温度和赤霉素对春兰开花的调控
时间：2023-04-25 12:35:42 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
刘晓芬，凌晓祺，向理理，余 璐，沈 宏，李 方，*
(1.浙江大学 农业与生物技术学院，浙江省园艺植物整合生物学研究与应用重点实验室，浙江 杭州 310058；
2.建德市杨村桥镇艺澜种植场，浙江 建德 311603)
春兰(Cymbidiumgoeringii)属兰科兰属地生兰，主要分布于中国江浙地区。株形优美，花放幽香，是国兰中栽培与观赏历史最悠久的种类，深受广大人民群众的喜爱。春兰品种繁多，花品等级和价格不同，可满足各层次消费者的需求，具有较高的市场价值。然而由于花期问题和技术限制，江浙地区春兰一般在2—3月份的中下旬开花，无法满足年宵花市场需求[1]。若能使花期提前至春节前，将大大提高春兰的经济效益。
植物成花受环境因素、生长发育和内源激素等的调控，其中环境因素包括光周期、温度和非生物胁迫等。温度是调控兰科植物开花的重要因子，多数兰科植物需经历一段时期低温诱导才能开花[2]。春兰花芽形成为每年的5—8月份，花蕾随后处于半休眠状态，生长速度极其缓慢，历经11月份至次年1月份的低温诱导后，在2—3月份开花。赵虎等[1]研究发现，3～6 ℃低温处理40 d可促使春兰提前开花；
卢国志[3]研究发现，昼温20～26 ℃和夜温15～19 ℃能够使墨兰提前7～10 d开花。
除低温外，植物生长调节剂调控兰科植物开花也有很多成功报道，赤霉素可代替或部分代替低温来解除或辅助解除兰科植物休眠，促进生长[4]。何碧珠等[5]研究发现，喷施50 mg·L-1赤霉素可使墨兰花期提前7 d。黄雪梅[6]认为促进春兰营养生长和生殖生长效果最好的组合是100 mg·L-1赤霉素和25 mg·L-1水杨酸混合喷施，花期比对照提前10 d。
植物开花是一个复杂的生理生化和形态建成过程，需消耗大量淀粉、可溶性糖和可溶性蛋白，这些内含物在花芽分化时期大量积累，为开花提供物质基础[7]。此外，一些研究表明，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(peroxidase，POD)和过氧化氢酶(catalase，CAT)与花芽分化密切相关，这些抗氧化物酶通过清除超氧自由基、氢氧根离子等活性氧，保障植物生长发育有序进行[8]。近年来，蝴蝶兰、大花蕙兰等洋兰的年宵花花期调控技术日臻成熟，广西春兰的花期调控技术也有报道[6，9]，然而对于传统名花中占有重要地位的江浙春兰，现有的促成栽培研究成果甚少，生产上多按个人经验进行小规模催花处理，缺乏科学的处理设计和数据分析。本研究主要通过温度控制和赤霉素处理，并配合良好的栽培管理措施，使得原本花期在2—3月份的春兰提前至春节期间开放，达到春节前上市的目的，丰富了年宵花种类。同时对于不同试验设计下花朵的形态和生理指标进行调查分析，最终筛选出经济便捷的促成栽培方案。本研究结果对于传统名花开发、丰富年宵花市场具有重要理论和实践意义，也为春兰花期调控的规模化和工厂化生产打下良好的基础。
1.1 试验材料
供试春兰来自浙江建德艺澜种植场，盆土为细刨花：园土：粗黄沙体积比1∶1∶1，采用常规栽培管理。挑选无病虫害、有花芽、长势良好一致的春兰盆花作为供试材料，试验春兰总计315盆，每盆平均苗数15苗，平均花芽数5个。
1.2 自然低温处理
