荧光光谱法结合分子对接研究多酚和苋菜红与β-乳球蛋白结合的竞争作用
时间：2023-06-19 20:50:04 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
范金波，麻 奥，周素珍，王长霞，吕长鑫
（1 渤海大学食品科学与工程学院 辽宁省食品安全重点实验室 生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心 辽宁锦州 121013 2 锦州益多乐乳业有限公司 辽宁锦州 121018）
功能性乳制品作为一种有利于养成健康饮食习惯的商品，在预防慢性病方面受到日益关注。其不仅含有植物多酚、维生素等保持人体健康的附加成分，还富含乳蛋白、钙、活性肽等关键营养物。
β-乳球蛋白（β-Lactoglobulin，β-Lg）约占总乳蛋白的7%～12%，与α-乳白蛋白（α-Lactalbumin，α-La）同属于乳清蛋白[1-2]。作为乳酪生产过程中回收的副产品，可广泛获得，且相对廉价[3]。β-Lg 的“花萼”空腔可以运载甘油三酯、维甲酸和视黄醇等疏水小分子[4-5]。β-Lg 外表面的疏水口袋、Trp19-Arg124 附近、β-桶孔径和二聚体的单体-单体交界面也被认为是结合亲水性和两亲性配体的潜在位点[6-7]。
二酮类多酚姜黄素（Curcumin，Cur）、芪类多酚白藜芦醇（Resveratrol，Res）、黄酮类多酚槲皮素（Quercetin，Que）、酯类多酚咖啡酸-β-苯乙醇酯（Caffeic acid phenylethyl ester，CAPE）和苯丙烷类多酚绿原酸（Chlorogenic acid，CGA）在内的多酚类化合物具有抗炎抗氧化、降压降脂以及阻止癌症细胞起始、生长和转移等众多药理作用，然而，氧、光、热不稳定的特点导致多酚在体内半衰期短，并且较差的水溶性使其生物利用度受限，因此常将其装入两亲性共聚物胶束的疏水核心来发挥有益功效[8-17]。
苋菜红（Amaranth，Ama）是一种合成偶氮类染料，广泛应用于红色或棕色食品中，包括软饮料、蛋糕混合物、冰淇凌、谷类食品、葡萄酒、沙拉酱和咖啡[18]。然而，Ama 与人体内的某些药物（如阿司匹林、苯甲酸）接触时，可引起敏感人群的过敏和哮喘反应[19]。此外，有充分的证据表明，食用合成偶氮染料，其含有的偶氮（N=N）官能团和芳香环结构可被还原裂解成芳香胺，具有致癌毒性[20]。
功能性乳制品广受青睐，而在多酚类有益物质被人体吸收的同时，为其外观色泽加分的着色剂也在一定程度上危害健康。借助控制载体蛋白-有害色素复合物的解离来抑制其人体吸收，成为蛋白小分子互作研究需攻克的重点。通过荧光光谱法结合分子对接研究多酚和Ama 与β-Lg 的竞争结合，不仅可改善配体的溶解性和稳定性，达到控制释放的作用，还可以延申到发挥多酚类物质生物活性的同时，降低有害添加剂对人体健康的影响研究。
1.1 材料与试剂
β-Lg（纯度≥95%），合肥博美生物科技有限责任公司；
Ama、Cur、Res、Que、CAPE、CGA（纯度≥98%），上海生工生物工程有限公司；
磷酸氢二钠、磷酸二氢钠（分析纯级），天津市北辰方正试剂厂；
无水乙醇（分析纯级），天津市天力化学试剂有限公司；
试验用水皆为超纯水。
1.2 仪器与设备
F-7000 荧光分光光度计，日本日立高新技术公司；
XH-2000-I 旋涡混合器，天津市泰斯特仪器有限公司；
ML104 电子天平、FE20K 实验室pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；
Milli-Q HX7000 型超纯水机，德国默克密理博有限公司。
1.3 方法
1.3.1 苋菜红、多酚与β-乳球蛋白的分子对接 以分子对接模拟预测多酚、Ama 与β-Lg 结合的相应位点。β-Lg 的3D 结构采用RCSB PDB 蛋白质数据站中的5IO5 并去除水分子；
