MiR-211-5p在原发性高血压患者血清中的表达及对血管内皮细胞凋亡和炎性反应的影响
时间：2023-04-17 17:10:06 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
王丹，王瑶瑶，瞿金念，谢相屹
高血压是临床常见疾病，分为原发性和继发性两种，原发性高血压占比高达50%以上，好发于60岁以上老年人，病因至今尚未完全阐明[1,2]。长期患有高血压可造成体内多个器官产生损害（如心、脑、肾脏、血管等），严重者可引起死亡[3]。AngⅡ是肾素-血管紧张素系统的活性物质，能够诱导血压升高[4]，对人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）具有调节作用，具有促进HUVECs增殖、迁移和血管形成等作用[5]。miRNA是单链小分子RNA，不能编码蛋白质，广泛存在哺乳动物中，通过靶向结合mRNA 3"非翻译区，参与心血管疾病、肿瘤等发展[6,7]。越来越多的研究结果显示，miRNA与高血压发展密切相关[8]，如miR-211-5p在自发性高血压大鼠中表达下调[9]，具体研究目前尚无明确报道。在线软件预测显示，EGR1是miR-211-5p靶基因之一，此前报道显示，EGR1在肺动脉高血压患者中表达上调[10]，miR-124-3p通过下调EGR1表达抑制AngⅡ诱导的HUVECs凋亡和氧化应激，促进细胞增殖和转移[11]。因此，研究采用AngⅡ诱导HUVECs建立细胞损伤模型，探究miR-211-5p在原发性高血压患者血清中的表达以及对AngⅡ诱导的血管内皮细胞凋亡和炎性反应的影响。
1.1 细胞和主要试剂HUVECs购自美国ATCC公司；
胎牛血清、RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；
AngⅡ购自美国Sigma公司；
miR-NC、miR-211-5p、pcDNA、EGR1、引物由上海生工设计合成；
Lipofectamine 2000试剂盒购自上海研卉生物公司；
Trizol试剂盒、反转录试剂盒、SYBR Green PCR Master Mix试剂盒购自赛默飞公司；
CCK8试剂盒、凋亡试剂盒购自北京索莱宝公司；
Cleaved cas-3抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体、EGR抗体1、GAPDH购自美国Abcam公司；
辣根过氧化物酶标记的二抗购自武汉艾美捷科技；
肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒、白介素-1β（IL-1β）试剂盒购自上海江莱生物公司；
双荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司。
1.2 样本收集选取2019年12月至2021年5月于贵州中医药大学第一附属医院心内科确诊为原发性高血压患者30例，年龄57～83岁，男性17例，女性13例，原发性高血压诊断标准：坐位收缩压（SBP）≥140 mmHg、舒张压（DBP）≥90 mmHg（1 mmHg=0.133kPa）。排除标准：继发性高血压者；
慢性肾病者；
心肺衰竭者；
癌症等。另选取21例在本院体检的人群作为健康对照，年龄44～72岁，男性10例，女性11例。本研究已获我院伦理委员会批准同意，患者及家属对本研究均知情同意。
1.3 细胞培养和分组HUVECs用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养细胞，置于5%CO2、37 ℃的培养箱中培养。取对数期HUVECs接种到96孔板中，×106mol/ml的AngⅡ干预细胞，干预前按Lipofectamine 2000试剂盒说明书将miRNC、miR-211-5p、miR-211-5p和pcDNA、miR-211-5p和EGR1转染至HUVECs中，记为AngⅡ组、AngⅡ+miR-NC组、AngⅡ+miR-211-5p组、AngⅡ+miR-211-5p+pcDNA组、AngⅡ+miR-211-5p+EGR1组，其中正常培养细胞作为Control组。
1.4 qRT-PCR检测miR-211-5p、EGR1 mRNA表达水平收集健康对照血清、原发性高血压患者血清以及培养48 h各组HUVECs，用Trizol法提取细胞总RNA，检测定量浓度后，反转录合成cDNA，以cDNA作为模板，按照SYBR Green PCR Master Mix试剂盒说明书步骤进行扩增反应。反应条件为95℃预变性30 s，95 ℃反应5 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。以U6、GAPDH作为内参，用2-ΔΔCt法计算miR-211-5p、EGR1 mRNA表达水平。miR-211-5p正向引物：5"-GATGCT GTAATGGATGATATGA-3"，反向引物：5"-AT TGGAACGATACAGAGAAGATT-3"；