将培养于单层塑料大棚(6～8 ℃)的春兰盆花置于室外自然条件下，分别低温处理10 d(有效低温时数105 h)、20 d(有效低温时数241 h)、30 d(有效低温时数350 h)，处理结束后移至双层塑料大棚(8～11 ℃)中保温培养30 d。以0 d(未经低温处理)和60 d(持续自然低温)处理的春兰为对照，以小于5 ℃的低温时长累加计算有效低温时数。每处理15盆，共75盆。
1.3 保温培养
前期研究发现，低温处理后的保温培养条件对于春兰开花率与花葶高度有重要影响，故在低温处理30 d(有效低温时数约为350 h)后，将春兰置于不同保温条件下培养30 d，分别为单层塑料大棚(6～8 ℃)、双层塑料大棚(8～11 ℃)、塑料温室(9～12℃)和玻璃温室(17～20 ℃)。每处理15盆，共60盆。
1.4 赤霉素处理
赤霉素处理试验使用上海同瑞生物科技有限公司的农用赤霉素GA3(有效成分含量75%)，共设置3种质量浓度，分别为30 mg·L-1、60 mg·L-1和90 mg·L-1。进行单次和两次喷施(两次间隔10 d)，以清水为对照。喷施后在双层塑料大棚中保温培养30 d，处理结束后统计开花率并测定形态指标。每处理15盆，共105盆。
1.5 低温和赤霉素结合处理
为研究温度和赤霉素的综合作用，将栽培于塑料温室的春兰盆花置于自然低温条件下处理30 d(有效低温时数101 h，暖冬年)，低温处理结束后对其进行不同质量浓度赤霉素处理。前期研究结果表明，30～90 mg·L-1赤霉素处理，开花率随赤霉素质量浓度升高而升高，因此，本次实验设置了更高的赤霉素质量浓度梯度，分别为60、90、120、150 mg·L-1，以清水为对照，喷施后置于玻璃温室保温培养30 d。每处理15盆，共75盆。
1.6 开花率统计与形态指标测定
处理开始前，统计春兰花芽数；
处理结束后，记录开花数，开花率(%)=(开花数/花芽总数)×100；
测量花葶高度、花朵长度和花朵高度，花朵长和花朵高以花朵的最大开放度计量，即春兰外三瓣的最大宽度和高度间距。
1.7 生理指标测定
可溶性糖含量测定使用蒽酮比色法，根据刘海英等[10]的方法修改。取0.5 g样品，先用液氮磨碎再加少量石英砂和5 mL 80%乙醇研磨；
将匀浆转入10 mL离心管中，4 ℃、4 000×g离心5 min(重复3次，每次倒出上清液后加5 mL乙醇)；
将3次上清液倒入50 mL容量瓶中，加去离子水定容至50 mL待测。取待测上清液200 μL，加800 μL H2O，加10 mL蒽酮于沸水浴中煮10 min，黑暗中冷却至室温(冰浴)，测620 nm处的吸光度D620，每个处理重复3次。
可溶性蛋白含量测定采用Bradford[11]的方法，略作改进。取样品0.2 g，加3.0 mL 50 mmol·L-1磷酸缓冲液(pH值7.8、含0.3 mmol·L-1EDTA)，于冰浴中研磨提取，匀浆液离心30 min(4 ℃、12 000×g)。取15 μL上清液，加入3 mL考马斯亮蓝，测595 nm处的吸光度D595，每个处理重复3次。利用牛血清白蛋白制作的标准曲线计算可溶性蛋白含量。
SOD活性测定采用氮蓝四唑(NBT)光还原法[12]，略作改进。酶液制备同可溶性蛋白含量测定。测定时取待测酶液50 μL，加入3 mL反应液(含有13 mmol·L-1甲硫氨酸，70 mmol·L-1NBT，1.3 mmol·L-1核黄素，0.l mmol·L-1EDTA，用50 mmol·L-1pH值7.8的磷酸缓冲液配制)，混匀后在25 ℃、光照强度4 000 lx条件下均匀照光15 min后，以黑布覆盖终止反应，测560 nm处的吸光度D560，每个处理重复3次。用缓冲液代替酶液置于光下作为光对照，用缓冲液代替酶液置于黑暗条件下作为空白对照。釆用抑制3 mL NBT反应液光化学反应50%所需的酶量为1个活性单位，以每g鲜重在单位时间内对应的酶活性单位(U·g-1·min-1)表示。