Ama（CID：13506）、Cur（CID：969516）、Res（CID：445154）、Que（CID：5280343）、CAPE（CID：5281787）、CGA（CID：1794427）的3D 结构来自PubChem 数据库。Autodock Vina v4.0 软件用于分子对接模拟。设置对接区域（x=91，y=58，z=89）以覆盖整个β-Lg 单体的结合位点，β-Lg 刚性对接，配体柔性对接，其它参数均默认。选择对接分数中的最低能量构象，利用Pymol 结合Discovery Studio 2017 v2.0 做图，Adobe Photoshop CS6 与PowerPoint 2013 软件美化图像[21]。
1.3.2 溶液配制 参考但倩誉[22]的方法并稍作修改，以二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠配制成10 mmol/L 的PBS 磷酸缓冲溶液（pH 7.4），4℃冷藏条件下有效期一个月。并以此缓冲液配制200 μmol/L 的β-Lg 溶液，以及1 mmol/L 的Ama、Cur、Res、Que、CAPE、CGA 溶液（除Ama 外均用70%乙醇溶液预溶），现配现用（如需暂存置于4℃冰箱）。
1.3.3 苋菜红、多酚对于β-乳球蛋白的荧光猝灭
1.3.3.1 苋菜红和多酚与β-乳球蛋白相互作用的荧光测定 参考张婕[23]的方法并稍作修改，将β-Lg 溶液以及一定量的Ama、多酚溶液与离心管中的PBS 缓冲溶液混合，在旋涡混合器上充分震荡。每管溶液总体积为3 mL，β-Lg 浓度均为20 μmol/L，Ama、多酚浓度分别为0，2，6，10，14，20，30，40 μmol/L，即配体蛋白比为0，0.1∶1，0.3∶1，0.5∶1，0.7∶1，1.0∶1，1.5∶1，2∶1。上述样品每种配制两组，分别于25，37 ℃反应30 min 后取出。
荧光扫描按如下条件进行：每次取300 μL 配制好的样品润洗标准石英比色皿3 次，取2 mL 样品于比色皿中利用荧光分光光度计进行荧光扫描。固定激发波长为295 nm，发射波长300 nm～500 nm，激发、发射的狭缝宽度均为2.5 nm，扫描速度为700 nm/min。
1.3.3.2 荧光内滤效应的消除 荧光内滤效应指由于荧光体的高浓度或存在其它吸光物，荧光体和吸光物吸收激发、发射光而减弱荧光的现象[24]。因此，有必要从荧光数据中消除这种影响。使用式（1）可消除荧光内滤效应，其中Fc和Fm分别为校正荧光和测量荧光，A1和A2分别是Ama 或多酚在激发和发射波长下的吸光度[24]。
1.3.3.3 猝灭常数计算 利用Stern-Volmer（2）方程对所得荧光数据进行计算，以求得猝灭速率常数Kq和Stern-Volmer 猝灭常数Ksv[25]。
式中，F0——猝灭剂加入前荧光体的荧光强度峰值；
F——猝灭剂加入后荧光体的荧光强度峰值；
[Q]——猝灭剂浓度，mol/L；
τ0——未加猝灭剂时荧光体的平均寿命，10-8s；
Ksv——Stern-Volmer猝灭常数；
Kq——生物分子猝灭速率常数。
1.3.3.4 结合常数与结合位点数计算 假设蛋白质上存在n个独立结合位点，采用Hill 方程（3）计算结合常数Ka和结合位点数n[25]。
式中，Ka——表观结合常数；
n为结合位点数。
1.3.3.5 热力学常数计算 分子间作用力包括氢键、范德华力、静电引力、疏水作用力等[26]。由Van"s Hoff 方程（4）和热力学方程（5）可计算出焓变ΔH、吉布斯自由能ΔG和熵变ΔS[27]。
式中，R——摩尔气体常数，8.314 J/（mol·K）；
T——试验温度，K；
K1——T1温度下对应的表观结合常数；
K2——T2温度下对应的表观结合常数；
ΔG——吉布斯自由能，kJ/mol；
ΔH——焓变，kJ/mol；
