CHO细胞表达重组人生长激素-Fc融合蛋白糖基化类型的优化

张凯宁，刘涵，朱秋媚，富锐丽，刘玉林，孙瑞欣，刘景会，赵竞男，韩雪容

1.长春理工大学生命科学技术学院，吉林 长春 130000；
2.长春生物制品研究所有限责任公司细胞因子室，吉林 长春 130000

人生长激素（human growth hormone，hGH）是一种由人脑垂体前叶的嗜酸性细胞分泌的蛋白质类激素，含有191个氨基酸分子，相对分子质量为22 000，编码GH的基因位于17号染色体上，总长度约6.5万个碱基。本研究使用的重组人生长激素-Fc 融合蛋白（rhGH-Fc）采用IgG4的Fc 段通过一段柔性多肽与rhGH 相连接，并采用S228P 突变防止IgG4 解离成半分子，同时也可抑制Fab-臂交换现象来增强稳定性，采用V308P 突变增强与FcRn 的亲和力延长半衰期。N-糖基化的修饰位点为Asn-X-Ser／Thr（其中X为除了Pro 以外的任意氨基酸），当蛋白类药物含有N-糖基化修饰位点时，在蛋白转录后翻译便会进行糖基化修饰。人IgG分子的重链Asn297为N-糖基化修饰位点，抗体分子的N-糖基化修饰与其他蛋白相似，由一个预装配好的Glc3Man9GlcNAc2 寡糖链通过内质网上的寡糖转移酶复合物（oligosaccharyltransferase，OST）从焦磷酸长醇糖脂载体（dolichol-ohosphate lipid，DoI-P-P）转移到IgG重链的Asn297上，通过内质网α-葡糖糖苷酶Ⅰ、α-葡糖糖苷酶Ⅱ（α-glucosidaseⅠ／Ⅱ）以及内质网α-甘露糖苷酶修饰形成Man8GlcNAc2，转移到高尔基体顺面的网络结构（cis-golgi network，CGN）后，另外3 个甘露糖被高尔基体甘露糖苷酶切掉，形成1 个Man5GlcNAc2。进入高尔基体中间膜囊（medial gdgi）后，N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅰ（N-acetylglucosaminyltransferase-Ⅰ，GnTⅠ）就会介导Glc-NAc 从 UDP-GlcNAc 转移到 Man5GlcNAc2 寡糖链的α-1-3 分支上，再从α-1-6 分支上切除2 个甘露糖残基，就得到了GlcNAcMan3GlcNAc2，转移至高尔基体反面的网络结构（trans golginetwork，TGN）之前再经GnTⅡ作用下，将GlcNAc从UDP-GlcNAc转移到Man-5GlcNAc2 寡糖链的α-1-6 分支上，形成GlcNAc2Man 3GlcNAc2保守双天线结构。转移至TGN后，通过特定的单糖转移酶，在糖链上加入Gal、GlcNAc、唾液酸（NANA或NGNA），从而形成不同的N-糖基化修饰［1-2］。

通过降低G0F 含量与提高G2F 含量，理论上可降低高甘露糖修饰，提高唾液酸修饰（主要糖型一般为G0、G1和G2，F为岩藻糖）。此需求常见的添加物为半乳糖、尿苷、锰离子，其中半乳糖和尿苷可为糖基化修饰提供原料，而锰离子可提高酶的活性，均可使糖基化修饰正向进行。由于修改糖基化修饰时需对培养基成分做出改变，可能会影响细胞正常代谢。本研究采用市售已有一定经验的商业化培养基添加至原补料培养基中进行糖基化修饰调整。为了减少目的蛋白中高甘露糖修饰的含量，采用3 种补料方式对目的蛋白糖基化修饰进行优化，以获得更优的糖基化比例及更低含量的高甘露糖。

1.1 细胞 rhGh-Fc 工程细胞由长春生物制品研究所有限责任公司细胞因子室构建，所用CHO-K1 工程细胞株为比洋生物技术有限公司构建。

1.2 主要试剂 ActiPro、Cell Boost 7a和Cell Boost 7b购自美国Hyclone公司；
SHEFF-CHO PLUS PF ACF购自美国Kerry公司；
EX-CELL Glycosylation Adjust购自德国Merck公司；
EfficientFeed C+AGT Supplement&GlycanTune C+Total Feed购自美国Gibco公司；
Glyco WorksRapiFluor-MS N-糖分析试剂盒和色谱柱ACQUITY UPLC®Glycan BEH Amide，130 Å（1.7 μm，2.1 mm ×150 mm）购自美国Waters公司。

