LINC00963通过miR-214-5p/SEMA4C调控结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭
时间：2023-04-25 22:30:03 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
朱萍，浦春，2*，胡蝶，张艳珍，张博超，马思源，赵晓晓
（1.皖南医学院弋矶山医院检验科，安徽 芜湖 241001；
2.皖南医学院检验学院）
结直肠癌（CRC）是常见的消化道恶性肿瘤之一，靶向治疗可有效改善生存率，降低病死率［1］。研究表明长链非编码RNA（lncRNA）在CRC 组织及细胞系中异常表达，影响了CRC 细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡，并作为CRC 诊断、治疗及预后的靶标［2］。长链基因间非编码RNA00963（LINC00963）是一种新的lncRNA，位于9 号染色体上，全长25 027 bp，已被证实在多种人类肿瘤中存在差异表达，并在肿瘤发生中发挥作用。最近有研究表明，LINC00963 可以通过miR-532-3p/HMGA2 轴发挥CRC 的致癌活性，与CRC 不良预后相关［3］。此外，LINC00963 在乳腺癌中显著上调，它的上调与乳腺癌细胞的增殖、肿瘤发生和抗放射性有关［4］。miRNAs是一类大小在20～25 nt的内源性非编码RNA，可与其相对应的目的基因3"-UTR 进行碱基互补配对，导致目的基因降解和抑制其蛋白质翻译［5］。在功能上，miRNAs 的异常表达可影响肿瘤细胞的生物学行为，如增殖活力、划痕愈合率和侵袭能力等［6-8］。miR-214-5p是miRNAs 的一种，研究发现miR-214-5p在肝癌细胞中低表达，过表达抑制肝癌增殖和迁移［9］；
此外，miR-214-5p可调节骨肉瘤细胞的增殖和侵袭［10］。但LINC00963 和miR-214-5p对CRC 细胞增殖、迁移侵袭的影响还尚未可知。Semaphorin4C（SEMA4C）是一种信号蛋白，其在乳腺癌［11］、肺癌［12］、宫颈癌［13］和肝癌［14］中高表达。本研究旨在研究LINC00963 是否通过调控miR-214-5p/SEMA4C影响CRC 细胞的增殖、迁移和侵袭。
1.1 材料 CRC 细胞株HCT116、SW480 购自中国科学院上海细胞库；
胎牛血清、DMEM 培养基（美国Gibico公司）；
胰蛋白酶（美国Sigma公司）；
实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；
PCR 引物（上海吉凯基因化学技术有限公司）；
Trizol 试剂（生工生物工程（上海）股份有限公司）；
Transwell 小室、基质胶（美国BD 公司）；
CCK-8 试剂盒、羊抗兔IgG 及BCA 蛋白检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；
兔抗人单克隆抗体SEMA4C抗体（英国Abcam 公司）；
兔抗人单克隆抗体β-actin（美国Cell Signaling Technology 公司）；
si-LINC00963 及阴性对照（si-nc）、miR-214-5p模拟物（mimic）及模拟对照序列（miRNA-nc）（广州锐博生物科技有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 细胞处理与分组 应用含有青霉素/链霉素双抗的10%胎牛血清的高糖DMEM 培养基中常规培养HCT116、SW480 细胞，分别将si-nc、si-LINC00963、miRNA-nc、miR-214-5pmimic 转 染至HCT116、SW480 细胞中，记为si-nc 组、si-LINC00963组、miR-nc组、miR-214-5p mimic组。
1.2.2 在线生物信息学工具 利用StarBase v3.0、Ualcan 和GEPIA 数据库对TCGA 数据库中的LINC00963 及miR-214-5p进行分析，明确两者在CRC 组织及正常组织中的表达差异及LINC00963及SEMA4C的相关性，通过LncBase Predicted v.2及miRanda 预测发现LINC00963 与miR-214-5p之间存在潜在的结合位点，后续通过双荧光素酶实验验证了两者的联系。
