巨菌草饲料最佳发酵工艺及发酵过程中菌群结构与功能研究

邱余杨, 赵 辉, 何啸宇, 祝芙蓉, 刘 斌, 刘庆华

[1.福建农林大学国家菌草工程技术研究中心；
2.福建农林大学生命科学学院；
3.福建农林大学食品科学学院；
4.福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)，福建 福州 350002]

为缓解畜牧养殖逐渐规模化而出现的“人畜争粮”现象，国家出台了相关政策加强发展优质饲草，以转型至“以草换畜”的节约粮畜牧业.巨菌草(CenchrusfungigraminusZ. X. Lin & D. M. Lin & S. R. Lan sp. nov.)富含糖分、木质素、粗蛋白和粗纤维，具有适口性好、易消化等优点，且易种植、产量高，是一种具有市场潜力的高产、优质的牧草资源[1].利用微生物发酵技术生产巨菌草饲料，可有效提高饲料营养及其消化吸收率；
巨菌草饲料经瘤胃微生物发酵可产生丰富的营养物质，有利于调节胃肠道的菌群平衡，增强机体免疫功能[2].因此，巨菌草饲料的品质与反刍动物的健康和生产性能密切相关.

微生物发酵饲料的品质和营养不仅由发酵基料、益生菌群决定，还与菌的接种量、发酵温度、体系含水量和发酵时间等工艺条件密切相关.因此，巨菌草饲料的最佳发酵工艺需分别对多因素和多指标进行筛选评价.针对多因素的筛选，除了正交设计[3]、均匀设计[4]外，响应面法[5]的试验次数更少且结果更准确.饲料评价需考虑pH、纤维素、粗蛋白、有机酸等多个指标，指标间易相互影响，某一条件不一定对多个指标同时有效，因而本试验引入总评归一值，对多个指标进行综合评价.此外，巨菌草自身附着的微生物和添加的复合菌可以协同作用降解菌草，而多种菌共存的体系往往不稳定，所以获得稳定、高效的优势菌群尤为关键.早期，对单一菌的富集一般采用传统培养计数法，对于某些重要微生物常使用常规PCR、荧光定量PCR法或克隆等方法检测[6]，而对于传代富集过程中物种组成和微生物的动态变化则常常采用高通量测序法[7-8].

本试验采用单因素探究发酵条件的最适范围，以主要检测指标中性洗涤纤维(neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber, ADF)、粗蛋白(crude protein, CP)、NH3-N/TN、乳酸/乙酸(lactic acid/acetic acid, LA/AA)和丁酸(butyric acid, BA)的总评归一值(overall desirability, OD)为唯一响应值，采用响应面法建立数据模型进行分析优化，得到最佳发酵工艺；
基于最佳工艺，对巨菌草饲料菌群传代富集，以传代富集中的各样本作为考察对象，通过16S rRNA和ITS测序技术对菌群的组成和多样性进行研究，旨在筛选出高效、稳定的优势菌群，从而为改善菌草发酵饲料的品质提供依据.

1.1 菌草和菌种来源

巨菌草为高约2.5 m的2月龄新鲜菌草，由国家菌草工程技术研究中心提供.将巨菌草粉碎后50 ℃烘干，过20目筛，备用.玉米粉和麦麸购于河南麦德旺农副产品市场.饲料发酵菌群C：乳酸菌属、酵母菌、芽孢杆菌、粪肠球菌、梭菌等，由本实验室筛选保存[9].

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 称取总量为50 g的发酵基料[巨菌草∶麦麸∶玉米粉=8∶1∶1(w∶w∶w)]，加入菌群C及无菌蒸馏水，配置成相应含水量的发酵体系，混匀后转移至发酵袋，排除空气，压实密封，于培养箱静置发酵.

巨菌草发酵饲料的主要影响因素为接种量、发酵温度、含水量、发酵时间，以这些因素为变量，检测巨菌草发酵饲料的营养指标，判定试验过程是否正常.以NDF、ADF、纤维素、相对饲用价值(relative feeding quality, RFQ)、CP、NH3-N/TN、pH、LA、LA/AA和BA的OD为综合评价指标，确定最适单因素.基于单因素试验，以OD为响应值，采用响应面法优化巨菌草饲料发酵工艺，再基于优化的最佳工艺，以菌群C为原始菌种，发酵基料为培养基，连续传代富集培养直至菌群稳定.