ΔS——熵变，J/（mol·K）。1.3.4 苋菜红和多酚与β-乳球蛋白的竞争结合试验 试验样品分为两组，分别为pH 7.4 组和pH 3.0 组，其中pH 3.0 组所用PBS 缓冲溶液用0.5 mol/L 盐酸调节pH 值（下同），后续操作一致[22]。
首先在离心管中加入PBS 缓冲溶液，每个离心管中溶液总体积为3 mL，再加入β-Lg 溶液并轻轻摇匀，β-Lg 浓度均为20 μmol/L，最后依次加入Ama 和多酚（多酚和Ama），前者浓度均为14 μmol/L，后者浓度分别为0，2，6，10，14，20，30，40 μmol/L，每次加入配体后在旋涡混合器上充分混匀后反应30 min。
荧光扫描条件同1.3.3.1 节。
1.3.5 数据分析 试验均重复3 次，日立FL Solution 2.1 软件用于数据采集，结果表示为平均值±标准差，利用IBM SPSS Statistics 25.0 软件进行显著性差异分析，差异水平P<0.05 为显著，采用Origin 9.0 软件绘制图形。
2.1 配体与β-乳球蛋白的分子对接
在分子对接模拟结果中，绿色键代表氢键，粉色键代表疏水相互作用。由图1a 可知，Ama 结合于β-Lg的疏水空腔的“入口”处，主要通过氢键与Lys69、Asn88、Asn90、Asn109 和Ser116 结合。Cur（图1b）与Ama 的结合位点接近，同样结合于β-Lg“桶口”处，被Ile71、Ile84、Asn90、Met07 4 个氨基酸残基包围，主要通过疏水相互作用与Ile71、Ile84 结合。Res（图1c）的结合位点也在“β-桶口”附近，并通过疏水相互作用与Leu39、Pro38、Met107 3 个氨基酸残基结合。Que（图1d）和CAPE（图1e）均通过疏水相互作用结合于β-Lg 的“桶底”，且由于氨基酸残基偏向一侧，可以判断此时二者结合于疏水空腔的外部。图1f 显示了CGA的结合位点位于β-Lg 的外表面，作用力主要是氢键。6 种配体与β-Lg 结合的吉布斯自由能分别为-40.32（Ama），-31.54（Cur），-32.15（Res），-35.63（Que），-37.44（CAPE），-36.96 kJ/mol（CGA）。
图1 Ama 和5 种多酚与β-Lg 的预测结合位点、氨基酸残基及作用力Fig.1 Predicted binding sites，the binding sites amino acids and interaction forces of Ama with five polyphenols on β-Lg
分子对接的结果表明Cur 和Res 与β-Lg 结合的位点与Ama 的结合位点接近（Cur、Res、Ama均与Asn90 结合，Res、Ama 皆与Leu39 结合），若Cur 或Res 与Ama 同时与β-Lg 相互作用时可能会产生竞争作用彼此影响与β-Lg 的结合，而Que、CAPE 和CGA 因结合位置远离Ama 的结合位点，将不会对Ama 结合于β-Lg 之上造成影响。
2.2 苋菜红、多酚对β-乳球蛋白荧光光谱的影响
分子对接结果从5 种多酚类物质中筛选出了与Ama 竞争结合位点的Cur 与Res，为验证分子对接的结果并进一步选择与Ama 竞争结合能力强的多酚，进行β-Lg 与Ama、多酚相互作用的荧光光谱检测。
蛋白质的内源荧光与Trp、Tyr、Phe 残基的存在密不可分。与配体的结合会诱导蛋白质的荧光猝灭，通过对荧光光谱的分析，可以得到蛋白质与配体结合的有关信息，以及与配体相互作用过程中氨基酸残基微环境的变化情况。β-Lg 含有两个Trp 残基Trp19 和Trp61 以及4 个Tyr 残基Tyr20、Tyr42、Tyr99 和Tyr102[28]。激发波长为295 nm 时，荧光光谱主要由Trp 贡献[29]。
