连翘苷对体内外鼻咽癌血管新生的影响

李绍霄， 李邦亮

（1.温州医科大学附属平阳医院耳鼻喉科，浙江温州 325400；
2.温州医科大学附属瑞安医院耳鼻喉科，浙江温州 325299）

鼻咽癌作为一种好发于我国南方、东南亚和北非地区的恶性肿瘤，近20%的鼻咽癌患者在确诊时出现远处脏器转移[1]。鼻咽癌血供丰富，其血管分布密度与鼻咽癌的多种恶性生物学行为相关，从而导致鼻咽癌患者的预后较差[2-3]。目前，已有诸多抗血管生成靶向药物如血管内皮生长因子（VEGF）单抗——贝伐珠单抗、重组人血管内皮抑制素、抗血管生成蛋白——阿柏西普等应用于鼻咽癌临床化疗，但鼻咽癌患者对此类靶向药物多存在一定的毒性反应和耐药现象，鼻咽癌患者总体生存率提高缓慢[4-5]。

鼻咽癌归属于中医学“鼻渊”“真头痛”“石上疽”等范畴，肺热痰火及肝胆热毒上扰为鼻咽癌发病主要原因。连翘为木犀科植物连翘Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl 的干燥果实，味苦，性微寒，归肺、心、小肠经，具有清热解毒、消肿散结、疏散风热功效，用于痈疽、瘰疬、乳痈、丹毒、温热入营、高热烦渴、神昏发斑、热淋涩痛等病证。连翘苷作为中药连翘中的标识性成分，其分子结构为木脂苷，分子式为C27H34O11，分子量为534，具有抗菌、抗氧化、抗炎等多种生物学功效[6-8]。研究[9-12]发现，连翘苷具有抗子宫癌、前列腺癌和肺癌的作用；
但连翘苷抗鼻咽癌效应尚不明确。本研究通过体内、体外实验观察连翘苷对鼻咽癌的治疗作用及机制，以进一步探明连翘苷的抗肿瘤机制，现将研究结果报道如下。

1.1 细胞株 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）购自美国Sciencell 公司；
人鼻咽正常上皮细胞系NP69和鼻咽癌细胞系HNE1和SUNE-1购自美国菌种保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.2 实验动物 雄性BALB/c 裸鼠10 只，7 周龄，体质量18 ～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，使用许可证号：SYXK（京）2017-0022，生产许可证号：SCXK（京）2016-0011，动物质量合格证号：42010200003257。动物饲养于温州医科大学动物实验中心，恒温（25±3）°C，60%湿度环境，光暗循环12 h/12 h，自由获取食物和水。动物实验方案已通过温州医科大学附属平阳医院伦理委员会审核（编号：20210024）。

1.3 药物、试剂与仪器 连翘苷（四川维克奇生物公司生产，批号：478-41-2）。血管内皮生长因子A（VEGFA，美国Sigma 公司）；
DMEM 高糖培养基、含EDTA 胰蛋白酶和胎牛血清（杭州四季青公司）；
Matrigel胶（美国BD公司）；
细胞计数试剂盒8（CCK-8）（上海 Biyuntian 公司）；
二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒、放射免疫分析沉淀（RIPA）裂解物试剂盒（北京中山生物工程有限公司）；
兔抗血管内皮生长因子A（VEGFA）抗体、兔抗血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）抗体、兔抗Wnt 抗体、兔抗 β-catenin 抗体和兔抗 β-actin 抗体，辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗（美国Abcam 公司）；
CD34 抗体（上海碧云天生物技术有限公司）；
CD34、VEGFA、Wnt免疫组织化学试剂盒及免疫组织化学二抗（上海雅吉生物科技有限公司）。MCO-15AC型CO2恒温培养箱（日本Sanyo 公司）；
ECLIPSE Ts2 型倒置显微镜（日本Nikon 公司）；
SW-CJ-1FD 型超净工作台（苏州集团安泰空气技术有限公司）；
Multiskan FC 型酶标仪（美国 Thermo 公司）；
Transwell 小室（美国Corning 公司）；
DYCZ-40型电转仪（北京六一仪器厂）；
GelDocXR 型凝胶成像分析仪（美国Bio-Rad公司）。

