积雪草苷促进ROCK/JNK通路介导的自噬减轻小鼠压力负荷性心肌肥厚

王 伟，李 炜，韩 杨，张艳涛，张 杰，张晓东，刘治国(西安国际医学中心医院心血管内科，西安 710100；
通讯作者，E-mail:1446315412@qq.com)

病理性心肌肥厚是常见的心血管病理生理表现，存在于多种心血管疾病，具体机制尚不明确，缓解心肌细胞肥大、改善心肌肥厚可能成为肥厚型心肌病等多种心血管疾病治疗的有效靶点[1-4]。研究表明，Rho/ROCK/JNK途径调节多种关键细胞功能，可以介导细胞凋亡、增殖、分化等[5，6]。目前心肌肥厚的治疗尚缺乏有效治疗策略，积雪草苷(asiaticoside，ASI)具有较强的抗氧化应激、抗炎作用的中药提取物，可通过不同机制修复组织损伤[7-9]。本研究采用小鼠主动脉缩窄(transverse aortic constriction，TAC)模型，探讨ASI对心肌肥厚的改善作用以及对ROCK/JNK信号的调控作用。

1.1 实验材料

实验动物选择6周龄健康雄性C57/BL小鼠100只，体质量(20.5±1.1)g，购自空军军医大学实验动物中心，许可证号：SYXK(陕)2019-001。自噬相关蛋白5(Atg5)、肌球蛋白样Bcl-2结合蛋白(Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3 Ⅱ/Ⅰ)、丝氨酸/苏氨酸激酶(ROCK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体、积雪草苷(ASI)购于美国Sigma公司，ROCK抑制剂Y-33075购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)试剂盒、脑钠尿肽(brain natriuretic peptide，BNP)试剂盒、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor， CTGF)试剂盒购于美国R&D Systems公司。FV2000激光共聚焦显微镜购于日本奥林巴斯公司，小动物超声仪购于美国VisualSonics公司。

1.2 分组及TAC模型建立

所有100只C57/BL小鼠按照随机数字表法随机分4组：假手术组(sham组)、TAC组、ASI+TAC组、ASI+Y-33075(ROCK抑制剂)+TAC组，每组25只。各组以普通饲料喂养，TAC组、ASI+TAC组、ASI+Y-33075+TAC组以结扎小鼠主动脉弓方式建立TAC模型。用2%异氟烷将小鼠麻醉好后，仰卧位将四肢固定在恒温板上。在第二肋间纵向剪开皮肤，并逐层分离肌肉，暴露横主动脉弓，在无名动脉和左颈动脉之间预先穿一根7-0号丝线，用丝线将一根27号的针头和血管结扎固定，然后将针头取出并逐层缝合肌肉和皮肤。sham组小鼠暴露横主动脉弓并穿线但不结扎，其他操作和手术组相同。ASI给药剂量为10 mg/(kg·d)，溶于0.9%氯化钠溶液中。ASI+TAC组腹腔注射ASI[10 mg/(kg·d)]，ASI+Y-33075+TAC组同时给予腹腔注射ASI[10 mg/(kg·d)]以及Y-33075[10 mg/(kg·d)]，ASI+TAC组与ASI+Y-33075+TAC组自TAC模型建立第1天开始进行ASI与Y-33075给药，连续给药30 d。

1.3 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠血清ANP、BNP、CTGF水平

各组小鼠经2%异氟烷麻醉后，固定小鼠，剪开并剥离小鼠颈部皮肤、皮下组织，暴露小鼠颈动脉，以组织剪剪开快速取血2 ml至EP管中，3 000 r/min离心15 min，取上层清亮血清。按照ANP、BNP、CTGF检测试剂盒说明书检测。

1.4 心脏超声检测各组小鼠心功能

各组小鼠经2%异氟烷麻醉后四肢固定于超声仪电极，探头在乳头肌水平位置用M型取样线检测，测量并计算得出左心室射血分数(left ventricular ejection fraction， LVEF)，左心室短轴缩短率(left ventricular fraction shortening， LVFS)、左心室舒张期前壁厚度(left ventricular diastolic anterior wall dia-meter，LVAWd)左心室舒张末期容积(left ventricular end diastolic volume，LVEDV)等指标。