1.2.3 qRT-PCR 提取各组细胞总RNA，反转录成cDNA，按试剂盒说明进行PCR，采用2-△△Ct法计算相对表达量。LINC00963 引物的上游引物为5"-GGTAAATCGAGGCCCAGAGAT-3"，下游引物为5"-ACGTGGATGACAGCGTGTGA-3"；
miR-214-5p引物的上游引物为5"-GGCCTGGCTGGACAGAGTTG-3"；
SEMA4C引物的上游引物为 5"-GACACCTCCTGGCACAACAC-3"，下游引物为5"-CCACTTCTGGGCTTCCTCA-3"；
U6 引物的上游引物为5"-AGAGAAGATTAGCATGGCCCCTG-3"；
甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）引物的上游引物为5"-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3"，下游引物为5"-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3"。
1.2.4 CCK-8 实验 取生长良好的HCT116、SW480 细胞接种于96 孔板，每组设置5 个复孔，每个复孔接种6 000个细胞，每组转染后，分别于培养0、24、48、72、96 h 时，每孔加入10 μl CCK-8 溶液，37 ℃培养1 h，应用酶标仪于450 nm处测定光密度（optical density，OD）值。
1.2.5 细胞划痕实验 取生长良好的 HCT116、SW480 细胞接种至6 孔板，24 h 后各组分别进行转染，待细胞长到100%汇合度时，用200 μl无菌枪头划破细胞的中轴，移液管吸取磷酸盐缓冲液冲洗滑落下来的细胞，保证边缘整齐，倒置显微镜下观察拍照，用无菌枪头加入无血清培养基继续培养。并在0、24 和48 h 3 个时间点，使用倒置显微镜拍摄伤口愈合情况。
1.2.6 Transwell 实验 将100 μl 稀释的Matrigel胶加入Transwell小室上方，置于培养箱中孵育2 h。取生长良好的细胞分别进行转染，24 h 后将含有6×104个细胞的200 μl 无血清培养基加入Transwell小室上方，小室下方加入500 μl 含20%胎牛血清的培养基后，置于培养箱中。培养48 h 后，吸出上室液体，4%多聚甲醛固定细胞30 min，用结晶紫溶液对细胞进行染色20 min，用磷酸盐缓冲液洗去多余染料，用无菌棉签擦去小室内细胞，放于低倍显微镜下观察膜的下室面，随机选取3个低倍区域（×100），计数穿膜的细胞数量，统计处理结果。每组3个复孔，实验至少重复3次。
1.2.7 Western blot 蛋白提取和Western blot 采用裂解缓冲液（RIPA，上海碧云天生物技术有限公司）和苯甲磺酰氟（PMSF，上海碧云天生物技术有限公司）提取细胞总蛋白，使用BCA 试剂盒测定各蛋白样本的浓度。取50 μg蛋白经过12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（上海碧云天生物技术有限公司）电泳，常规湿法转膜后，5%脱脂牛奶在4 ℃下阻断1 h，分别用1∶10 000的兔抗人单克隆抗体SEMA4C 和1∶1 000 的兔抗人单克隆抗体β-actin 在4 ℃摇床过夜；
第2 天用1∶1 000 的辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG 室温轻摇2 h，避光条件下，加入ECL 化学发光显色液，置于成像仪中观察结果。
1.2.8 双荧光素酶实验 取转染前一晚的HEK-293T 细胞接种于24 孔板，待到细胞汇合度达到70%～80% 时转染，利用lipofectamine 试剂将LINC00963-wt 质粒 与miR-214-5pmimics、miR-nc共转染至HEK-293T 细胞，48 h后检测荧光素酶活性强度。