1.4 体外实验

1.4.2 HUVECs、NP69、HNE1和SUNE-1的CCK-8实验 96孔板中每孔加入3×103个HNE1或SUNE-1细胞，96孔板中每孔加入5×103个HUVECs或NP69细胞，分为对照组和实验组。实验组细胞分别加入0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L连翘苷作用24 h，对照组加入0 μmol/L连翘苷作用24 h。随后每孔添加10 μL CCK-8 试剂，应用酶标仪于450 nm 波长处检测各孔吸光度（OD）值，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%。

1.4.3 小管形成实验 将不含胎牛血清的DMEM培养液和Matrigel 胶分别于4 ℃放置12 h，成胶冻状后将 DMEM 培养液和 Matrigel 胶以 1∶2 的体积比例混合。24 孔板中每孔加入250 μL 混合后的Matrigel 胶，37 ℃放置 1 h 待 Matrigel 胶凝结成块后，每孔加入0.1 mL密度为3×106个/mL的HUVECs悬液。将HUVECs 分为对照组、连翘苷组和联合组。连翘苷组分别加入0.625、1.25、2.5 μmol/L连翘苷作用12 h，联合组加入VEGFA 20 μg/L 联合连翘苷 2.5 μmol/L 作用12 h，对照组加入0 μmol/L 连翘苷作用12 h。采用光学显微镜在200倍视野下观察HUVECs小管形成状况。

1.4.4 HUVECs细胞体外侵袭实验 每个Transwell上室铺有一层Matrigel 胶模拟体内环境，收集HUVECs 悬液，经冰PBS 缓冲液洗涤3 次，并将细胞悬液的密度调节至2×105个/mL。将20 μL 细胞悬液加至 Transwell 上室，再将 500 μL 的 DMEM 完全培养基加入Transwell 下室，将HUVECs 分为对照组、连翘苷组和联合组。连翘苷组分别加入0.625、1.25、 2.5 μmol/L 连 翘 苷 ， 联 合 组 加 入VEGFA 20 μg/L 联合连翘苷 2.5 μmol/L，对照组加入 0 μmol/L 连翘苷。Transwell 小室置于 37 ℃中孵育过夜后加入1 ～2 滴结晶紫试剂，反应15 min 后在光学显微镜下观察转移至Transwell 小室背侧的细胞，在200倍视野下随机计数5个视野下的蓝染细胞。实验重复3次，取平均值。

1.4.5 蛋白质印迹法检测HNE1、SUNE-1 细胞，HUVECs 中 Wnt/β-catenin/VEGFA/VEGFR2 通 路蛋白的表达 细胞分为对照组和实验组，实验组细胞分别加入0.625、1.2、2.5 μmol/L 连翘苷作用24 h，对照组加入0 μmol/L连翘苷作用24 h。采用细胞裂解液提取细胞蛋白，总蛋白经匀浆、离心、变性等操作后，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉进行封闭操作。整体实验环境为4℃，维持12 h。硝酸纤维素膜经过一抗（Wnt、β-catenin、VEGFA、VEGFR2均体积比1∶1 000 稀释）4 ℃孵育过夜，再经二抗（体积比1∶15 000稀释）室温孵育1 h，100 g/L脱脂牛奶在室温下封闭1 h，利用显影定影试剂盒完成最后的显色和曝光操作。采用Image-Pro Plus 6.0图像处理软件分析各蛋白条带灰度值，目的蛋白相对表达量结果以目的蛋白与内参蛋白灰度值比值表示。