评分标准：采用Hassan方法，对上述6个指标进行归一化处理，pH、NDF、ADF、纤维素、NH3-N/TN和BA，取值越小越好，计算公式为di=(Ymax-Yi)/(Ymax-Ymin)；
而RFQ、CP、LA和LA/AA，取值越大越好，计算公式为di=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)；
几何平均数总评归一值OD=(d1+d2+d3+…dk)/k，其中k为指标数[10].

1.2.2 单因素优化试验 试验基本条件为：含水量50%，发酵温度30 ℃，接种量2.5%，发酵时间12 d.单因素试验条件为接种量(1.5%、2.5%、3.5%、4.5%)、发酵温度(25、30、35、40 ℃)、含水量(40%、50%、60%、70%)、发酵时间(0、3、6、9、12 d)，分别考察接种量、发酵温度、含水量和发酵时间对巨菌草发酵饲料的营养成分和发酵品质的影响.

表1 试验因素与水平Table 1 Factors and levels of experiment

1.2.3 响应面优化试验 基于单因素试验，以发酵温度(A)、含水量(B)、接种量(C)为考察因素，以主要检测指标NDF、ADF、CP、NH3-N/TN、LA/AA和BA的OD为响应值.按Box-Behnken的中心组合设计原则进行试验设计(表1)，优化巨菌草饲料发酵工艺.

1.2.4 传代富集培养 基于响应面的最佳工艺，对饲料菌群(总量20 kg)进行富集传代，每发酵4 d为1代；
再从前1代取总量的20%接种到新的发酵基料(20 kg)，混合均匀转至发酵桶，压实密封，静置发酵；
连续传代富集至第5代，共计20 d；
每代试验结束后，按要求采样检测，每组试验重复3次.

1.3 指标测定

1.3.1 营养成分的测定 发酵结束后，取25 g样品，65 ℃烘48 h后检测指标.CP、NDF、ADF、RFQ的测定，以及纤维素和半纤维素含量计算参考Rohweder et al[11]的方法.

1.3.2 发酵品质的测定 取10 g发酵饲料于三角瓶中，加入1∶9(v：v)的蒸馏水搅拌均匀，4 ℃冰箱浸提24 h，再常温水浴超声300 W 30 min，过滤后离心(7 850 r·min-1)10 min，取上清.用于测定pH值、有机酸和氨态氮(NH3-N)的含量，-20 ℃冰箱冻存备用.采用超高效液相色谱(Water型)测定LA、AA和BA的含量，参考本实验室方法[9].NH3-N含量的测定采用苯酚—次氯酸钠比色法[12].

1.3.3 菌群分析鉴定 分别收集原菌液和富集传代中第0、1、3、4、5代的样本，于-80 ℃冻存备用.并依次命名为MCC、CSP0、CSP1、CSP3、CSP4和CSP5.每组3个重复.

采用CTAB/SDS法提取各传代样本的基因组DNA，利用1%的琼脂糖凝胶来监测DNA的浓度和纯度[13]，再用无菌水将DNA稀释至1 μg·μL-1.对于饲料中菌群多样性的分析，用通用引物515F和806R扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4区，用通用引物ITS5-1737F和ITS2-2043R扩增真菌ITS1-5F区域[14].利用Illumina NovaSeq平台进行测序.利用QIIME[15]对原始标签进行质量过滤，使用UCHIME算法去除嵌合[16].利用Uparse软件对所有样本中相似度达到97%的有效标签聚类得OTUs(operational taxonomic units)[17]，再进行Beta和菌群组成等多样性分析.利用RStudio软件绘制菌群和发酵饲料营养品质的Spearman相关热图.通过Cytoscape 3.6.1对相关网络进行可视化[18].

1.4 数据与统计分析

采用Excel 2019录入数据，SPSS 13.0和design expert software 8.0对数据进行统计分析，试验数据均采用平均值±标准偏差形式表示，方差分析的显著性水平为P<0.05，极显著性水平为P<0.01.

2.1 接种量的优化

随着菌群C接种量的增加，饲料中的NDF、ADF、纤维素含量，NH3-N/TN和BA含量均呈先降低后升高的趋势，RFQ、CP含量、LA/AA和OD值则先升高后降低，且接种量2.5%的发酵效果最佳(表2).综上，确定菌群C接种量最适范围为1.5%～3.5%.