1.3 细胞复苏 提前向Actipro 培养基中加入0.5%（v／v）体积的抗细胞结团剂，取20 mL培养基于75 cm2方瓶中，置37 ℃，5%CO2培养箱中预温30 min 备用。从液氮罐中取出1 支工作细胞，于37 ℃水浴锅中迅速融化，将细胞悬液加入预先预温的培养基中，混匀后置37 ℃，5%CO2孵箱中培养24 h。

1.4 细胞种子液制备 取40 mL 培养基于125 mL 摇瓶中，置37 ℃，5% CO2摇床中预温30 min 备用。将方瓶中培养24 h 的细胞液全部转移至50 mL 离心管中，112 ×g离心10 min，弃上清，取6 mL 预温好的培养基复溶细胞沉淀，复溶后将全部培养基转移至125 mL 摇瓶中，混匀后置37 ℃，5% CO2摇床中培养24 h。取 120 mL 培养基于 500 mL 摇瓶中，置 37 ℃，5%CO2摇床中预温30 min备用。将摇瓶中培养24 h的细胞液全部转移至500 mL 摇瓶中，此后每天取样，用细胞计数仪计数，待细胞密度达2×106个／mL时，同样方法分至2 个摇瓶中。待4 个摇瓶中细胞密度达 2 × 106个／mL 时，按 3 × 105个／mL 的密度接种至生物反应器中继续培养。

1.5 7 L生物反应器培养 生物反应器灭菌后，待反应器罐体温度降至40 ℃以下，向罐体中泵入50%（v／v）体积最大工作体积Actipro培养基，通气设置为0.02 vvm。待溶氧电极极化完毕后，进行溶氧参数校正并设置反应器操作参数：转速、温度、pH、溶解氧、通气速率。待参数稳定后，接种细胞开始培养，第3 天后开始取样、计数、测定生化代谢参数以及渗透压。并于第3 天后开始每天补加不同补料培养基，至培养液葡萄糖终浓度为4 g／L，对目的蛋白糖基化修饰进行优化（第1种糖基化修饰方案为Gly-1：采用原有的补料培养基Cell Boost 7a&7b 基础上添加EX-CELL Glycosylation Adjust 培养基，该培养基中不含葡萄糖，含半乳糖及尿苷，其他成分未知；
第2 种糖基化修饰方案为Gly-2：采用原有的补料培养基Cell Boost 7a&7b 基础上添加 SHEFF-CHO PLUS PG ACF 培养基，该培养基中不含葡萄糖，含促生长因子，其他成分未知；
第3 种糖基化修饰方案为Gly-3：采用EfficientFeed C + AGT Supplement& GlycanTune C + Total Feed补料培养基，两种培养基均含葡萄糖22.3 g／L，含半乳糖及尿苷，其他成分未知），以只添加原有补料培养基Cell Boost 7a&7b 作为空白对照组（STD）。当细胞数达（1.2 ～ 1.5）× 107个／mL 时进行降温培养，7 d 后离心收获上清。糖基化修饰各批次培养条件见表1。

表1 糖基化修饰各批次培养条件Tab.1 Culture conditions for each batch of glycosylation modification

1.6 rhGH-Fc蛋白纯化 将收获后的培养液112×g离心10 min后收集上清液，再继续7 155×g离心20 min后收集上清液，使用1 mol／L 醋酸钠溶液调整pH至 4.50 ～ 5.00，15 min 后7 155 ×g离心30 min，使用1 mol／L Tris溶液调整pH至7.40左右。使用0.45 μm滤膜过滤澄清留用。用0.2 mol／L NaOH溶液（2 CV）对耐碱Protein A亲和层析柱进行预处理，再用2 mol／L NaCl 溶液走至基线平稳，换成预冷注射用水走至基线平稳，更换平衡液（50 mmol／L Tris+150 mmol／L NaCl溶液，pH 7.40）走至基线平稳后进行紫外调零。将平衡液更换为澄清后的样品，样品全部上完后更换为平衡液继续走10 CV。将平衡液更换为淋洗液（100 mmol／L Gly + 1 mol／L 尿素溶液）进行淋洗。淋洗完毕后更换为洗脱液（100 mmol／L Gly-HCl 溶液，pH 3.40）进行洗脱，收集蛋白时使用1 mol／L Tris 溶液立即调整pH 至中性范围。洗脱完毕后，使用0.2 mol／L NaOH 溶液（2 CV）对Protein A 亲和层析柱进行处理，再使用2 mol／L NaCl 溶液走至基线平稳，换成pH 7.0 的PB 溶液保存 Protein A 亲和层析柱。