POD活性测定采用愈创木酚法[13]，略作改进。酶液制备同可溶性蛋白含量测定。测定时取待测酶液100 μL，加入1 700 μL 25 mmol·L-1磷酸缓冲液(pH值7.0，含0.1 mmol·L-1EDTA)、100 μL 1%愈创木酚溶液、100 μL 20 mmol·L-1的H2O2，混合均匀后测470 nm处的吸光度D470。取1 min内的动力学变化计算酶促反应速率，每个处理重复3次，用缓冲液代替酶液调零。
CAT活性测定方法参考已报道方法[14]并略作改进。酶液制备同可溶性蛋白含量测定。活性测定时取酶液100 μL，加入1 700 μL 25 mmol·L-1的磷酸缓冲液(pH值7.0，含0.1 mmol·L-1EDTA)、200 μL 225 mmol·L-1的H2O2，混合均匀后测290 nm处的吸光度D290。取1 min内的动力学变化计算酶促反应速率，每个处理重复3次，用缓冲液代替酶液调零。
1.8 数据统计
温度数据使用杭州泽大仪器ZDR-20智能数据记录仪测定，1 h采集1次，用以控制栽培环境和有效低温时数的计算。用Excel 2013和SPSS17.0软件对试验数据进行统计分析，采用Duncan’s多重比较分析不同处理间差异显著性，显著性水平为α=0.05。
2.1 自然低温处理时长对春兰开花率与形态指标的影响
春兰植株经10、20、30 d自然低温处理后，置于双层大棚保温培养30 d，以0 d未经低温处理和60 d持续自然低温处理为对照，处理结束后，正值春节前15 d，统计开花率。由图1-A可以看出，60 d持续自然低温处理(有效低温时数797 h)的春兰没有开花；
未经自然低温处理的春兰开花率为2.5%；
经过10 d(有效低温时数105 h)、20 d(有效低温时数241 h)和30 d(有效低温时数350 h)低温处理的植株开花率分别为40%、52.59%、30.59%，远高于0 d对照和60 d持续自然低温的植株，且随着低温时长的增加开花率有先上升后下降的趋势。低温处理20 d的春兰开花率最高，是0 d对照的21.04倍。上述结果表明，春兰植株只有在接受适宜时长的低温处理后才能提前开花，过短过长均不利于其提前开花，有效低温时长以105～350 h为宜。
图中不同小写字母表示在P<0.05水平差异有统计学意义。下同。Different lowercase letters above bars represented statistically significant differences at the 0.05 probability level. The same as below.图1 自然低温处理时长对春兰开花率与形态指标的影响Fig.1 Effects of different natural low temperature treatments on flowering rate and morphological indexes of Cymbidium goeringii
为明确低温处理是否影响春兰的观赏性指标，对花葶高度、花朵长、花朵高3项指标进行测量统计。结果如图1-B所示，经历10、20、30 d低温处理的春兰平均花葶高度分别为5.48、6.55、5.45 cm，其中20 d低温处理的花葶高度最高。0 d对照和持续自然低温60 d的植株花葶高度分别为4.92 cm和4.79 cm。结果表明，适宜时长的低温处理不仅可以提高开花率，还能增加花葶高度。
