrent cerebral infarction and 116 patients with the first onset of cerebral infarction on the first day of admission, then aspirin tablets 200 mg were taken by patients every night. The platelet aggregation rate was performed again after 7-10 days, and the patients of aspirin resistance were screened. Results The platelet aggregation rate and the levels of PLA in patients with recurrent cerebral infarction were significantly higher than those of patients with first onset of cerebral infarction. The incidence of aspirin resistance in patients with recurrent cerebral infarction was significantly higher than that of patients with first onset of cerebral infarction (P ＜ 0.05). Conclusion Aspirin resistance and platelet activation may play an important role in the process of recurrence of cerebral infarction, and may be important risk factors for recurrence of cerebral infarction, so it is necessary to check the platelet aggregation rate in patients with cerebral infarction during taking aspirin for the secondary prevention, to find and identify AR earlier, and adjust secondary prevention strategies.
　　[Key words] Aspirin resistance; Activation of platelet; Platelet-leukocyte aggregation; Cerebral infarction; Recurrence
　　脑梗死是一种发病率、致残率很高的疾病，严重影响人类健康并且复发率高，每年约有4%～14%患者复发，早期复发率达30%，脑梗死复发者预后往往不良。作为一种有效的抗血小板聚集药，阿司匹林广泛应用于心脑血管事件的二级预防及某些经过选择的患者的一级预防，但长期服用仍有可能发生动脉血栓形成事件。本文采用1∶2配对方法，对入住我院及瑞安市人民医院的58例复发脑梗死患者和116例初发脑梗死患者的血小板聚集、血小板白细胞聚集体（PLA）进行检测，从实验室中探讨血小板活化和阿司匹林抵抗在脑梗死复发中的重要作用。
　　1资料与方法
　　1.1 研究对象
　　1.1.1 复发脑梗死组因再次发生脑梗死在48 h内入住我院及瑞安市人民医院的患者。入选标准：①既往有脑梗死病史；②新出现神经功能缺损症状；③初发症状、体征加重，且排除进展性卒中；④上述情况均经头颅CT或MRI证实。排除标准：①心源性脑栓塞患者；②近1周内使用过氯吡格雷、传统非甾体抗炎药（除阿司匹林以外）、华法令、低分子肝素等影响血小板聚集功能的药物；③有出血疾病史，包括家族或个人；④短期内有严重外伤或者进行较大外科手术的患者；⑤血小板计数＜100×109/L或＞450×109/L的患者；⑥患有骨髓增生异常综合征的患者。经筛选后共有58例患者入选，其中男36例，女22例，年龄43～88岁，平均（73.64±8.54）岁。有51例患者为复发1次，7例患者为复发2次及以上。
　　1.1.2 初发脑梗死组脑梗死患者首次发病在48 h内入住本院及瑞安市人民医院进行治疗，患者经过CT和/或MRI检验，全部脑梗死病例的诊断结果均符合全国第五届脑血管病学术会议修订的诊断标准。初犯脑梗死的患者入院标准同1.1.1中复发脑梗死患者筛选标准一致。两组采用2∶1配对方法对患者进行筛选，与复发性脑梗死患者区别，确定患者同期住院（±1周）、年龄（＜2岁）、病情的严重程度以神经功能缺损程度为主、NIHSS评分＜5分的为主，患者均有糖尿病、TIA史、高血压、吸烟等相同的危险因素，共116例，其中男72例，女44例，年龄43～89岁，平均（73.58±9.42）岁。
　　1.1.3 对照组选择同期无心、脑、肝、肾疾病的健康体检者42名（男24名，女18名），年龄41～82岁，平均（70.8±11.8）岁。排除标准同上述两组。
　　1.2 危险因素判定
　　对入组患者详细了解年龄、性别、高血压、冠心病、糖尿病、TIA史、酗酒、吸烟等相关危险因素，并于入院次日晨采空腹静脉血检测血糖、血脂水平。
