桑黄发酵液胞外多糖含量测定方法的比较及优化
时间：2023-04-11 14:20:05 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
谢存一 李剑梅 郭玲玲 张疏雨 朱万芹 柴林山
（辽宁省微生物科学研究院，辽宁朝阳 122000）
桑黄Sanghuangporus是一类重要的药用真菌，有“森林黄金”之美称[1]。桑黄在我国具有悠久的应用历史，在历代本草著作中均有记载，最早可见于东汉的《神农本草经》。据《药性论》记载：桑黄味微苦，性寒，具有治疗痢疾、盗汗、血崩、脱肛泻血、带下、闭经、止泻，并具有延年等功效[2−3]。随着现代生物技术的发展，桑黄类真菌逐渐被明确富含多糖、黄酮类、萜类等活性物质，其中桑黄多糖是桑黄类真菌中一种重要的活性物质，其胞内多糖来源于菌丝体、子实体，胞外多糖大多来源于发酵液[4−6]。研究表明：桑黄多糖能促使肿瘤细胞自我毁灭，防止肿瘤细胞附着于体内并抑制转移，抑制率为96.78%，是目前国际公认的生物抗癌天然产品中最有效的一种药用真菌，已经成为国内外医药制剂与保健品行业研究与开发的热点[7−8]。因此，对桑黄及其提取物中多糖含量的测定就显得十分重要。目前，多糖测定方法有很多种，直接测定的高效毛细管电泳法、高效液相色谱法等在实际应用中较为受限；
利用多糖的性质，在一定条件下与显色剂发生反应的测定方法则相对简单方便，如水杨酸法、斐林法、苯酚−硫酸法及蒽酮−硫酸法等，其中苯酚−硫酸法与蒽酮−硫酸法应用更为广泛[9−10]。但不同的测定方法及测定条件测定不同来源多糖表现出的准确性、稳定性、重现性有所不同。为提高桑黄多糖含量测定的准确性，笔者以桑黄Lnonotus linteu菌株S−1液体培养获得的胞外多糖为原料，采用苯酚−硫酸法及蒽酮−硫酸法测定桑黄发酵液胞外多糖，比较其含量及加标回收率，明确桑黄多糖测定的最适方法；
并采用单因素试验，考察显色剂用量、显色剂浓度、显色时间、显色温度对测定结果的影响，优选其最佳测定条件，为桑黄菌株代谢产物及其产品研发、质量控制提供科学的参考依据。
1.1 试验材料
（1）菌种：桑黄菌株S−1来源于辽宁省微生物科学研究院。
（2）主要仪器：723N 可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；
SpH−2102 立式双层大容量恒温培养摇床（上海世平实验设备有限公司）；
HFsafe−1200 生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司）；
CKX41SF 电 子 显 微 镜（OLYMPUS CORPORA‐TION）；
BCD−649 WADV冰箱（青岛海尔股份有限公司）；
LDZX−75KBS 立式高压蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；
DHG−9 240 A 电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；
KQ−50B 超声清洗机（昆山舒美超声仪器有限公司）；
GL−21M 高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）。
（3）培养基：PDA 改良培养基为马铃薯20%，蔗糖 2%，牛肉膏 0.8%，MgSO40.15%，KH2PO40.3%，VB110 mg/L，玉米粉0.25%，豆粉0.25%。
（4）主要试剂
葡萄糖标准溶液：称取105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖10.0 mg，用蒸馏水溶解，定容至100 mL，配置成0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。
苯酚溶液：称取3.0 g、4.0 g、5.0 g、6.0 g、7.0 g 重蒸苯酚置于棕色容量瓶中，分别用蒸馏水定容至100 mL，配制成质量浓度分别为3%，4%，5%，6%，7%的苯酚溶液，置于棕色试剂瓶中，备用。