1.5 HE、天狼星红和Masson染色检测各组小鼠心肌肥厚及纤维化程度

至实验终点时，各小鼠经2%异氟烷麻醉后迅速剪下心脏，冷PBS缓冲液冲洗3遍，洗净残余血细胞后，以多聚甲醛(40 g/L)固定72 h，石蜡包埋、切片，行HE、天狼星红和Masson染色，其中HE染色主要观察心肌组织结构变化，天狼星红和Masson染色主要观察心肌组织纤维化，在光学显微镜下拍摄染色后的HE、天狼星红、Masson图像并保存，利用Image J软件计算各组胶原纤维表达并分析各组心肌组织胶原容积分数(collagen volume fraction， CVF)，CVF=胶原面积/总面积。染色后剩余蜡块标本永久保存，心脏及血液取材后其余组织收集后送实验动物中心行无害化处理。

1.6 qPCR检测各组小鼠心肌组织BNP、β-MHC、CTGF、Atg5的mRNA相对表达量

测定BNP、β-MHC、CTGF、Atg5的表达评估心肌组织肥厚、纤维化及自噬水平。用TRIzol试剂从组织中分离总RNA，逆转录实验生成cDNA，用BIO-RAD分光光度法测定RNA和cDNA的浓度和纯度，Primer Premier 6.0软件设计引物并合成(上海吉凯基因有限公司)。在iQTM5 RT-PCR系统中进行PCR扩增，将上下游引物各稀释成25 μmol/L，取等量混合备用。目的基因cDNA 6 μl，上下游引物混合液2 μl，ddH2O 2 μl，2×Buffer 10 μl。GAPDH: cDNA 3 μl，上下游引物混合液2 μl，ddH2O 5 μl，2×Buffer 10 μl。反应条件均为:95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法对靶基因表达量进行相对定量。各检测基因引物序列由美国复能基因公司提供。

1.7 Western blot检测心肌组织自噬相关蛋白Atg5、LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1的变化

各组小鼠心肌组织取相同质量放入离心管中，加入预冷PBS，剪碎心肌组织，4 ℃ 3 000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀中加入含蛋白酶抑制剂的RIPA强裂解液，冰上充分研磨并裂解30 min，4 ℃ 12 000g离心30 min，取上清；
BCA法蛋白定量；
电泳并用湿转法将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温下封闭2 h，裁剪目的条带，放入对应ROCK(1 ∶1 000)、JNK(1 ∶1 000)、Atg5(1 ∶1 000)、LC3 Ⅱ/Ⅰ(1 ∶1 000)、Beclin 1(1 ∶1 000)和GAPDH抗体(1 ∶5 000)中，4 ℃摇床孵育过夜；
TBST洗脱3次，5 min/次，将目的条带放入山羊抗兔或抗鼠二抗(1 ∶5 000)中室温摇床孵育2 h，TBST洗脱3次，5 min/次，ECL化学发光液避光检测，Image Lab统计灰度值。

1.8 免疫荧光染色检测心肌组织自噬相关蛋白LC3 Ⅱ/Ⅰ水平

取小鼠左室前壁组织，石蜡包埋、切片、脱蜡、复水，用PBS缓冲溶液洗5次，每次3 min，Triton-X100(2 g/L)处理15 min，PBS液冲洗3次，每次3 min，山羊血清室温封闭1.5 h，PBS液洗3次，每次3 min，每个切片加LC3 Ⅱ/Ⅰ抗体(1 ∶100)50 μl，4 ℃孵育15 h，PBS液洗5次，每次3 min，暗室内每张切片加荧光二抗(1 ∶500)50 μl，PBS液洗5次(3 min/次)，避光条件下每张切片加DAPI溶液50 μl，PBS液洗5次，每次3 min，用荧光防淬灭液封片，采集图像。

1.9 统计学分析

2.1 Y-33075能够阻断ASI对于TAC所致心脏功能障碍及心肌损伤的改善作用

与sham组比较，TAC组心脏功能明显降低，LVEF、FS、LVEDV显著减小，LVAWd明显增加(均P<0.05)；
与TAC组比较，ASI+TAC组心脏功能得到明显改善，LVAWd明显减少，LVEF、FS、LVEDV明显增加(均P<0.05)；
与ASI+TAC组相比，ASI+Y-33075+TAC组LVEF、FS、LVEDV明显降低(P<0.05，见表1)。超声结果表明，ASI可以改善TAC诱发的心脏功能障碍，Y-33075可阻断ASI的心肌保护作用。

表1 各组小鼠超声测量结果 (n=10)Table 1 Ultrasonic measurement results of mice in each group (n=10)