2.2 发酵温度的优化

随着发酵温度的升高，饲料中NDF和ADF含量及NH3-N/TN均先降低后升高，RFQ和OD值则先升高后降低(表3).30和35 ℃的发酵温度体系的OD值极显著高于40 ℃，但30 ℃的体系与25 ℃的无显著差异，OD30 ℃>OD35 ℃>OD25 ℃>OD45 ℃.综上，确定发酵温度最适范围为25～35 ℃.

2.3 含水量的优化

随着含水量的升高，饲料中NDF、ADF、纤维素含量呈先降低后升高的趋势，而RFQ、CP含量、LA含量、LA/AA和OD值则呈明显的先升高后降低的趋势(表4).含水量60%的饲料中纤维素和BA含量及pH均极显著低于其他组(P<0.01)，RFQ、LA含量和OD值均极显著高于其他组(P<0.01)，表明含水量为60%的发酵体系的饲料营养品质最优.综上，确定含水量最适范围为50%～70%.

表2 菌群C的接种量对巨菌草发酵饲料营养成分和发酵品质的影响1)Table 2 Effect of inoculum size of microflora C on nutrient composition and fermentation quality of feed based on C. fungigraminus

表3 发酵温度对巨菌草发酵饲料营养成分和发酵品质的影响1)Table 3 Effect of fermentation temperature on nutrient composition and fermentation quality of fermented feed based on C. fungigraminus

表4 含水量对巨菌草发酵饲料营养成分和发酵品质的影响1)Table 4 Effect of water content on nutrient composition and fermentation quality of fermented feed based on C. fungigraminus

2.4 发酵时间的优化

相比于发酵初期，随着发酵时间的延长，后期饲料中NDF、ADF和纤维素都能被有效降解(P<0.01)，pH也显著降低(P<0.01)，RFQ、LA含量和OD值也显著增加(P<0.01)；
各指标在6 d内的变化最大，在9和12 d时趋于平稳.相比于12 d，发酵时间为9 d时的NH3-N/TN(P<0.05)和BA含量更低，CP含量较高；
且OD9 d=OD12 d(表5).综上，确定最佳发酵时间为9 d.

表5 发酵时间对巨菌草发酵饲料营养成分和发酵品质的影响1)Table 5 Effect of fermentation time on nutrient composition and fermentation quality of fermented feed based on C. fungigraminus

2.5 响应面优化试验结果

由SPSS 13.0进行数据处理，再由design expert software 8.0对表6所列结果进行整理分析，得到发酵温度(A)、含水量(B)、接种量(C)3个因素与OD之间的回归方程.方程如下：

OD=0.86-0.14A-0.047B+0.035C-0.043AB-0.013AC+0.017BC-0.13A2-0.25B2-0.22C2

表6 响应面试验结果1)Table 6 Results of response surface test

通过模型预测的最佳发酵工艺条件为：发酵温度27.36 ℃、含水量59.35%、接种量2.59%，在该优化条件下，预测OD可达0.90.根据实际操作，将模型优化后的最优工艺参数调整为：发酵温度28 ℃、含水量60%、接种量2.6%，并在该条件下进行3次验证.结果表明(表8)，OD为0.89、0.92、0.86[平均值(average，AVG)为0.89，相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)为0.03]，与理论预测值基本一致，说明此模型具有一定的可靠性.

表7 回归模型ANOVA分析结果1)Table 7 ANOVA analysis of regression model

表8 验证试验结果Table 8 Results of validation test

2.6 传代富集试验

第1代饲料中的NDF、ADF、CP含量和RFQ的变化与第0代无显著差异(P>0.05)，但第1代饲料中LA含量、LA/AA和OD值显著升高(P<0.01)，pH显著降低(P<0.05).相比于第1代，第3代和第4代饲料中的NDF和ADF含量分别显著降低了6.78%和6.80%、14.74%和16.68%(P<0.01)，RFQ、CP含量和OD值分别显著升高了17.34%和18.65%(P<0.01)、8.54%和9.81%(P<0.05)、2.77和2.74倍(P<0.01)；
pH均极显著降低了29.19%(P<0.01)，LA含量和LA/AA分别极显著升高了2.56和2.61倍、1.58和1.70倍(P<0.01).第5代饲料中NDF含量、NH3-N/TN和pH显著高于第3、4代(P<0.05)，其他指标无显著差(表9).综上，第4代的饲料营养品质最佳.