U6正向引物：5"-CTCGCTTCGGCAGCACA-3"，反向引物：5"-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3"。EGR1正向引物：5"-ACTTAAAGGACAGGAGGAGGAGATGG-3"，反向引物：5"-AGGGAGGACTTGGCTCTGAG AAC-3"；
GAPDH正向引物：5"-ACCCACTCCTCC ACCTTTGAC-3"，反向引物：5"-TGTTGCTGTAG CCAAATTCGTT-3"。
1.5 CCK8法检测细胞增殖活性收集对数期HUVECs，按照1.3法处理细胞接种96孔板中，培养箱培养48 h，加入10 μl CCK-8试剂，继续培养4 h，用酶标仪检测450 nm处检测细胞光密度值（A），细胞活性（%）=实验组A值/对照组A值×100%。
1.6 流式细胞术检测细胞凋亡收集培养48 h各组HUVECs使用预冷缓冲液洗涤细胞3次，将5 μl的Annexin V FITC和PI试剂添加到500 μl细胞悬液内，混匀后避光反应15 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.7 Western blot检测Cleaved cas-3、Bax、Bcl-2、EGR1蛋白表达收集培养48 h各组HUVECs加入150 μl RIPA裂解液，置于冰上反应30 min，提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，取蛋白样品置于10%SDS-PAG凝胶电泳内分离蛋白样品，转移至PVDF膜上，脱脂奶粉封闭90 min，加入Cleaved cas-3、Bax、Bcl-2、EGR1、GAPDH抗体，4 ℃孵育过夜，室温加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育90 min，用ECL显色、曝光。以GAPDH抗体，Quantity One分析条带的密度值。
1.8 ELISA法检测TNF-α、IL-1β表达收集培养48 h各组HUVECs，4 ℃、12 000 r/min离心15 min收集细胞上清液，利用TNF-α试剂盒、IL-1β试剂盒说明书步骤，检测TNF-α、IL-1β表达。
1.9 双荧光素酶实验检测miR-211-5p、EGR1靶向关系在线软件预测miR-211-5p、EGR1存在互补结合位点，而后构建EGR1 3"UTR的突变型荧光素酶载体和野生型荧光素酶载体（EGR1 MUT、EGR1 WT），而后分别于miR-NC或miR-211-5p共转染至HUVECs中，转染48 h，采用双荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性。
1.10 统计学分析用SPSS 20.0软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 miR-211-5p在原发性高血压患者血清中的表达与健康对照比较，原发性高血压患者血清中miR-211-5p表达水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），表1。
表1 miR-211-5p在原发性高血压患者血清中的表达
2.2 过表达miR-211-5p对AngⅡ诱导HUVECs增殖活性和凋亡的影响与Control组比较，AngⅡ组中miR-211-5p表达水平、细胞活性、Bcl-2蛋白表达显著降低，凋亡率、Cleaved cas-3、Bax蛋白表达显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；
与AngⅡ+miR-NC组比较，AngⅡ+miR-211-5p组中miR-211-5p表达水平、细胞活性、Bcl-2蛋白表达显著增加，凋亡率、Cleaved cas-3、Bax蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），图1及表2。
表2 过表达miR-211-5p对AngⅡ诱导HUVECs增殖活性和凋亡的影响
图1 过表达miR-211-5p对AngⅡ诱导HUVECs凋亡的影响
2.3 过表达miR-211-5p对AngⅡ诱导HUVECs炎性反应的影响与Control组比较，AngⅡ组中TNF-α、IL-1β表达显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；
与AngⅡ+miR-NC组比较，AngⅡ+miR-211-5p组中TNF-α、IL-1β表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），表3。
表3 过表达miR-211-5p对AngⅡ诱导HUVECs炎性反应的影响