蒽酮−硫酸试剂：精密称取0.100 0 g 蒽酮，置棕色容量瓶中，用80%浓硫酸溶解并定容至100 mL，现用现配。
1.2 试验方法
1.2.1 桑黄胞外多糖溶液的制备
从PDA 斜面挑取4 块新鲜的S−1 桑黄菌株菌丝块（单块约0.5 cm2）接入装有 100 mL 的 PDA 改良培养基的三角瓶中（250 mL），于28 ℃、150 r/min 条件下摇床振荡避光培养7 d；
培养结束后，用三层纱布过滤发酵液，收集滤液，于10 ℃、14 400×g条件下离心20 min，收集上清液，然后吸取0.5 mL的上清液于250 mL 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度（即为桑黄胞外多糖供试样品液），备用。
1.2.2 不同测定方法比较
苯酚−硫酸法：准确吸取0.1 mg/mL 的葡萄糖标准溶液0 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL于25 mL 比色管中，分别用蒸馏水将其补足至2.0 mL；
加入1.0 mL 5%苯酚溶液，混匀，迅速加入5 mL 98%浓硫酸，混匀，40 ℃水浴15 min 后迅速冷却，于波长490 nm处测定吸光度值（A），获得葡萄糖标准曲线方程式为：y=16.844x−0.077（R2=0.9881）；
同步吸取2 mL 的桑黄菌株胞外多糖供试样品液置于25 mL比色管中，测定供试样品液的吸光度值，依据标准曲线方程式计算胞外多糖的质量浓度。每组测定3次，取平均值。
蒽酮−硫酸法：准确吸取0.1 mg/mL 葡萄糖标准溶液 0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL 置于25 mL 比色管中，分别补蒸馏水至2.0 mL，迅速加入蒽酮−硫酸试剂6.0 mL，沸水浴15 min 后迅速冷却，于波长620 nm 处测定吸光度值（A），获得葡萄糖标准曲线方程式为：y=0.008x−0.001（R2=0.987）；
同步吸取2 mL 的桑黄菌株胞外多糖供试样品液置于25 mL 比色管中，测定供试样品液的吸光度值，依据标准曲线方程式计算胞外多糖的质量浓度。每组测定3次，取平均值。
加标回收率测定：吸取1.0 mL 桑黄胞外多糖供试样品液3 份，分别加入0.1 mg/mL 的葡萄糖标准溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL，分别用苯酚−硫酸法、蒽酮−硫酸法测定多糖含量，计算加标回收率并比对。
1.2.3 苯酚−硫酸法测定条件优化
1.2.3.1 浓硫酸用量的优化
移取5 份胞外多糖供试样品液2.0 mL 于25 mL比色管中，加入1 mL 5%苯酚溶液，混匀后迅速加入1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、7.0 mL、9.0 mL 的浓硫酸，摇匀，40 ℃水浴显色15 min，取出后迅速冷却至室温，于波长490 nm处测定吸光度值。
1.2.3.2 苯酚溶液质量浓度的优化
移取5 份胞外多糖供试样品液2.0 mL 于25 mL比色管中，分别加入1 mL 质量浓度为3%、4%、5%、6%、7%的苯酚溶液，混匀后分别迅速加入（优化用量）浓硫酸，摇匀后于40 ℃水浴显色15 min，取出后迅速冷却至室温，于波长490 nm处测定吸光度值。
1.2.3.3 苯酚溶液用量的优化
采用优化的浓硫酸用量及苯酚质量浓度。移取5 份胞外多糖供试液2.0 mL 于25 mL 比色管中，分别加入 0.2 mL、0.6 mL、1.0 mL、1.4 mL、1.8 mL 苯酚溶液，混匀后分别于冰水浴中迅速加入浓硫酸，摇匀，40 ℃水浴显色15 min，取出后迅速冷却至室温，于波长490 nm处测定吸光度值。
1.2.3.4 水浴显色时间的优化