表9 传代富集对巨菌草发酵饲料营养成分和发酵品质的影响1)Table 9 Effect of subculture enrichment on nutrient composition and fermentation quality of fermented feed based on C. fungigraminus

2.7 Beta多样性分析

采用主坐标分析(principal co-ordinates analysis, PCoA)对传代富集过程中的饲料菌群结构进行分析(图1)，图中两点距离的远近表示样本间群落结构的差异，若样本距离越近，则物种组成结构越相似[21].由图1A知，MCC、CSP0和CSP5间分布距离远，说明CSP5中菌群结构变化最大；
CSP1、CSP3和CSP4分布距离近，表明经传代富集巨菌草中的细菌菌群改变，但CSP3和CSP4间差异并不显著.由图1B知，MCC分布于最右方，CSP0分布于上方，CSP1、CSP3、CSP4和CSP5之间的距离近且聚集在左下方.表明巨菌草基料自身所含菌群(CSP0)及传代后菌群(CSP1～CSP5)与原始复合菌(MCC)的菌群结构组成差异较大，传代后菌群与对照CSP0有一定差异，而CSP3和CSP4无明显差异.这可能是因为MCC中所含真菌大多是饲料发酵的好氧菌，与CSP0中所含好氧菌不同，在进入饲料厌氧发酵阶段后，大部分好氧菌失活致死，因此传代后的巨菌草饲料所含的真菌菌群结构与MCC及CSP0的差异较大.而在传代持续的选择压力下，微生物不断选择，逐渐形成相对稳定的菌群.

A：细菌；
B：真菌.图1 主坐标分析Fig.1 Principal coordinates analysis

2.8 菌群结构组成

巨菌草饲料发酵菌群的细菌在门水平上(图2A)，MCC组以变形菌门(63.02%)和厚壁菌门(36.47%)为主导，CSP0的优势菌门则以变形菌门(94.43%)为主，厚壁菌门(2.30%)和蓝细菌(1.85%)次之.随着传代富集数增加，各代优势菌门均为变形菌门(CSP1 79.72%、CSP3 74.17%、CSP4 73.15%、CSP5 59.43%)和厚壁菌门(CSP1 19.54%、CSP3 24.91%、CSP4 24.81%、CSP5 34.45%)，此外，拟杆菌门在CSP5(2.28%)中的丰度显著高于其他各组(P<0.05).在属水平上(图2B)，MCC的优势菌属为片球菌属(21.11%)和肠球菌属(8.40%)，二者在传代中的丰度很低.泛菌属在MCC中丰度较低(1.09%)，而在CSP0中最高(59.80%)，经传代后其丰度降低(CSP1 51.37%、CSP3 53.32%、CSP4 51.57%和CSP5 43.61%).乳酸杆菌属在各代的丰度依次为3.31%(MCC)、0.31%(CSP0)、14.89%(CSP1)、21.88%(CSP3)、21.76%(CSP4)和19.27%(CSP5).此外，各代中其余菌属Pseudomonas(假单胞菌属)、Staphylococcus(葡萄菌属)、Cronobacter(阪崎肠杆菌)等致病菌都仅有较低丰度.

巨菌草饲料发酵菌群的真菌在门水平上(图2C)，各组优势菌门均为子囊菌门，传至第5代时其相对丰度有所降低，此外各组间还存在丰度较低的担子菌门和毛霉菌门，相比于CSP1中的担子菌门(1.59%)和毛霉菌门，CSP3(4.42%)和CSP4(2.72%)中的担子菌门丰度显著增加(P<0.05)，而CSP3～CSP5中的毛霉菌门丰度均降低.在属水平上(图2D)，MCC中以木霉属(97.78%)为主导，传代后期丰度很低(丰度<0.5%).布氏白粉菌属在各传代阶段(CSP1～CSP5)的丰度较高，该菌可能是菌草自身携带，在传代中富集增加.Naganishia、Khuskia和Meyerozyma菌属在CSP3(3.87%、5.82%和6.24%)和CSP4(1.68%、6.32和5.31%)中的相对丰度均显著高于其他各组(P<0.05).Candida和Wickerhamomyces在CSP0的丰度较低但高于CSP3～CSP5.