1.7 糖基化修饰检测

1.7.1 样品前处理 使用Glyco Works RapiFluor-MS N-糖分析试剂盒对样品进行前处理。

1.7.2 样品检测

1.7.2.1 色谱条件色 谱柱：ACQUITY UPLC®Glycan BEH Amide，130 Å（1.7 μm，2.1 mm × 150 mm）；
流动相A：50 mmol／L甲酸铵溶液（pH 4.4）；
流动相B：100%乙腈；
上样量：10 μL；
流速：0.25 mL／min；
FLR检测波长EX 265／EM 425 nm。洗脱方法见表2。

表2 糖基化检测洗脱方法Tab.2 Elution method of glycosylation detection

1.7.2.2 质谱条件 MS 模式采集数据；
毛细管电压：2 000 V；
Cone 电压：40 V；
去溶剂气体温度：300 ℃；
源温：100 ℃；
去溶剂气体流速：800 L／h，扫描范围（m／z）：500 ～ 2 000，采集时间0 ～ 55 min。

2.1 代谢过程产物检测结果 Gly-1、Gly-3 最大细胞数较STD 培养时略低，约为1.7 × 107个／mL，其中Gly-3补料流加体积较STD培养时多65%左右，Gly-1、Gly-2与STD补料流加体积基本一致。

Gly-2 开始补料后细胞数不再增多，约为1.0 ×107个／mL，整体生长曲线与STD 基本一致。Gly-1、Gly-3 补料时含半乳糖，使乳酸在补料后开始消耗，整个培养周期均处于较低水平，Gly-2 补料后乳酸开始上升，但始终处于正常范围内。Gly-1、Gly-2 是在原补料基础上额外添加小体积培养基，整体渗透压变化水平与STD 一致，Gly-3 由于采用不同的补料培养基，该补料培养基渗透压较原培养基低，且补料流加体积增多，整个培养周期渗透压均处于290 ～350 mOsm／kg。3 种补料方案的铵离子变化曲线与STD基本一致。见图1。

图1 3批代谢过程产物检测结果Fig.1 Detection results of metabolic process products in three batches

2.2 蛋白纯化结果 Gly-1、Gly-2、Gly-3 批次纯化后蛋白浓度分别为0.61、0.66 和0.72 g／L。

2.3 糖基化检测结果 经检测，Gly-1、Gly-2、Gly-3的G0F 分别为32.89%、58.66%、33.28%，G1F 分别为31.39%、18.03%、34.90%，G2F分别为31.39%、18.03%、34.90%，Gly-1 与Gly-3 使目的蛋白含有更少的G0F及更多的G2F。3 种补料方式的糖基化FLR 谱图见图2。

图2 3批糖基化FLR谱图Fig.2 FLR spectra of glycosylation in three batches

Gly-1、Gly-2、Gly-3 的具体糖基化修饰类型见表3，其中Gly-3 补料方案在高甘露糖修饰方面较其他两种方案更少，可进一步研究。研究结果表明，高甘露糖修饰含量Gly-3相对较低，达4.23%。