　　1.3 血小板聚集率测定
　　1.3.1 仪器与试剂PACKS-4型四通道血小板聚集仪及诱导剂（美国Helena公司），诱导剂分别为二磷酸腺苷（ADP，Helena公司）5.0 μmol/L、花生四烯酸（AA，Helena公司）500 μg/mL。
　　1.3.2 血小板聚集率测定方法入组患者于入院当天及第7～10天抽肘前静脉血，在抽血时尽量避免与玻璃器皿接触，抽取6 mL静脉血注入含3.8%枸橼酸钠660 μL的试管中，经过3次倒置混匀后立即送检。以1000 r/min的速度对抽取的新鲜血标本离心10 min，得到富含血小板血浆提取物（platelet-rich plasma，PRP）。将PRP调节到（200～300）×109/L，以4000 r/min再对剩余血液离心10 min，制备出乏血小板血浆（platelet-prro plasma，PPP），将PPP血小板计数调整到（10～20）×109/L。分别取出两只比浊管，将PRP 225 μL和PPP 250 μL分别加入，在血小板聚集仪中分别将PRP和PPP的透光度调节为90和10。再将比浊管置于37℃温浴3～5 min后，分别将25 μL AA和10 μL ADP加入到PRP中，使两者的最终浓度分别为0.5 mg/mL和10 μmol/L，记录最大血小板聚集率（maximum platelet aggregation rate，MAR），整个测定时间在3 h内完成。
　　1.3.3 阿司匹林抵抗的判断入院当天开始服用拜阿司匹林（拜耳公司提供，国药准字J20080078）200 mg，每晚顿服，连续服用7～10 d后分别以AA和ADP作为诱导剂测定血小板聚集率。符合下述两项标准者称为阿司匹林抵抗：在0.5 mg/mL AA浓度下MAR≥20%；在10 μmol/L ADP浓度下MAR≥70%。
　　1.4 PLA检测
　　1.4.1 仪器及试剂FC 500 MPC型流式细胞仪及Q-PREP溶血仪（美国Beckman Coulter公司产品），用MPX cytometer软件处理数据。鼠抗人CD41-FITC、同型对照IgG1-FITC、鼠抗人CD45-PC5（美国Coulter Immunotech公司产品）。
　　1.4.2 血液标本采集采血时不能用压脉带，且弃开始2 mL血，以免因穿刺引起血小板活化而影响结果。
　　1.4.3 PLA的检测方法入组者在入院当天在肘静脉采血3 mL放入EDTA-K2抗凝血试管中，标本采血后2 h内检测。取试管2支，一管加入CD45-PC5 5 μL、CD41-FITC 10 μL，另一管加入CD45-PC5 5 μL、IgG1-FITC 10 μL，分别加入100 μL EDTA-K2抗凝全血混匀，室温暗处孵育15 min后在Q-PREP溶血仪上溶血，加入1 μL PBS缓冲液混匀，2 500 r/min离心5 min后弃上清夜，加入1 μL PBS液混匀后在流式细胞仪上检测。使用CD45-PC5/SSC设门，将外周血白细胞分为中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞三群细胞，调整非特异性结合在0.8%～1.5%，分别记录血小板粒细胞聚集体（PNA）、血小板单核细胞聚集体（PMA）、血小板淋巴细胞聚集体（PLyA）和PLA。
　　1.5 统计学处理
　　使用SPSS 16.0软件进行分析。计数资料以率表示，进行χ2检验，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，进行t检验、方差分析及q检验，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。
　　
　　2 结果
　　2.1 两组患者一般情况和危险因素比较
　　两组患者在年龄、性别、高血压病、糖尿病、TIA病史、吸烟、酗酒以及入院时的血糖、血脂、神经功能缺损程度等方面比较，差异均无统计学意义（P ＞ 0.05），具有可比性。见表1。
　　
　　表1 两组患者一般情况和危险因素比较
　　
　　
　　
　　
　　
　　
　　
　　
　　
　　
　　
　　
　　 注：两组比较差异均无统计学意义（P ＞ 0.05）
　　
　　2.2 两组患者血小板聚集率和阿司匹林抵抗发生率比较
　　复发组患者在入院当天测定的血小板聚集率和PLA水平均高于初发组患者，在持续顿服7～10 d的拜阿司匹林后，阿司匹林抵抗发生率也表现为复发组高于初发组患者，差异均有统计学意义（P ＜ 0.05）。见表2。
　　2.3 两组患者PLA比较
　　两组患者入院时PLA、PMA、PNA、PLyA表达均明显高于对照组，复发组患者又高于初发组患者，差异均有统计学意义（P ＜ 0.05）。见表3。
　　表3 复发性脑梗死患者和初发脑梗死患者及对照者PLA比较（x±s，%）
　　
　　
　　
　　
　　
　　 注：#与初发组比较，P ＜ 0.05；*与对照组比较，P ＜ 0.05
　　
　　3 讨论
　　3.1 血小板活化在脑梗死和脑梗死复发中的作用