A：细菌门；
B：细菌属；
C：真菌门；
D：真菌属.图2 细菌和真菌在门、属水平的物种相对丰度柱形图Fig.2 Histogram of relative abundance of bacteria and fungus at the phylum and genus level

2.9 传代富集微生物群与巨菌草饲料营养品质的相关性分析

采用Spearman秩相关分析计算细菌和真菌(图3A，3C)微生物系统类型与巨菌草饲料营养品质相关参数之间的相关性，并通过网络可视化(细菌|r|>0.7，真菌|r|>0.5，P<0.05)(图3B，3D).由图3A和B可知，各组中丰度最高的泛菌属与NH3-N/TN和BA呈负相关.CSP3和CSP4组中丰度较高的乳酸杆菌属与pH、NDF、ADF呈负相关，与RFQ、CP、LA、LA/AA和BA呈正相关.片球菌属与ADF呈正相关，肠球菌属与RFQ呈负相关.Lachnospiraceae_NK4A136_group和Colidextribacter均与ADF呈正相关，与RFQ、LA、LA/AA和BA呈负相关.

由图3C和D知，在CSP3和CSP4中相对丰度较高的Naganishia与pH、NDF、ADF呈负相关，与RFQ、CP、LA和LA/AA呈正相关，而Meyerozyma仅与NH3-N/TN呈负相关，Khuskia和Nigrospora与NDF呈负相关，与RFQ和LA呈正相关.在CSP3和CSP4中相对丰度极低的Candida和Wickerhamomyces与pH、NDF、ADF呈正相关，与RFQ、CP、LA呈负相关.

有关研究表明，利用复合菌群发酵饲料易受温度和接种量的直接影响.首先，菌群C富含乳酸菌属、酵母菌等，过低或过高的温度不利于有益菌的生长繁殖，还会延长发酵期，滋生有害菌.其次，饲料发酵是从有氧向无氧过程的转化，接种量过多会使发酵初期菌体生长过快，耗尽营养物而不利于后期厌氧阶段对营养物的转化，增加成本；
接种量过低则发酵期延长，生产速率低[22].相关调研指出，含水量和发酵时间也是饲料发酵的关键.基料的含水量过低，不易压实导致空气残留量高，延长好氧期，使厌氧发酵期延后而不利于微生物的生长；
含水量过高，则易滋生霉菌，更不利于饲料饲喂和贮存[23].再者，发酵时间过短，不利于饲料纤维物质的降解和粗蛋白的产生；
而发酵时间过长，蛋白易被分解造成营养物质流失[24].因此，本试验通过单因素确定了饲料最适发酵时间为9 d，经响应面试验优化获得巨菌草饲料的最佳发酵工艺，使得饲料营养和品质均显著提高；
其中，发酵温度对饲料营养品质的影响最大，含水量次之.

A：细菌的相关性热图；

B：真菌的相关性热图.颜色变化代表了关联程度.C：细菌的可视化相关网络；
D：真菌的可视化相关网络.黄色节点：微生物属；
红色节点：品质参数；
蓝色节点：营养参数；
红色实线：Spearman秩相关系数(细菌>0.6，真菌>0.5)，FDR调整P<0.05；
灰色虚线：Spearman秩相关系数(细菌<-0.6，真菌<-0.5)，FDR调整P<0.05.线宽表示相关强度.图3 巨菌草饲料营养品质与饲料微生物群间的Spearman相关性统计Fig.3 Spearman′s correlations between nutrient quality parameters and microbiota of C. fungigraminus feed

传统复合菌饲料多采用单菌复配且比例明确的复合菌，对饲料原料(秸秆、花生秧等)的降解效果虽优于单菌，但也不及一个自然存在或经自然选择的菌群的降解能力[25]，并且复合菌也会因复配后组分不稳定、优势菌群不突出而影响菌群功能的稳定性[26].基于此，本文在探讨最佳发酵工艺外，也对菌群进行传代富集，以获得组成稳定的优势菌群.在传至第1代时，饲料纤维降解效果较差，但pH明显降低，说明菌群在短时间内对纤维物质的降解率低，但微生态环境pH的降低有利于后期微生物的生长繁殖.在传至第3和第4代时，巨菌草发酵饲料的NDF、ADF含量和pH明显降低，RFQ、CP含量、LA含量和LA/AA得到有效提高且趋于稳定，说明此时饲料中的菌群生长较稳定；
第5代的OD显著降低可能是由于传代次数太多，优势菌群降低或有害菌增多，这有待依靠测序技术进一步分析验证.传代后巨菌草饲料的营养品质得到了明显改善，第3代和第4代的菌群效果最佳.