1.5 体内实验

1.5.1 建立鼻咽癌异种移植瘤模型 将HNE1 细胞（约2×106个）皮下接种到裸鼠右侧腋下。注射肿瘤细胞8 d 后，肿瘤发展到大约100 mm3时，将小鼠分为2 组：对照组和连翘苷组，每组5 只。连翘苷组每周3 次（每周一、三、五）腹腔注射给药，10 mg/kg，注射剂量为0.2 mL；
对照组腹腔注射等量生理盐水。第30 天测定肿瘤质量，然后收集肿瘤组织用于后续的实验。

1.5.2 SP免疫组织化学染色法检测鼻咽肿瘤组织中CD34、VEGFA、Wnt 的表达 取肿瘤组织样品用5%甲醛固定过夜，采用梯度乙醇脱水法将肿瘤组织脱水后石蜡包埋、切片。进行SP 免疫组织化学染色，CD34 一抗（1∶500）、VEGFA 一抗（1∶1 000）和Wnt 一抗（1∶1 000）按不同体积比稀释在37 ℃孵育60 min，HRP二抗（体积比1∶2 000稀释）在37 ℃孵育30 min，苏木素复染。CD34阳性少数表达于细胞质中，大部分表达于细胞膜中；
VEGFA 和Wnt 阳性表达大部分在细胞质中。随机选择20个视野并在低倍镜下拍照，采用Image-Pro Plus 6.0图像处理软件分析VEGFA和Wnt在样本中的积分光密度（IOD）值。在光学显微镜下计数200 倍视野下CD34阳性细胞。

由上可见，同一知识点每一螺旋的时间选择和呈现方式需要结合知识的特点和学生的认知发展而确定[18]，避免过低或过高地估计学生的知识理解能力．具体而言，可以依据相关的学习理论（如范希尔的几何思维水平理论）来设计适宜的螺旋时间及相应呈现方式．

1.5.3 血管造影 参照文献研究[13]对裸鼠鼻咽癌异种移植瘤模型实施明胶-氧化铅造影。麻醉裸鼠，开胸后在裸鼠心尖处行长约1 mm切口，随即将24号留置针导管自切口插入，将明胶-氧化铅溶液自导管灌入裸鼠全身动脉，待明胶-氧化铅溶液凝固后取出鼻咽肿瘤在X 线下摄像。采用Quantity One 4.6.2（BIO-RAD）软件扫描X 胶片中肿瘤内血管组织的光密度值，用排水法测定鼻咽肿瘤体积。肿瘤组织光密度值与肿瘤体积（cm3）比值为肿瘤组织平均体积血管密度。

1.6 统计方法 采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（）表示，采用非配对双侧t检验以及单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1 连翘苷对HUVECs及HNE1、SUNE-1、NP69细胞生长的影响 图1 结果显示：将0、0.625、1.25、 2.5、 5、 10 μmol/L 连 翘 苷 分 别 作 用 于HUVECs及HNE1、SUNE-1、NP69细胞（细胞密度为1×105个/mL）24 h 后，较低浓度连翘苷（0.625、1.25、2.5、5 μmol/L）对NP69 细胞及HUVECs 的生长无明显抑制作用，HUVECs、NP69 细胞存活率与0 μmol/L 连翘苷组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。10 μmol/L连翘苷作用HUVECs和NP69细胞24 h 后，HUVECs、NP69 细胞存活率分别为（67.2±8.4）%、（73.4±8.7）%，明显低于0 μmol/L连翘苷组（P＜0.05）。

图1 连翘苷对HUVECs及HNE1、SUNE-1、NP69细胞生长的影响（）Figure 1 Effect of phillyrin on the growth of HUVECs and HNE1，SUNE-1 and NP69 cells（）

0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L 连翘苷处理HNE1 和SUNE-1 细胞后，细胞存活率均低于对照组（0 μmol/L连翘苷处理组）（P＜0.05）。