在上述优化条件下，移取6 份胞外多糖供试样品液2.0 mL于25 mL比色管中，按照1.2.3.1方法，依次加入苯酚、浓硫酸，摇匀，在优化的水浴温度条件下分别显色 5 min、10 min、15 min、25 min、30 min、35 min，取出后迅速冷却至室温，于波长490 nm 处测定吸光度值。
1.2.3.5 显色温度的优化
移取5 份胞外多糖供试样品液2.0 mL 于25 mL比色管中，在优化的显色剂用量及质量浓度条件下，按照1.2.3.1 方法，依次加入苯酚、浓硫酸，摇匀后分别在 20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃水浴条件下显色15 min，取出后迅速冷却至室温，于波长490 nm处测定吸光度值。
1.2.4 方法准确度及精密度
1.2.4.1 线性关系考察
准确吸取0.1 mg/mL 的葡萄糖标准溶液0 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL，于 25 mL 比色管中，用蒸馏水补足至2.0 mL；
然后在优化的测定条件下，按照1.2.2 中的苯酚−硫酸法测定不同质量浓度葡萄糖溶液的吸光度值，以葡萄糖质量浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标制备标准曲线，考察优化条件下测定方法的准确度。
1.2.4.2 稳定性试验
在优化的测定条件下，移取2.0 mL 胞外多糖供试样品液，依次加入苯酚溶液、浓硫酸，显色、冷却后分别放置 5 min、10 min、15 min、30 min、60 min、90 min，于波长490 nm 处测定吸光度值，考察吸光度值变化情况。
1.2.4.3 精密度试验
精密移取5 份2.0 mL 的胞外多糖供试样品液，按1.2.4.1 检测方法平行测定其吸光度值，并计算相对标准偏差。
1.2.4.4 加标回收率试验
移取4 份1.0 mL 胞外多糖供试样品液于25 mL比色管中，取其中的3 份，分别加入0.1 mg/mL 葡萄糖标准溶液 0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，然后分别用蒸馏水补足2 mL，按1.2.4.1 测定方法平行测定其吸光度值，计算加标回收率。
1.3 数据处理
试验数据采用Excel软件进行处理及绘图。
2.1 不同测定方法多糖含量的测定结果
苯酚−硫酸法及蒽酮−硫酸法均可用于测定桑黄菌株胞外多糖含量。但相比于苯酚−硫酸法[胞外多糖测定值为（22.877±0.982）mg/mL]，蒽酮−硫酸法测定的桑黄胞外多糖含量的结果值偏高，为（34.25±0.5）mg/mL。由表1 可知，蒽酮−硫酸法平均加样回收率为114.38%，RSD 为6.21%，表明加样回收率较差，而苯酚−硫酸法的平均加样回收率为95.42%，RSD 为2.33%，为良好范围值。由此可见，苯酚−硫酸法测定桑黄胞内外多糖含量比较好。
表1 两种多糖测定方法测算结果比较
2.2 苯酚-硫酸法测定条件优化
2.2.1 浓硫酸用量的确定
由图1 可知，溶液吸光度值随着浓硫酸用量的增加呈现出先增高后降低的趋势。当浓硫酸用量低于7.0 mL 内，吸光度值上升幅度较大，当浓硫酸用量为7.0 mL 时，吸光度值最高（0.908），然后随着浓硫酸用量的增加，吸光度值小幅度下降，这主要是由于过量的浓硫酸导致多糖成分的碳化所致。因此，浓硫酸最适用量为7.0 mL。
图1 不同浓硫酸用量测得的吸光度值
2.2.2 苯酚溶液质量浓度的确定
由图2可知，在优化的浓硫酸用量条件下，随着苯酚溶液的质量浓度上升，供试样品液的吸光度值缓慢上升，当苯酚溶液质量浓度为5%时，供试样品液的吸光度值达峰值（0.979）；
然后随着苯酚溶液质量浓度的上升，吸光度值略有下降，但下降幅度较小。可见，苯酚溶液的质量浓度对吸光度值影响幅度较小，苯酚溶液最适质量浓度为5%。
图2 不同苯酚溶液质量浓度测得的吸光度值
2.2.3 苯酚溶液用量的确定