饲料菌群经富集后，饲料营养品质有显著提高，菌群的组成和多样性也有着不同程度的变化.本试验发现饲料中变形菌门的丰度较高，研究指出变形菌门是胃肠道的致病菌门，也有研究指出其与植物病虫害防治、植物生长发育和产量有关[27-28]，彭田露[25]的研究证实稻壳堆肥样品中变形菌门的丰度与水稻秸秆的降解率呈正相关，说明该菌门的存在有利于纤维物质的降解.此外，各代菌群中变化较大的是厚壁菌门和拟杆菌门.厚壁菌门属于化能营养型，在木质纤维素的降解中起主导作用，可水解有机物产生短链脂肪酸、糖和蛋白质等[29].拟杆菌门是参与碳水化合物发酵的主要微生物，对有机物的降解起主导作用，能将纤维和糖类物质分解成脂肪酸[25,30].虽然CSP5中厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度增加，但CSP5的饲料的营养品质并不及CSP3和CSP4，这有可能与变形菌门丰度的降低有关.再者，从真菌组成来看，丰度较高的子囊菌门和担子菌门是重要的真菌分解者，子囊菌门中的真菌属能降解纤维素，同时担子菌门能高效降解木质纤维素和多糖类物质[31].CSP5中饲料营养品质的下降也与这两种菌门丰度的降低有关.此外，研究表明[32]，木霉属属于好氧型真菌，具有较强的纤维素分解能力，但饲料发酵过程仅在好氧发酵阶段起作用，这也是发酵进入厌氧期后(CSP1～CSP5)该属真菌丰度极低的原因.

为进一步揭示饲料菌群与营养品质参数之间的关系，进行了Spearman相关性分析.在相关性分析中，泛菌属与NH3-N/TN和BA呈负相关.泛菌属是兼性厌氧的化能异养菌，具有代谢和发酵功能，能降解D-葡萄糖和其他糖类产生酸；
在传代过程中泛菌属的相对丰度逐渐降低，这与NH3-N/TN和BA含量逐渐增大的趋势一致.此外，乳酸杆菌属与pH、NDF、ADF呈负相关，与RFQ、CP、LA、LA/AA和BA呈正相关.乳酸杆菌属为厚壁菌门下的一类异养厌氧型微生物，在饲料发酵的厌氧阶段能将底物中的可溶性碳水化合物快速转化为有机酸，降低微生态环境中的pH，以抑制其他致腐微生物分解底物的营养物质[33].这表明较高乳酸杆菌属含量的CSP3和CSP4饲料中的pH较低，纤维物质含量明显降低，饲料品质较优.在真菌中较重要的两个菌属是Naganishia和Meyerozyma;Naganishia与pH、NDF、ADF呈负相关，与RFQ、CP、LA和LA/AA呈正相关；
而Meyerozyma与NH3-N/TN呈负相关.Naganishia属于担子菌门，表现出较好的纤维素酶和蛋白酶活性[34]，能将植物蛋白水解产生肽，有利于动物对营养的吸收，进而改善肠道健康[35].Meyerozyma属于子囊菌门，能产生锰过氧化物酶，可有效降解木质纤维素，但铵类氮源或氮丰富的情况下会抑制酶的合成，产生“氨代谢物抑制”现象，不利于木质纤维素的降解[36].这很好地解释了CSP3和CSP4饲料中ADF、NDF和NH3-N/TN较低的原因.

饲料发酵是多种微生物共同作用的过程，本研究中传代富集的优势菌大多是厌氧或兼性厌氧菌，好氧真菌则集中在发酵前期，发酵后期并未被富集.综上，传代至第4代的菌群较稳定且发酵的饲料营养品质皆优.

(1)由单因素和响应面试验优化获最佳发酵工艺：发酵温度28 ℃、含水量60%、接种量2.6%.(2)传代后的发酵巨菌草饲料的营养成分和发酵品质得到明显提高，第4代菌群较稳定，且优于响应面试验结果.其NDF含量62.24%、ADF含量37.02%、RFQ 89.76%、CP含量10.41%、NH3-N/TN 为2.54%、pH 4.28、LA含量9.55%、LA/AA0.85、BA含量5.40%.(3)经富集巨菌草中饲料菌群的优势菌门是变形菌门、厚壁菌门和子囊菌门，饲料还增加了乳酸杆菌属、泛菌属、Naganishia、Khuskia和Meyerozyma等有益菌的相对丰度，进一步改善饲料营养和品质.

综上，菌群传至第4代的巨菌饲料营养品质、菌群结构和丰度较稳定且最佳，则表明第4代菌群可作为巨菌草饲料的专用发酵菌群.

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