　　在急性缺血性脑血管病的发生发展过程中动脉粥样硬化和血栓形成起着重要作用，而血小板活化是动脉粥样硬化和血栓形成的主要机制[1]。Htun P等[2]研究发现，脑梗死患者3个月后CD62P表达处于较高状态，提示血小板活化在脑梗死复发中起着重要作用。目前检测血小板活化的指标较多，如血小板聚集率、P-选择素等。近年来血小板白细胞聚集体（PLA）的研究越来越引起众多学者的关注。Michelson AD等[3]研究表明外周血中PLA特别是PMA与P-选择素相比是血小板活化更加敏感的指标。流式细胞术技术的应用为评价血小板在体内活化程度提供了可靠方法[4]。本研究结果显示：入院时初发脑梗死和复发性脑梗死患者血小板聚集率和PLA均明显高于对照组，复发性脑梗死患者又高于初发脑梗死患者，提示血小板活化在脑梗死的发病和脑梗死复发中可能发挥重要作用。说明复发性脑梗死患者的血小板处于较高的活化状态，这与Htun P等报道结果相符。脑动脉硬化、血管内皮损伤、胶原暴露使血小板黏附，同时血管内皮造成局部血流动力学改变，产生高切变力以及脂肪斑块破溃，使血小板活化[5]。血小板和白细胞活化后，其表面的黏附分子表达增加，黏附分子与配体相互结合和（或）通过纤维蛋白原在黏附分子之间的桥接作用形成PLA。PLA形成后，通过血小板的桥接作用，促使白细胞与局部损伤内皮细胞处黏附、滚动和渗出，进入内皮细胞下，促使内膜炎症、动脉粥样硬化和附壁血栓形成的发生发展[6]。另外PLA形成的微血栓可以阻塞小血管，并释放多种炎性介质和细胞因子，在脑的缺血/再灌注损伤中起重要作用，因而在脑梗死复发中也可能发挥重要作用。
　　3.2 阿司匹林抵抗与脑梗死的复发
　　20世纪60年代以后发现阿司匹林有较好的抗血栓作用而被广泛用于脑梗死的预防。阿司匹林凭借着其潜在的抗动脉粥样硬化能力仍然是临床上对于血管事件一级预防和二级预防的首选治疗用药。阿司匹林用于抗血小板聚集的作用机制是使环氧化酶-1（COX-1）的活性部位丝氨酸-529不可逆乙酰化，从而导致COX-1永久失活，减少血小板中血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）的生成从而抑制血小板活化和聚集。然而阿司匹林的抗血小板作用存在着个体差异。在口服常规剂量阿司匹林的患者中，有部分患者无明显疗效，仍发生血栓栓塞事件，这些患者可能存在阿司匹林抵抗（aspirin resistance，AR）。Bennett D等[7]研究提到阿司匹林抵抗是复发性心肌梗死的重要危险因素，至于其是否为脑梗死复发的危险因素还缺乏证据。这方面的研究国内外均报道少。
　　本研究发现，服用拜阿司匹林7～10 d后复发性脑梗死患者阿司匹林抵抗发生率明显高于初发患者。上述结果提示：阿司匹林抵抗在脑梗死复发过程中可能起着重要作用，可能是脑梗死复发的重要危险因素之一。目前AR发生的确切机制尚未完全明了，可能与下列因素相关：①对血小板环氧化酶-1（COX-1）的抑制减弱：实验证明小剂量（50～325 mg）阿司匹林即可阻滞95%的血小板COX-1活性，达到防治目的，而有些患者在服用大剂量（＞1000 mg）阿司匹林后仍为“抵抗”，效果也往往很不理想[8]。②非甾体抗炎药的影响：非甾体抗炎药与COX-1的某些部位有较强的亲和力，与阿司匹林竞争性结合COX-1，使阿司匹林不能乙酰化COX-1。现已证明，非甾体消炎药中的布洛芬、吲哚美辛、萘普生、噻洛芬酸能阻断阿司匹林的抗血小板效应，导致继发性阿司匹林抵抗[9]。③不同的个体之间可能存在COX-1基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）现象，这种多态性可影响COX-1蛋白结构，改变阿司匹林作用活化位点的结构，从而阻碍阿司匹林的乙酰化作用，使其对阿司匹林产生的抑制效果敏感性极不均一。这可能是某些患者产生阿司匹林抵抗的结构学基础。④COX-2为诱导型环氧化酶，主要存在于单核细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞中，在被阿司匹林抑制后很快被诱导合成，从而诱导血小板聚集。不同患者的血小板COX-2表达程度不同，当有炎症刺激时，COX-2在有核细胞中的表达可增强10～20倍，而阿司匹林对COX-2的抑制作用比COX-1低170倍。这些提示，在动脉粥样硬化等炎症过程中，COX-2过度表达可能是阿司匹林抵抗的原因之一[10]。⑤血小板GpⅡb/Ⅲa、GpⅠa、GpⅠb的基因多态性及吸烟、糖尿病、高脂血症、应激等各种因素均会影响到血小板的聚集率，与阿司匹林抵抗相关。
　　有研究表明阿司匹林抵抗患者的死亡、心肌梗死或缺血性卒中风险是阿司匹林敏感者的3倍[11]。因此在脑梗死患者的二级预防中服用阿司匹林期间有必要进行血小板聚集率的检查，尽早发现和识别AR，及时调整二级预防策略。对阿司匹林有抵抗患者如何处理目前尚无明显有效的特异性治疗策略。可能有效的治疗方法：①增大阿司匹林剂量：有研究表明，增加阿司匹林的剂量不能改善所有阿司匹林抵抗，相反，剂量增大可能会增高继发性出血和胃肠道溃疡等不良反应发生率。②换用其他的抗血小板药物，如氯吡格雷。有人提出对于阿司匹林可耐受但治疗无效时，可应用阿司匹林+缓释型双嘧达莫进行二级预防；对于不能耐受阿司匹林的患者，建议单用氯吡格雷[12]。
　　
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　　（收稿日期：2011-12-22）