1.3 统计学方法 采用SPSS 17.00、GraphPad Prism 8.0 软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，2 组比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 预测LINC00963 与miR-214-5p相关性 通过LncBase Predicted v.2 发 现LINC00963 与miR-214-5p结合评分为0.991，显示两者可能存在结合位点；
并且miRanda 预测显示，LINC00963 与miR-214-5p结合评分为154，LINC00963 可能调控miR-214-5p表达；
同时双荧光素酶报告实验显示LINC00963与miR-214-5p存在相互作用。见图1。
图1 LINC00963与miR-214-5p具有结合位点
2.2 CRC 组织 中LINC00963 和miR-214-5p的表 达及LINC00963 与SEMA4C的相关性 GEPIA 及StarBase 数据库显示CRC 组织中LINC00963 的表达水平高于正常组织，而miR-214的表达水平低于正常组织，此外，CRC 患者LINC00963 的高表达与较差的总生存期（OS）相 关（P＜0.05），LINC00963与SEMA4C的表达呈正相关，见图2。
图2 LINC00963和miR-214-5p在CRC组织中的表达及LINC00963与SEMA4C的相关性
2.3 下 调LINC00963 对miR-214-5p及SEMA4C的影响 为了验证LINC00963 对CRC 细胞的影响，将si-LINC00963 与阴性对照转染至HCT116、SW480 细胞中，qRT-PCR 结果显示与阴性对照组（si-nc组）比较，si-LINC00963组HCT116、SW480细胞中LINC00963 表达水平显著降低（P＜0.05），miR-214-5p表达水平显著升高，SEMA4CmRNA表达水平显著降低（P＜0.05）；
Western blot 结果显示，与阴性对照组（si-nc组）比较，SEMA4C蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。见图3。
图3 转染阴性对照、si-LINC00963后各组LINC00963、miR-214-5p及SEMA4C的表达
2.4 下调LINC00963 抑制CRC 细胞增殖、迁移和侵袭的能力 转染了si-LINC00963 后，与对照组（si-nc组）比较，si-LINC00963组CRC细胞增殖活力、迁移能力降低，侵袭数量减少（P＜0.05），见图4。
图4 转染阴性对照、si-LINC00963后各组细胞的增殖能力、划痕愈合率及侵袭能力
2.5 上调miR-214-5p对SEMA4C的影响 为了进一步验证miR-214-5p表达增高对CRC细胞的影响，将阴性对照、miR-214-5pmimic 转染至HCT116、SW480 细胞。结果显示，与miR-nc 组比较，miR-214-5p mimic 组miR-214-5p表达水平升高（P＜0.05），提示转染成功。然后采用qRT-PCR与Western blot 检测发现HCT116、SW480 细胞中SEMA4CmRNA 和蛋白质水平显著降低（P＜0.05）。见图5。
图5 转染阴性对照、miR-214-5p mimic后各组miR-214-5p及SEMA4C的表达
2.6 上调miR-214-5p表达对CRC 细胞增殖、迁移和侵袭的影响 转染了miR-214-5pmimic 后，与miR-nc 组比较，miR-214-5p mimic 组CRC 细胞增殖活力、迁移能力降低，侵袭数量减少（P＜0.05），见图6。
图6 转染阴性对照、miR-214-5p mimic后各组细胞的增殖能力、划痕愈合率及侵袭能力
CRC 的术后复发、转移［15］是导致患者死亡和预后不良的主要原因，其具体机制尚无比较明确的定论。LncRNA 是一种长度超过200 nt的非编码RNA［16］。越来越多的证据表明，LncRNA 与多种肿瘤的恶性肿瘤行为密切相关，如肿瘤自噬、肿瘤抗性和肿瘤免疫等［17-18］。目前已发现多种lncRNA在CRC 细胞中异常表达，并通过与下游靶基因结合，共同调节CRC细胞的生长、迁移的形成过程，从而影响CRC的发生、转移和预后［19］。LncHAGLR在CRC 组织和细胞中的表达增加；