与sham组，TAC组血清中ANP、BNP、CTGF水平明显增加(P<0.05，见表2)，心肌组织BNP、β-MHC、CTGF的mRNA表达明显增加(P<0.05)，Atg5的mRNA表达降低(P<0.05，见表3)；
相对于TAC组相比，ASI+TAC组血清ANP、BNP、CTGF水平明显降低(P<0.05)，心肌组织BNP、β-MHC、CTGF的mRNA表达减少(P<0.05)，Atg5的mRNA表达增加(P<0.05)；
与ASI+TAC组比较，ASI+Y-33075+TAC组血清中ANP、BNP、CTGF水平显著增加(P<0.05，见表2)，心肌组织BNP、β-MHC、CTGF的mRNA表达明显增加(P<0.05)，Atg5的mRNA表达降低(P<0.05，见表3)。

表2 各组小鼠血清ANP、BNP、CTGF水平比较 (n=10)Table 2 Comparison of serum ANP， BNP and CTGF levels of mice between groups (n=10)

表3 各组小鼠心肌组织BNP、MYH7、CTGF、Atg5的mRNA相对表达量 (n=8)Table 3 Relative mRNA expression of BNP， MYH7， CTGF and ATG5 in myocardial tissue of mice in each group (n=8)

2.2 Y-33075可阻断ASI改善TAC小鼠心肌结构改变

心肌组织HE、天狼星红、Masson染色检测各组小鼠心肌组织结构、胶原含量及纤维化水平。sham组小鼠心肌组织纤维排列整齐，无纤维化，胶原含量低；
TAC组可见细胞核多逸出，心肌结构排列紊乱，肌纤维断裂明显，胶原含量高；
与TAC组相比，ASI+TAC组肌纤维排列整齐，纤维化程度改善，胶原含量降低；
与ASI+TAC组相比，ASI+Y-33075+TAC组心肌肥厚程度明显增加，排列紊乱，胶原含量增高(见图1)。

图1 HE、天狼星红、Masson染色检测各组心肌肥厚及纤维化程度 (×400，n=5)Figure 1 Degree of myocardial hypertrophy and fibrosis in each group by HE， Sirius red and Masson staining (×400，n=5)

2.3 Y-33075可阻断ASI促进TAC小鼠心肌细胞自噬的作用

Western blot结果提示，与sham组比较，TAC组心肌组织中自噬相关蛋白ROCK、JNK、Atg5、Beclin 1、LC3 Ⅱ/Ⅰ表达水平降低(P<0.05)；
与TAC组比较，ASI+TAC组心肌组织ROCK、JNK、Atg5、Beclin 1、LC3 Ⅱ/Ⅰ表达水平增高(P<0.05)；
而与ASI+TAC组比较，ASI+Y-33075+TAC组心肌组织ROCK、JNK、Atg5、Beclin 1、LC3 Ⅱ/Ⅰ表达水平降低(P<0.05，见图2)，提示ASI可以改善TAC所致心肌细胞自噬水平的降低，而Y-33075阻断ASI的这一作用。

与sham组比较，*P<0.05；
与TAC组比较，△P<0.05；
与ASI+TAC组比较，#P<0.05图2 Y-33075可阻断ASI促进TAC小鼠心肌细胞自噬的作用 (n=5)Figure 2 Y-33075 blockes the improving effect of ASI on cardiac autophagy of TAC mice (n=5)

2.4 Y-33075可阻断ASI促进TAC所致心肌细胞LC3 Ⅱ/Ⅰ的表达

心肌LC3-Ⅰ/Ⅱ免疫荧光染色结果显示，与sham组相比，TAC组LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白免疫荧光染色数量明显减少(P<0.05)；
与TAC组相比，ASI+TAC组LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白染色的数量显著增加(P<0.05)；
与ASI+TAC组相比，ASI+Y-33075+TAC组LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白免疫荧光染色数量明显减少(P<0.05，见图3)，结果也提示ASI可以改善由TAC诱发的心肌自噬功能障碍，而Y-33075阻断了ASI的这一作用。

图3 Y-33075阻断ASI促进TAC所致心肌细胞LC3 Ⅱ/Ⅰ的表达 (×400，n=5)Figure 3 Y-33075 blockes the improving effect of ASI on the expression of LC3 Ⅱ/Ⅰ (×400，n=5)