由图3 可知，在优化的浓硫酸用量及苯酚溶液质量浓度条件下，苯酚溶液的用量对吸光度值具有显著影响，吸光度值变化较大。其中，在苯酚溶液用量低于1.0 mL时，吸光度值呈现快速上升的趋势，当苯酚溶液用量为1.0 mL 时，吸光度值最高（0.985），然后随着苯酚溶液用量的上升，吸光度值呈显著的下降趋势。故苯酚溶液最适用量为1.0 mL。
图3 不同苯酚溶液用量测得的吸光度值
2.2.4 显色时间的确定
由图4可知，在上述优化条件下，随着显色时间的上升，吸光度值逐渐上升，当显色时间为15 min时，吸光度值最高（0.913），然后随着显色时间的延长，吸光度值呈现小幅度的下降趋势。因此，最适显色时间为15 min。
图4 不同显色时间测得的吸光度值
2.2.5 水浴显色温度的确定
由图5 可知，在优化的显色试剂用量及浓度条件下，水浴温度对吸光度值影响较小，呈现小幅度的先上升后下降趋势，当水浴温度为60 ℃时，吸光度值最高（0.944）。因此，最适显色温度为60 ℃。
图5 不同水浴显色温度测得的吸光度值
2.3 优化测定条件后的苯酚-硫酸法考察
2.3.1 标准曲线的绘制
优化测定条件下，以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度值A为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。由图6 可知，葡萄糖质量浓度在0~100µg/mL，其与吸光度值具有良好的线性关系，所获得的线性回归方程为y=15.319x-0.008 8，其R2=0.999 3；
表明优化后的苯酚−硫酸法具有良好的准确性。
图6 优化后葡萄糖标准曲线方程
2.3.2 稳定性试验
取相同供试样品液5 份，在相同条件下测定吸光度值，结果如表2。由表2 可知，随着显色时间的延长，供试样品液的吸光度值呈小幅度的先上升后下降趋势，90 min 内的吸光度值在0.966~0.976，平均值为0.972，RSD 为0.32%，表明优化后的苯酚−硫酸测定方法稳定性良好。
表2 稳定性试验结果
2.3.3 精密度试验
由表3 可知，同一供试样品溶液，在相同条件下，重复测定吸光度值5 次，所测得的吸光度平均值为0.963，相对平均偏差RSD 为1.80%。可见，所获方法重现性良好。
表3 精密度试验结果
2.3.4 加样回收率
由表4 可知，在试验范围内，采用优化后的苯酚−硫酸法的加样回收率在101.05%~104.88%，平均回收率为103.24%，相对平均偏差 RSD 为1.91%。可见，优化后的苯酚−硫酸法测定结果稳定、良好。
表4 加样回收率结果
以桑黄菌株S−1 胞外多糖为试验材料，两种方法测定多糖含量测定结果表明，苯酚−硫酸法及蒽酮−硫酸法均可直接测定桑黄菌株胞外多糖的含量，但相比之下，蒽酮−硫酸法测定胞外多糖的含量值均偏高，苯酚−硫酸法测定的结果值更为可信，且苯酚−硫酸法的加标回收率（95.42%，RSD=2.33%）较蒽酮−硫酸法（114.38%，RSD=6.21%）表现更好，是测量桑黄胞内外多糖的更优选择。
苯酚−硫酸法测定多糖含量的原理是在浓硫酸水合产生的高温条件下将多糖水解成单糖，而苯酚与单糖迅速脱水生成的糖衍生物发生反应，生成橙黄色化合物，再以紫外可见光分光光度计法测定[11]，方法中浓硫酸、苯酚质量浓度、苯酚溶液的用量、显色时间、水浴温度对吸光度值具有一定的影响。单因素优化结果表明：试验范围内，各因素对吸光度值的影响均呈先上升后降低的变化趋势，最优的试验条件：在2.0 mL 待测样品液中，加入5%苯酚溶液1 mL，缓慢加入浓硫酸7 mL，于60 ℃水浴条件下显色15 min；
优化后的苯酚−硫酸法，0~100 µg/mL 葡萄糖质量浓度与吸光度值具有良好的线性关系，稳定性、精密度试验的相对标准偏差（RSD）分别为0.32%、1.80%；
平均加标回收率为103.24%，相对标准偏差RSD=1.91%。可见，优化的苯酚−硫酸法具有良好的准确度、稳定性、重现性，可作为桑黄菌株发酵液胞外多糖的测定方法。