2.2 连翘苷对HUVECs 小管形成的影响 图2 结果显示，HUVECs 在布满Matrigel 胶的培养板中孵育24 h后，细胞逐渐向两端延长呈梭形，同时细胞延长端开始在Matrigel 胶中伸展，相邻细胞开始出现联接并出现管腔样结构。0.625、1.25、2.5 μmol/L连翘苷作用HUVECs 12 h 后体外小管形成数分别为（23.8 ± 3.4）、（16.2 ± 2.4）和（13.5 ± 1.8）个，均低于0 μmol/L 连翘苷组的（38.6 ± 4.1）个，差异均有统计学意义（P＜0.05）。VEGFA 20 μg/L 联合2.5 μmol/L 连翘苷作用 HUVECs 12 h 后体外小管形成数为（41.5±5.2）个，高于2.5 μmol/L连翘苷组的（13.5± 1.8）个（P＜0.05）。

图2 连翘苷对HUVECs小管形成的影响（×200）Figure 2 Effect of phillyrin on tubule formation in HUVECs（×200）

2.3 连翘苷对HUVECs 侵袭的影响 细胞体外侵袭实验结果如图3 所示。连翘苷可明显减少侵袭出 Matrigel 基质胶的 HUVECs 数量，0.625、1.25、2.5 μmol/L 连翘苷作用 HUVECs 24 h 后侵袭细胞数分别为（52.3±2.8）、（44.5±5.8）、（31.6±4.5）个，均低于0 μmol/L 连翘苷组（76.4 ± 6.2）个，差异均有统计学意义（P＜0.05）。VEGFA 20 μg/L 联合2.5 μmol/L 连翘苷作用 HUVECs 24 h 后侵袭细胞数为（83.8 ± 9.5）个，高于 2.5 μmol/L 连翘苷组（31.6± 4.5）个（P＜0.05）。

图3 连翘苷对HUVECs侵袭的影响（×200）Figure 3 Effect of phillyrin on the invasion of HUVECs（×200）

2.4 连翘苷对 HNE1、SUNE-1 细胞，HUVECs 中Wnt/β-catenin/VEGFA/VEGFR2 通 路 蛋 白 表 达 的影响 图4-A、表1～表2 结果显示，0.625、1.25、2.5 μmol/L 连翘苷作用 HNE1、SUNE-1 细胞 24 h后，Wnt、β-catenin 和 VEGFA 的表达水平随连翘苷浓度的升高而下降。图4-B、表3 结果显示，0.625、1.25、2.5 μmol/L 连翘苷作用 HUVECs 24 h后，可呈浓度依赖性下调HUVECs中VEGFR2表达水平。

表1 各组HNE1细胞中Wnt、β-catenin、VEGFA蛋白相对表达量比较Table 1 Comparison of the relative protein expressions of Wnt，β-catenin and VEGFA in HNE1 cells among various groups （）

表1 各组HNE1细胞中Wnt、β-catenin、VEGFA蛋白相对表达量比较Table 1 Comparison of the relative protein expressions of Wnt，β-catenin and VEGFA in HNE1 cells among various groups （）

注：①P＜0.05，与连翘苷0 μmol·L-1组比较

连翘苷浓度/（μmol·L-1）0 0.625 1.25 2.5 VEGFA 1.00±0.12 0.69±0.08①0.33±0.04①0.16±0.02①Wnt 1.00±0.14 0.34±0.04①0.16±0.02①0.14±0.02①β-catenin 1.00±0.16 0.72±0.11①0.67±0.09①0.26±0.03①

表2 各组SUNE-1细胞中Wnt、β-catenin、VEGFA蛋白相对表达量比较Table 2 Comparison of the relative protein expressions of Wnt，β-catenin and VEGFA in SUNE-1 cells among various groups （）

表2 各组SUNE-1细胞中Wnt、β-catenin、VEGFA蛋白相对表达量比较Table 2 Comparison of the relative protein expressions of Wnt，β-catenin and VEGFA in SUNE-1 cells among various groups （）