病理性心肌肥厚是多种慢性心血管疾病进展中的重要病理过程，由多种因素引起，可导致胶原纤维过度沉积，胶原浓度和体积分数显著增强，心肌胶原类型和结构排列紊乱[10-13]。长期的体液和机械刺激导致心脏首先发生代偿性的心肌细胞肥大以维持正常泵血功能，然而持续性的心脏负荷最终胁迫心肌细胞肥大从代偿性转为失代偿性，表现为心肌细胞横截面积增加和心室壁增厚，心室腔变小，心脏射血分数下降，最终发展为心力衰竭。心肌细胞肥大的具体机制尚不清楚。因此，深入研究心肌细胞肥大的分子机制、以期为临床心肌肥厚诊治开发新靶点及策略是攻克这一临床难题的重要研究方向。

以往研究表明，多种重要机制参与了病理性心肌肥厚的发展过程，其中包括炎症反应、氧化应激、纤维化、细胞死亡等。近年来发现，自噬和泛素-蛋白酶体系统是维持细胞中蛋白稳态的重要途径，随着研究的不断增多与深入，越来越多的研究表明自噬在心肌肥厚过程中起着重要作用[14-16]。自噬过程受损，影响内环境的稳定，导致细胞内容物清除障碍，进而引起细胞体积增加，可能是病理性心肌肥厚的发生机制之一。然而，自噬与心肌肥厚的相互作用机制尚不十分清楚，自噬的调节可能成为治疗心肌肥厚的潜在策略。

Rho蛋白激酶(Rho protein kinase，ROCK)是丝氨酸蛋白激酶家族成员，RhoA是属于Rho-GTPase家族的一种小GTPase蛋白。Rho相关螺旋蛋白激酶(Rho associated helical protein kinase，ROCK)是Rho A的下游效应分子。Rho/ROCK途径调节多种关键细胞功能，如基因转录、细胞-细胞黏附、细胞周期、细胞死亡[5，6]，许多研究人员一直在探索该途径作为治疗靶点的潜力[17，18]。Rho/ROCK信号通路可以激活C-Jun氨基酸末端激酶(C-Jun amino acid terminal kinase，JNK)的信号通路，调节C-Jun的表达而调控细胞自噬。细胞自噬水平在心肌肥厚中起着关键作用。ROCK/.JNK已被证明具有自噬调控作用[19]。ROCK直接靶向JNK，ASI可能通过激活JNK在TAC模型中发挥保护作用。ASI的心脏保护作用部分是通过激活细胞自噬介导的。ASI本身具有抗氧化、抗炎等作用，然而，ASI对TAC所致心肌细胞自噬的调控作用有待进一步研究。ROCK和JNK已被证明能促进细胞存活通过多种途径激活细胞自噬[19]。ASI可能通过激活ROCK/JNK信号通路TAC模型中发挥心肌保护作用。既往研究表明，ASI发挥保护作用可以通过调控自噬介导[20，21]。

本研究通过在体实验探讨自噬与TAC所致小鼠心肌肥厚的关系，并阐明了ASI对TAC导致TAC心肌细胞自噬的保护机制，根据研究结果发现TAC与ROCK/JNK介导的自噬有关，同时，ASI可激活ROCK/JNK通路抑制细胞自噬。结果从一定从程度上阐明了TAC的作用机制并探索了ASI的保护作用，与以往研究结果一致[22]。

在TAC模型中，ROCK和JNK表达均下调，而ASI组ROCK和JNK表达恢复。Y-33075是ROCK的抑制剂，Y-33075处理后可通过阻断ROCK减弱ASI对TAC的改善作用。因此，通过抑制ROCK/JNK通路，部分消除ASI对TAC所致TAC的心肌保护作用。Y-33075还可以部分消除ASI通过ROCK/JNK通路对细胞自噬的影响。综上，本研究的结果表明ASI通过激活ROCK/JNK通路发挥保护作用。

有很多证据表明自噬在疾病的发生和发展中起着重要作用。然而，自噬在TAC或不同疾病的特定阶段具体作用机制不明，自噬、TAC以及两者之间的关系需要深入研究与进一步探索。本研究阐明了ASI对TAC所致心肌细胞自噬的保护机制，发现TAC与ROCK/JNK通路介导的自噬有关，同时ASI激活ROCK/JNK通路上调细胞自噬。这些结果佐证了TAC的机制，但仍需要细胞实验等更多证据进一步证实。

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