60 d持续自然低温的春兰植株开花率为0，故没有花朵长和花朵高的统计数据。10、20、30 d低温处理后的春兰花朵长和花朵高均高于0 d对照，花朵长比0 d对照分别长2.43、1.96、1.64 cm，花朵高比0 d对照分别高2.92、1.38、2.15 cm(1-B)。说明低温处理一定程度上提高了花朵开放度。
2.2 保温培养条件对春兰开花率与形态指标的影响
持续自然低温处理的春兰开花率为0，推测低温处理后的保温培养条件是影响开花率的重要因素；
因此，本研究继续开展对低温处理后最佳保温条件的研究。将低温处理30 d的春兰置于4种不同保温培养条件下，分别为单层大棚(6～8 ℃)、双层大棚(8～11 ℃)、塑料温室(9～12 ℃)和玻璃温室(17～20 ℃)，培养30 d，正值春节前15 d，调查开花。由图2-A可以看出，随着培养温度的升高，春兰开花率也随之增加，玻璃温室开花率最高，达到78.57%。塑料温室和双层大棚的开花率分别为31.31%和30.59%，单层大棚开花率最低，为4.17%。这些结果表明，适当提高保温培养条件能进一步提高春兰开花率。
相较于自然低温处理，不同保温条件对春兰花葶高度的影响更为明显，花葶高度随温度升高呈增加趋势(图2-B、2-C)，单层大棚、双层大棚、塑料温室、玻璃温室中春兰的花葶高度分别为5.24、5.45、7.89、12.64 cm。
春兰的花朵长和花朵高总体随温度升高而增加(图2-B)。单层大棚、双层大棚、塑料温室和玻璃温室花朵长分别为4.50、3.89、7.48、6.67 cm，花朵高分别为2.00、4.15、5.71、6.93 cm。
图2 不同保温条件对春兰开花率与形态指标的影响Fig.2 Effects of different culture temperature conditions on flowering rate and morphological indexes of Cymbidium goeringii
2.3 赤霉素浓度与喷施次数对春兰开花率与形态指标的影响
如图3所示，总体来看，开花率随赤霉素质量浓度的增加而提高，0、30、60、90 mg·L-1赤霉素单次喷施开花率分别为2.5%、4.12%、19.1%和20.83%，两次喷施开花率分别为2.5%、24.38%、18.18%和28.83%。当赤霉素质量浓度为30 mg·L-1时，两次喷施效果好于单次。当赤霉素质量浓度达到60 mg·L-1时，两次和单次喷施效果差异不显著。测量春兰各项形态指标发现，喷施适宜浓度赤霉素可增加花葶高度，且两次喷施效果好于单次喷施，但两次喷施后的花朵长和花朵高要小于单次喷施(图3)。田间观察发现，喷施赤霉素会造成春兰植株叶黄、叶尖枯等，因此，对赤霉素处理后的叶黄率和叶尖枯率进行了统计分析。结果表明(图3)，随着赤霉素质量浓度的升高，黄叶率和叶尖枯率也有所提高；
两次喷施的叶黄率高于单次喷施，除90 mg·L-1赤霉素单次喷施的叶尖枯率高于两次喷施外，其他处理两者的叶尖枯率无显著差异。
图3 不同赤霉素质量浓度与喷施次数对春兰开花率和形态指标的影响Fig.3 Effects of different concentrations of gibberellin and spraying times on flowering rate and morphological indexes of Cymbidium goeringii
2.4 低温结合赤霉素综合作用对春兰开花率与形态指标的影响