由图2 可知，当激发波长为295 nm 时，β-Lg的最大荧光强度峰位置在334 nm 附近，且β-Lg的固有荧光强度值随着配体浓度的增加有规律的降低，而峰形无明显变化，即几种配体均对β-Lg的荧光产生了猝灭作用。其中Res（图2c）、CAPE（图2e）CGA（图2f）对β-Lg 的荧光猝灭能力相对其它几种配体明显更强。同时由图可以看出，随着Res（图2c）和CGA（图2f）浓度增加，β-Lg 最大荧光峰发生明显红移（334 nm→356 nm 和333 nm→354 nm），CAPE（图2e）的加入也导致最大荧光峰位置的轻微红移（334 nm→346 nm），此现象表明这几种配体存在时，β-Lg 芳香族氨基酸残基的微环境发生了变化，在分子层面表现为亲水性增加，疏水性降低，与Kanakis 等[30]、张婕[23]和郝明皓[31]的研究结果一致。Cur（图2b）与Que（图2d）的添加，造成了蛋白最大荧光峰位置一定程度上的蓝移（335 nm→331 nm 和335 nm→332 nm），此时芳香族氨基酸残基的微环境变得更加疏水，试验结果与Kanakis 等[30]和李晓蕾等[11]一致。图2a 还体现了一个独特的现象，即在420 nm 附近，出现了一个随Ama 浓度增加荧光强度升高的峰，即Ama 与β-Lg 的复合物产生了内源荧光。
图2 不同温度下Ama 和5 种多酚对β-Lg 的荧光猝灭Fig.2 Fluorescence quenching of β-Lg by Ama and five kinds of polyphenols at different temperatures
对比每种配体的左、右两图可以看出温度升高虽导致β-Lg 的内源荧光强度减弱，但不会对配体猝灭β-Lg 内氨基酸残基荧光的能力造成明显影响，这可能与温度升高程度较低有关。
2.3 配体对β-乳球蛋白的荧光猝灭机理与热力学性质
动态和静态猝灭作为配体猝灭蛋白质的两种模式[32]，前者意味着高温导致分子碰撞剧烈和扩散加快，表现为动态猝灭常数与温度成正比；
而静态猝灭形成的复合物受热分解，因此静态猝灭常
数会随温度升高而减小[33]。Stern-Volmer 方程【式（2）】和Hill 方程【式（3）】可阐明荧光猝灭机理[25]。同时，利用Van"s Hoff 方程【式（4）】和热力学方程【式（5）】可分析反应的热力学性质，判断相互作用力。对于作用力类型的判断，一般认为，当反应放热，ΔS<0 时，结合的主要驱动力是氢键和范德华力；
而ΔS>0 时，静电相互作用是主要作用力；
当ΔH和ΔS均大于0 时，主要是疏水相互作用[34]。
表1 与表2所示为方法中所述数学方程计算得到的配体与β-Lg 相互作用的一些重要常数。
由表1 可知配体与β-Lg 结合的生物分子猝灭常数（Kq）均大于最大扩散碰撞猝灭速率常数值2×1010L/（mol·s），说明形成了蛋白质-配体复合物，即发生了静态猝灭[35]。研究表明当结合常数（Ka）在（1～15）×104L/mol 范围内时，配体以可逆的方式与蛋白质结合[36]，可以看出除Que 在25 ℃结合常数较低外，配体与β-Lg 均有较强的结合能力，且结合能力与荧光发射光谱中对β-Lg 的猝灭能力相对应。几种配体结合位点数接近于1 说明与β-Lg 均有单个结合位点，结果符合前人的研究结论。
由表2 可知配体与β-Lg 的结合均为自发进行（ΔG<0）。其中Ama 与CGA 的ΔH<0，说明二者与β-Lg 的结合反应放热，也与表1 中的Ka随温度升高而减小相对应。反之ΔH>0 的蛋白质-配体复合物的Ka值随温度升高而增大。由ΔH与ΔS推断蛋白质与配体结合主要驱动力可知，Ama和CGA 与β-Lg 作用类型为氢键与范德华力，Cur、Res、Que 和CAPE 则通过疏水相互作用与β-Lg 结合，与分子对接中所表现的相互作用力基本相符。
表1 配体与β-Lg 相互作用的猝灭、结合常数Table 1 Quenching constants and binding constants of β-Lg interacting with ligands