下调表达的HAGLR可抑制CRC细胞的生长、迁移和侵袭［20］。此外，有研究发现，LINC00707 在大肠癌组织和细胞中表达上调并对大肠癌的体内生长有促进作用［21］。
LINC00963 是一种新型LncRNA，位于9 号染色体9q34.11 上，全长约为2.1 kb，已被证实在多种人类肿瘤中存在差异表达，并在肿瘤发生中发挥作用［22］。异常表达的LINC00963 通常通过调节各种细胞过程（包括增殖、迁移、侵袭、上皮间质转化和细胞凋亡）来发挥致癌作用。过表达的LINC00963 与癌症临床病理特征和不良的癌症预后有关，可用于肝细胞癌的诊断［23］。有研究指出，LINC00963 在乳腺癌中具有显著的高表达水平，且LINC00963 可以诱导乳腺癌细胞转移［24］。Chang 等［25］的研究发现LINC00963 可能与宫颈癌患者预后不良有关。本实验通过检索数据库发现，CRC 组织中LINC00963 的表达水平高于正常组织，此外，CRC 患者LINC00963 的高表达与较差的总生存期相关，说明LINC00963 可能作为CRC 的潜在预后标志物。本研究结果显示，CRC细胞系 HCT116、SW480 转染si-LINC00963 后，癌细胞增殖能力降低，迁移和侵袭数量降低；
表明干扰LINC00963 的表达抑制CRC 的增殖、迁移和侵袭。
为了进一步分析LINC00963 调节CRC 细胞的作用机制，本研究通过数据库发现LINC00963 与miR-214-5p可能存在结合位点。为了验证LINC00963 与miR-214-5p在CRC 细胞中的相互关系，将si-LINC00963 转染至细胞中，通过qRTPCR 检测发现当CRC 细胞中LINC00963 的表达降低，miR-214-5p的表达增高，表示LINC00963 在CRC 细胞中负调控miR-214-5p表达，这与数据库的结果一致。
miRNAs 是一种源自内源性转录本的非编码RNA。它们可以通过转录后基因沉默促进基因组调控和微调［26］。通常，这些miRNA 能够与其靶基因的3"-UTR 中的特定位点结合，并通过完全或不完全的碱基配对介导mRNA 降解或阻断基因翻译［27-28］。大量研究证实，miR-214-5p在多种肿瘤中起重要作用。有报道miR-214-5p在甲状腺状瘤、肝癌和食管鳞状细胞癌中的表达也明显下调，miR-214-5p的过表达可显著促进癌细胞凋亡，抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭［29］。此外，miR-214-5p可通过靶向多种肿瘤相关调节因子来影响癌症的发生和发展［30］。本研究通过检索数据库发现，CRC 组织中miR-214 的表达水平显著降低，说明miR-214 在CRC 组织中低表达。本研究中将miR-214-5pmimic 转染至CRC 细胞中，以检测其对细胞生物功能的影响。结果发现，当miR-214-5p表达增高后，CRC 细胞活性和迁移侵袭数量降低，说明过表达miR-214-5p可抑制CRC细胞的增殖、迁移和侵袭。然而，miR-214-5p是否可以逆转si-LINC00963 对CRC 增殖、迁移与侵袭等功能的调控，这将在后续的实验中进行进一步的验证。
SEMA4C是一种信号蛋白，是多种miRNA 的靶基因，参与了许多恶性肿瘤（包括乳腺癌、宫颈癌、肝癌和肺癌）的上皮间充质转化介导的化疗 耐药性［31］。为了探讨LINC00963 和SEMA4C三者在CRC 细胞中的相互关系，我们将si-LINC00963 转染至CRC 细胞中，以检测SEMA4C的水平变化。结果发现，SEMA4C的mRNA 和蛋白质水平均显著下调，由此证明SEMA4C与LINC00963呈正相关。
综上所述，LINC00963 通过调控miR-214-5p/SEMA4C调控CRC细胞的增殖、迁移和侵袭。
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