低温和赤霉素处理均可促进春兰提前开花，为研究两者的综合作用，以清水为对照，对自然低温处理30 d的春兰分别喷施60、90、120、150 mg·L-1赤霉素，结果如图4所示。相较于对照(开花率9.67%)，喷施赤霉素有利于提高开花率，其中喷施60 mg·L-1赤霉素时开花率最高，达到52.05%，比对照提升了42.38百分点；
随着赤霉素质量浓度的继续增加，开花率随之降低，但当赤霉素质量浓度达到150 mg·L-1时，开花率仍显著高于对照。
图4 低温处理后不同质量浓度赤霉素对开花率与形态指标的影响Fig.4 Effects of different concentrations of gibberellin on flowering rate and morphological indexes after low temperature treatment
形态指标测定结果表明，花葶高度随赤霉素质量浓度增加呈先上升后下降的趋势，其中，喷施60 mg·L-1赤霉素花葶高度最高，达到12.23 cm。赤霉素处理的花朵长度和花朵高度均高于对照，但随赤霉素质量浓度增加并不呈现明显的变化规律(图4-C)。
对低温结合赤霉素处理的春兰进行黄叶率和叶尖枯率统计，结果表明，黄叶率随赤霉素质量浓度的升高逐步增加(图4-A、4-D)：当赤霉素质量浓度为0 mg·L-1时，叶黄率为4.24%；
赤霉素质量浓度增加至150 mg·L-1时，叶黄率高达48.01%，比对照高43.77百分点。赤霉素处理后叶尖枯率均显著高于对照，但不同处理质量浓度之间的差异不显著；
除150 mg·L-1赤霉素处理的叶尖枯率高于对照外，其他处理之间叶尖枯率无显著差异。
2.5 低温、赤霉素联合处理对春兰花期生理指标的影响
春兰开花后相关营养物质含量和酶活性会发生变化，比较分析了不同处理组合春兰在春节前24 d开花时叶片中可溶性糖、可溶性蛋白含量与SOD、CAT、POD活性的差异。结合表1和图4-B中的开花率数据可以看出，叶片中可溶性糖含量与开花率有一定联系，随着开花率的升高春兰叶片可溶性糖含量总体呈现下降趋势，其中，开花率最高的处理(60 mg·L-1赤霉素)可溶性糖含量最低，为1.07%，开花率最低的对照组可溶性糖含量最高，为1.70%。叶片中可溶性蛋白的含量也随着开花率增加总体呈现降低趋势，其中开花率最高的处理组(60 mg·L-1赤霉素)可溶性蛋白含量最低，为8.90%，赤霉素质量浓度继续增加，开花率逐渐降低，可溶性蛋白含量逐渐上升。比较分析发现，SOD和CAT活性在0～120 mg·L-1赤霉素处理下差异不显著，当赤霉素达到150 mg·L-1时，SOD和CAT活性与对照相比显著升高。POD活性随着赤霉素质量浓度增加呈现先下降再上升的趋势。
表1 低温与赤霉素处理后春兰花期生理指标
春兰花芽分化不需要低温诱导，但花芽发育过程却需要经过一段低温时期。低温来临前花芽中的一些关键物质浓度处于较低水平，进入低温期之后，花芽休眠逐渐被解除，使得花芽中的一些关键物质得以累积，最终具备抽葶放花的物质基础；
当气温回升后，外界的温度信号通过植物体的信号传递系统使得植物体完成开花前最后的一系列生理生化反应，花芽最终完成了抽葶放花的过程[1，15]。以往研究表明，如果不经历低温春化，春兰会出现花芽干瘪枯死现象；
本研究发现，不经低温处理的春兰开花率仅为2.5%，且花葶高度、花朵长、花朵高等指标均小于低温处理的植株，表明适当的低温处理不仅可以促进春兰提前开花，也可以提高春兰开花的品质。