表3 各批次糖基化修饰类型（%）Tab.3 Glycosylation modification types of each batch（%）

人用药品注册技术国际协调会议（International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use，ICH）Q5E 和Q6B 中对糖的控制有如下描述：对于糖蛋白，应测定其糖含量（中性糖、氨基糖和唾液酸），另外，需尽可能地分析糖链结构、寡糖谱（天线类型）及糖基化位点。美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）的“治疗性蛋白免疫原性评价行业指南”和欧洲药品管理局（European Medicines Agency，EMA）2007 年发表的单抗各论中均对糖分析有所要求，其中单抗各论中描述“应对糖型进行表征，尤其应关注甘露糖化、半乳糖化、岩藻糖化和唾液酸化，应测定所存在的主要糖型（一般为G0、G1 和G2）”。《中国药典》三部（2020 版）“人用重组DNA 技术产品总论”中理化特性分析部分的“糖基化修饰”中要求对糖基化修饰进行全面的分析和确定，如糖基化修饰与制品半衰期和生物学活性相关，则应确定糖的含量（中性糖、氨基糖和唾液酸）。糖型的结构可能与不良反应相关（如非人类的糖型结构或其残基），应尽可能对糖链的结构、糖型以及多肽链的糖基化位点进行深入分析［3］。甘露糖基化（mannose，Man）可与甘露糖受体结合促进蛋白在体内快速清除，导致半衰期缩短，促进与FcγRⅢa 的结合，提高抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）活性［4-5］，抑制与C1q的结合，降低补体依赖细胞毒性（complement-dependentcytotoxicity，CDC）活性［6-7］。岩藻糖基化（fucose，Fuc）抑制与 FcγRⅢa 的结合，降低 ADCC 活性，通过去Fuc可显著提高ADCC活性［8-9］。半乳糖基化（galactose，Gal）暴露可能会加速蛋白的清除，促进CDC 活性［10-11］。N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）可促进与FcγRⅢa的结合，提高ADCC 活性，还可加速蛋白的清除［12-14］。NANA 唾液酸修饰可显著降低蛋白的清除作用，延长半衰期，还具有抗炎作用，NGNA 唾液酸修饰可抑制与FcγRⅢa 的结合，降低ADCC 活性［15-17］。蛋白多糖的糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）部分蛋白糖基化和合成是不固定的，不同生物体、不同细胞类型、甚至不同的培养条件均会产生显著的异质性。CHO细胞系为所有啮齿动物细胞系中与人的糖基化修饰相似度最高的，但仍会产生如Gal-α-1、3-Gal、Neu5Gc这样具有免疫原性的糖基化修饰。而且CHO细胞本身缺乏α-2，6-唾液酸转移酶（α-2，6-SiaT）、β-1，4-N-乙酰葡糖胺转移酶（β-1，4-N-acetylg-lucosaminyltransferase，GnT-Ⅲ），无法在糖链末端添加α-2，6-唾液酸与β-1，4-N-乙酰葡糖胺［18］。蛋白类常见的N-糖基化修饰见图3［19］；
CHO细胞中的糖基化修饰途径见图4［20］。

图3 治疗性蛋白药物的主要N-糖基化修饰类型Fig.3 Major N-glycosylation modification types of therape-utic protein drugs

图4 CHO细胞的糖基化修饰Fig.4 Glycosylation modificationin CHO cells

糖基化修饰本身也是酶促反应，通过改变对应的底物浓度或相关酶的活性，可在一定程度上控制蛋白的糖基化修饰。不同的蛋白类药物对糖基化的需求不同，可通过改变不同的糖基化类型改善ADCC、CDC活性，延长药物半衰期［21］。本研究中表达的蛋白rhGH-Fc为长效化GH，本身并不依靠ADCC、CDC活性发挥效用，因此采用了本身ADCC活性、CDC活性低的IgG4 作为结合蛋白，在糖基化的选择上也不需要ADCC、CDC，因此将延长半衰期作为本研究糖基化调整的目的。将高甘露糖修饰比例降低为所有具有Fc片段的药物的共识，虽然其他糖基化类型也被报道可能影响药物半衰期，但高甘露糖修饰对药物半衰期的影响远超其他糖基化类型的修饰，在药物开发时作为重点糖基化修饰类型关注。虽然唾液酸修饰可延长药物半衰期，但由于CHO细胞宿主本身表达蛋白时唾液酸修饰水平低，对药物半衰期影响有限。与其他两个方案相比，Gly-3 方案细胞整体糖基化修饰获得了更少的G0F与更多的G2F，rhGH-Fc高甘露糖修饰含量降至4%左右，唾液酸修饰水平仍较低，为1%左右。

综上所述，通过对目的蛋白糖基化修饰的类型及含量分析可知，EfficientFeed C+AGT Supplement&GlycanTune C+Total Feed 培养基对于改善目的蛋白糖基化修饰可能具有更好的效果，本研究对于CHOK1表达rhGH-Fc融合蛋白工艺的优化以及后期糖基化修饰的分析提供了参考。

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