注：①P＜0.05，与连翘苷0 μmol·L-1组比较

连翘苷浓度/（μmol·L-1）0 0.625 1.25 2.5 VEGFA 1.00±0.18 0.63±0.08①0.24±0.03①0.08±0.01①Wnt 1.00±0.11 0.71±0.12①0.34±0.03①0.19±0.02①β-catenin 1.00±0.12 0.89±0.13 0.52±0.07①0.12±0.02①

表3 各组HUVECs细胞中VEGFR2蛋白相对表达量比较Table 3 Comparison of relative protein expressions of VEGFR2 in HUVECs cells among various groups （）

表3 各组HUVECs细胞中VEGFR2蛋白相对表达量比较Table 3 Comparison of relative protein expressions of VEGFR2 in HUVECs cells among various groups （）

注：①P＜0.05，与连翘苷0 μmol·L-1组比较

连翘苷浓度/（μmol·L-1）0 0.625 1.25 2.5 VEGFR2 1.00±0.15 0.27±0.04①0.15±0.01①0.16±0.02①

图4 连翘苷对HNE1和SUNE-1细胞（A）和HUVECs（B）中Wnt/β-catenin/VEGFA/VEGFR2通路蛋白表达的影响Figure 4 Effect of phillyrin on protein expression of Wnt/β-catenin/VEGFA/VEGFR2 pathway in HNE1 and SUNE-1 cells（A）and HUVECs（B）

2.5 连翘苷对裸鼠鼻咽癌异种移植瘤生长和血管新生的影响 2组裸鼠体质量比较结果显示：给药前，对照组和连翘苷组裸鼠体质量分别为（19.5±3.2）、（20.4±2.1）g，2组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。给药后，对照组和连翘苷组裸鼠体质量分别为（18.7± 3.3）、（19.1± 2.6）g，2 组间比较，差异亦无统计学意义（P＞0.05）。

明胶-氧化铅血管造影结果如图5-A所示，对照组裸鼠鼻咽癌异种移植瘤内血管分布较为密集，连翘苷组鼻咽癌异种移植瘤中血管数量减少。对照组和连翘苷组平均体积血管密度分别为（5.9±1.2）、（1.6±0.3），2组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

肿瘤组织大体形态如图5-B 所示，对照组和连翘苷组鼻咽癌异种移植瘤平均质量分别为（1.2±0.3）、（0.4 ± 0.1）g，2 组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

CD34、VEGFA 和Wnt 免疫组织化学法结果如图5-C 所示。对照组和连翘苷组肿瘤组织中CD34的IOD值分别为（38.5±5.6）、（14.2±2.3），2组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；
VEGFA在对照组和连翘苷组肿瘤组织中的IOD 值分别为（297.1±39.5）、（126.8±19.7），2组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；
Wnt 在对照组和连翘苷组肿瘤组织中的 IOD 值分别为（365.8 ± 45.3）、（106.9 ± 16.7），2 组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图5 连翘苷对裸鼠鼻咽癌异种移植瘤生长和血管新生的影响Figure 5 Effect of phillyrin on the growth and angiogenesis of nasopharyngeal carcinoma xenografts

本研究首先使用浓度梯度增高的连翘苷分别作用于体外鼻咽癌HNE1和SUNE-1细胞、鼻咽正常上皮细胞系NP69 细胞和脐静脉内皮细胞（HUVECs），发现较低浓度（0.625～5 μmol/L）的连翘苷对体外NP69 细胞和HUVECs 生长无明显抑制作用，但HNE1和SUNE-1细胞对连翘苷的生长抑制效应更加敏感，0.625 μmol/L的连翘苷即可有效抑制体外HNE1和SUNE-1细胞生长，同时该浓度范围的连翘苷对体外HUVECs 小管形成具有明显抑制作用。另外，在体内实验中，最小有用剂量10 mg/kg 的连翘苷对实验动物裸鼠无明显毒副作用，但对鼻咽癌异种移植瘤生长和血管新生具有明显抑制效应。本研究首次报道连翘苷域剂量对体内外正常细胞无明显毒副作用，但可通过阻断肿瘤血管新生，进而达到延缓肿瘤细胞的恶性增殖速度的效果。