赵虎等[1]在绍兴地区以春兰为研究对象，发现经过3～6 ℃低温处理40 d后，开花率明显高于未经处理的植株。本研究也有类似发现，低温处理10～30 d均可诱导春兰提前开花，由于不同地域、不同年份温度条件不同，处理天数无法作为低温处理的精确指标，故本研究以低于5 ℃的温度累加作为有效低温时数，研究结果表明，105～350 h有效低温时数均可以一定程度诱导春兰提前开花，生产上低温诱导开花需结合当地气温，考虑选择适宜的低温天数。此外，本研究探索了低温处理后的最佳保温条件，这在以往对春兰花期调控的研究中未见报道，30 d自然低温处理后置于均温17～20 ℃的玻璃温室培养30 d，春节前15 d开花率可达到78.57%，远高于置于单层塑料大棚(6～8 ℃)的植株。实际生产中考虑到整个观赏期的持续性，开花率和花苞数的合适比例，玻璃温室中培养的春兰可以提前30 d及以上时间上市，双层大棚和塑料温室的开花率为31%左右，也可以达到春兰年宵花要求，还可以节约设施投入成本和加温成本。
赤霉素GA3是常用于诱导开花、打破休眠的一类植物生长调节剂[5，16-17]，本研究探索了不同质量浓度赤霉素处理对于春兰花期调控的影响，同时比较了单次和两次喷施的不同效果。从单次喷施来看，赤霉素质量浓度从0升高到60 mg·L-1，开花率呈上升趋势，当赤霉素质量浓度从60 mg·L-1增加到90 mg·L-1时，开花率基本没有变化。质量浓度继续增加开花率反而呈下降趋势，这说明适宜浓度的赤霉素可以促进开花，而过高过低均效果不好，甚至可能抑制开花。两次喷施GA3有同样的变化趋势，区别是比单次喷施变化幅度小，这与李博[18]的研究结果相似。此外，低浓度多次喷施可达到单次高浓度喷施的效果，选择单次高浓度喷施更省时省力。与低温处理相比，赤霉素处理对春兰花期调控作用不佳，开花率最高只能达到28.83%，这与赵虎等[1]的研究结果一致。赤霉素喷施还会造成叶害，降低整体观赏性。经过自然低温再结合赤霉素喷施，春兰开花率可达到52.05%，比对照提高42.38百分点，赤霉素或许可以放大低温处理的效果，这与史益敏等[19]的研究结果相似。
研究表明，植物进入花芽分化期会快速积累可溶性糖和可溶性蛋白，这些营养物质的累积为花芽分化提供重要的基础物质，其含量在花芽分化时期达到峰值[7]。本研究发现，处于开花期的春兰叶片可溶性糖和可溶性蛋白含量与开花率呈负相关，即开花率越高可溶性糖和可溶性蛋白含量越低，推测可能是由于开花需要消耗大量内含物，而这些内含物来源于叶片的供应。抗氧化物酶是植物体内重要的保护酶，通过清除超氧自由基、氢氧根离子等活性氧，保障植物生长发育有序进行。在竹叶兰花芽分化期，体内SOD、POD和CAT活性上升至峰值[8]。本研究中，0～120 mg·L-1赤霉素处理条件下，春兰叶片SOD和CAT活性没有显著变化，POD活性变化无规律，但当赤霉素质量浓度达到150 mg·L-1时，SOD、POD和CAT活性显著上升，推测是由于高浓度赤霉素处理对植物造成胁迫，导致体内活性氧累积，从而诱导抗氧化物酶活性增加。抗氧化物酶在体内的变化受植物生长发育、开花、逆境胁迫等多种因素影响，其与开花之间的是否存在关联仍有待进一步明确。此外，目前兰科植物花发育分子机理研究主要集中于花器官形态建成方面，对于开花时间的研究较少，仅克隆到了少量的同源基因[20]。今后可将花期调控与兰花开花调控的分子机理研究相结合，进行更深层次的研究。
本研究筛选出了经济便捷的春兰促成栽培方案，低温处理诱导春兰开花的有效低温时长为105～350 h，过短过长均不利于其成花。低温处理后的保温培养条件对开花率和花葶高度影响显著，促进花期提前、提高观赏性的最佳温度处理组合是对春兰先进行30 d自然低温处理，再置于17～20 ℃的玻璃温室培养30 d，春节期间开花率可达到78.57%，花葶高度达到12.64 cm；
赤霉素处理效果整体不如低温，但对低温处理的春兰喷施适宜浓度的赤霉素可以放大低温处理的效果，进一步提高开花率。