表2 配体与β-Lg 相互作用的热力学常数Table 2 Thermodynamic constants of β-Lg interacting with ligands
2.4 和苋菜红竞争结合β-乳球蛋白的多酚的确定
β-Lg 的疏水空腔，也就是被称为“花萼”的β-桶由于特殊构造，对结合位点控制具有pH 值响应性。“EF 环”类似于开关控制小分子进入疏水空腔内部，当β-Lg 处于中性pH 值时，“EF 环”打开，小分子可进入疏水空腔并结合，而当外部环境为酸性时，Glu89 质子化使“EF 环”闭合挡住空腔入口，阻止小分子结合到疏水腔内，此时小分子只能结合于β-Lg 的外表面[37]。
由荧光猝灭率图3所示，可以看出在pH 值为7.4 时Ama 与β-Lg 的结合显著影响了Cur 的结合，具体体现在猝灭率降低。而在pH 值为3 时Ama 与β-Lg 的结合未对Cur 造成影响。同时其它多酚类物质与Ama 无竞争结合β-Lg 的体现或竞争作用较弱。说明在中性条件下，Cur 与Ama 均结合到β-Lg 的相近位点，而在酸性条件下，“EF 环”关闭，此时Cur 和Ama 结合于β-Lg 外表面的不同位点，二者与β-Lg 的结合互不影响。
图3 不同pH 值下Ama 对β-Lg-配体复合物的荧光猝灭率影响Fig.3 Effect of Ama on fluorescence quenching rate of β-Lg-ligand complex at different pH value
由荧光猝灭率图4 可知中性条件下Cur、Res与β-Lg 的结合均影响了Ama 的结合，两种配体出现竞争关系，此时Ama 与Cur、Res 竞争结合相近位点，猝灭率降低，对应了分子对接的结论，此时Cur、Res 先于Ama 与β-Lg 结合，而由于Ama对此位点的结合能力较强因此与前者产生竞争作用。从图中可以看出Cur 与Ama 的竞争作用略强于Res。酸性环境中5 种多酚与β-Lg 的结合不会对Ama 造成影响。二配体竞争试验的结果表明配体添加顺序的改变也可以影响配体与蛋白质的结合。
图4 不同pH 值下配体对β-Lg-Ama 复合物的荧光猝灭率Fig.4 Effect of ligands on fluorescence quenching rate of β-Lg-Ama complex at different pH value
以分子对接模拟了5 种多酚和Ama 与β-Lg的结合位点氨基酸和作用力类型，并采用荧光光谱法验证多酚和Ama 与β-Lg 结合的荧光猝灭、结合位点数和相互作用力，最后通过竞争结合试验结合分子对接确定了与Ama 竞争β-Lg 位点的多酚。结果表明，多酚类活性成分Cur、Res、Que、CAPE 和CGA 与人工合成偶氮类染料Ama 均可对β-Lg 产生静态猝灭从而形成蛋白质-配体复合物。Ama、Cur 和Res 的结合位点在β-Lg 空腔入口附近，Que、CAPE、CGA 的结合于β-Lg 空腔外表面。其中Ama 和CGA 与β-Lg 作用力类型为氢键和范德华力，Cur、Res、Que 和CAPE 则通过疏水相互作用与β-Lg 结合，结果与分子对接模拟的配体与β-Lg 结合的主要作用力类型一致。酸性条件下Cur、Res、Que、CAPE、CGA 与Ama 均无明显竞争结合作用，推测此时Ama 和5 种多酚与β-Lg结合于不同位点。在先加Ama 再添加多酚时，中性条件下Ama 与Cur 竞争结合于β-Lg 的结合位点；
而在多酚先与β-Lg 结合的情况下，Cur 和Res在中性环境中均会影响Ama 与β-Lg 位点的结合。综上结果表明5 种多酚中Cur 和Res 存在与Ama 的位点竞争作用，且竞争作用受配体与β-Lg的结合顺序影响，对为控制功能性乳制品中小分子物质的人体吸收提供启发具有重要意义。