根据肿瘤内皮细胞的特点，靶向肿瘤血管内皮细胞治疗可改善恶性肿瘤患者预后[14-15]。本研究采用免疫组织化学法检测CD34、VEGFA的阳性表达水平评估组织的血管密度。结果表明，连翘苷可有效抑制肿瘤组织中CD34 及VEGFA 的阳性表达，从而在微观层面表明连翘苷可有效抑制鼻咽癌血管新生。另外，本研究通过明胶-氧化铅对裸鼠鼻咽癌异种移植瘤实施血管造影，从而获得较为直观的鼻咽肿瘤血管灌注影像。X光片可见，对照组鼻咽肿瘤血供极为丰富，而连翘苷组鼻咽肿瘤血供较为稀疏，从而在宏观层面印证了连翘苷可有效抑制鼻咽肿瘤血管生长，与CD34及VEGFA的检测结果相符，进而对鼻咽癌异种移植瘤模型的血管灌注情况有了更为准确的评价。本研究结果表明，10 mg/kg的连翘苷能通过抑制新生血管形成从而造成肿瘤处于“饥饿”状态，进而达到延缓肿瘤生长的作用，提示抑制新生血管形成在小剂量连翘苷抑制体内鼻咽癌生长过程中发挥主导作用。

既往研究证实，Wnt/β-catenin 信号通路在从细胞膜表面受体传导至细胞核过程中起关键作用，其可调控内皮细胞的迁移、分化和增殖等多种生理学功能[16-18]。VEGF 作为一种可由正常细胞和肿瘤细胞合成分泌的细胞因子，在正常组织细胞中呈低水平表达，且表达水平较为恒定，但VEGF在许多肿瘤细胞中表达上调，是促进肿瘤细胞新生的最重要调节因子之一。VEGFA 作为VEGF家族中最重要的成员之一，可促进新生血管形成并使血管通透性增加[19]。人肝细胞生长因子（rhHGF）可通过Wnt/β-catenin 信号通路上调肿瘤细胞中VEGFA 的表达，从而促进肿瘤组织中血管的生长[20]。在本研究中，连翘苷可抑制体外鼻咽癌细胞中Wnt 和β-catenin 表达水平，同时下调VEGFA 在体内外鼻咽癌细胞中的表达；
另外，在体外实验中，连翘苷对血管内皮细胞功能的抑制作用能被额外添加的VEGFA 所逆转，证实连翘苷主要通过下调VEGFA 的表达从而发挥抑制血管新生作用；
在体内实验中，连翘苷可有效延缓体内新生血管的生长，并降低体内鼻咽肿瘤组织中VEGFA 的含量。因此，认为连翘苷可能是通过下调Wnt/β-catenin/VEGFA 通路的表达从而抑制肿瘤血管生成，进而干扰裸鼠肿瘤的恶性增殖。

VEGF自肿瘤细胞分泌后与位于内皮细胞表面的VEGFR 相契合，有助于内皮细胞募集和血管通透，并通过调节血管内皮细胞的降解、成熟、增殖和富集等过程，最终促进新血管的形成[21-22]。在本实验中，我们也观察到连翘苷可有效抑制VEGFR2在HUVECs中的水平，结合连翘苷抑制裸鼠体内鼻咽癌血管生长的实验结果，从而表明连翘苷可有效调控鼻咽癌细胞中Wnt/β-catenin 通路相关蛋白的表达，影响鼻咽癌细胞VEGFA 的表达，同时抑制VEGFR2 在血管内皮细胞中的表达从而抑制血管内皮细胞的功能。

综上所述，连翘苷对体内外鼻咽癌血管新生有显著的抑制作用，其主要作用机制可能与调控Wnt/β-catenin/VEGFA/VEGFR2 信号通路有关，可见其有一定的应用前景，值得深入研究。

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