2.4 miR-211-5p调控EGR1表达StarBase在线数据库预测显示，miR-211-5p和EGR1存在互补结合位点，图2。与miR-NC组相比，miR-211-5p组中EGR1 MUT荧光素酶活性没有显著变化，EGR1 WT荧光素酶活性显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），表4。
表4 双荧光素酶报告实验
图2 miR-211-5p和EGR1存在互补结合位点
2.5 转染miR-211-5p后EGR1表达与Control组比较，AngⅡ组中EGR1 mRNA和蛋白表达显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；
与AngⅡ+miR-NC组比较，AngⅡ+miR-211-5p组中TEGR1 mRNA和蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），图3及表5。
表5 转染miR-211-5p后EGR1表达
图3 转染miR-211-5p后EGR1蛋白表达
2.6 上调EGR1可逆转过表达miR-211-5p对AngⅡ诱导HUVECs增殖活性、凋亡和炎性反应的影响与AngⅡ+miR-211-5p+pcDNA组比较，AngⅡ+miR-211-5p+EGR1组中EGR1 mRNA及蛋白表达水平、凋亡率、Cleaved cas-3、Bax蛋白表达显著增加，细胞活性、Bcl-2蛋白表达显著降低，TNF-α、IL-1β表达显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05），图4及表6。
图4 上调EGR1可逆转过表达miR-211-5p对AngⅡ诱导HUVECs凋亡的影响（A：凋亡图；
B：凋亡相关蛋白表达）
表6 上调EGR1可逆转过表达miR-211-5p对AngⅡ诱导HUVECs增殖活性、凋亡和炎性反应的影响
多数研究结果显示，AngⅡ诱导HUVECs常用于建立高血压损伤模型[12,13]。血管内皮损伤是引起高血压在内的心血管疾病的重要原因之一[14]，细胞凋亡、炎性反应与血管内皮损伤密切相关[15]。本研究AngⅡ诱导HUVECs建立高血压细胞损伤模型，结果显示，AngⅡ抑制HUVECs增殖，促进细胞凋亡和炎性反应，提示模型构建成功。
近年研究结果显示，miRNA与血管内皮细胞损伤密切相关[16]，如miR-384在AngⅡ处理的HUVECs中低表达，过表达miR-384能抑制AngⅡ处理的HUVECs凋亡和氧化应激[17]。Luo等[18]研究结果显示，miR-590-5p在AngⅡ处理的HUVECs中低表达，miR-590-5p通过下调LOX-1表达抑制AngⅡ处理的HUVECs凋亡和氧化应激。miR-211-5p在肺动脉高血压、舌鳞状细胞癌、骨关节炎等低表达[9,19,20]，可参与细胞增殖、凋亡和炎症反应等过程。但是miR-211-5p在原发性高血压及AngⅡ诱导HUVECs的研究尚不清楚，鉴于此，本研究主要观察miR-211-5p在原发性高血压患者血清中的表达及对AngⅡ诱导HUVECs增殖活性、凋亡和迁移的影响。研究结果显示，miR-211-5p表达水平在原发性高血压患者血清和AngII诱导HUVECs中低表达，提示miR-211-5p可能与高血压发展有关。将过表达miR-211-5p转染AngⅡ诱导HUVECs内，结果显示细胞活性、Bcl-2蛋白表达增加，凋亡率、Cleaved cas-3、Bax蛋白表达降低，TNF-α、IL-1β表达降低，提示过表达miR-211-5p可抑制AngⅡ诱导HUVECs损伤。
EGR1是即刻早期基因家族成员，位于人的染色体5q23-q31区域，广泛存在人体器官内，在癌症、免疫疾病和心血管疾病中广泛表达[21-23]。在心肌纤维化小鼠模型中，EGR1在心肌纤维化细胞中高表达，敲低EGR1改善了心机纤维环严重程度，抑制细胞凋亡[24]。还有研究结果显示，miR-217负调节EGR1表达抑制ox-LDL诱导的主动脉内皮细胞炎性损伤[25]。在线软件预测显示，miR-211-5p和EGR1存在互补结合位点，双荧光素酶报告实验和qRT-PCR实验均验证miR-211-5p调控EGR1表达。研究结果发现，AngⅡ诱导HUVECsEGR1 mENA和蛋白表达升高，过表达miR-211-5p降低EGR1 mENA和蛋白表达，说明miR-211-5p负调控EGR1表达。进一步实验结果显示，上调EGR1可逆转过表达miR-211-5p对AngⅡ诱导HUVECs增殖活性、凋亡和炎性反应的影响，提示miR-211-5p负调控EGR1表达制AngⅡ诱导HUVECs损伤。
综上所述，原发性高血压患者血清内miR-211-5p低表达，过表达miR-211-5p可减轻AngⅡ诱导HUVECs凋亡和炎性反应，其作用机制可能与EGR1表达有关。
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