一株野生白耙齿菌菌株ITS序列鉴定及培养基优化
时间：2023-04-10 13:40:04 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
庄 磊 郭旭欣 于松涛
（哈尔滨市农业科学院，黑龙江哈尔滨 150029）
白耙齿菌Irpex lacteus，又名白囊孔菌、白囊耙齿菌，分类学上隶属于担子菌亚门Basidiomycetes、层菌纲Hymenomycetes、非褶菌目Aphyllophorales、多孔菌科Polyporaceae、耙齿菌属Irpex[1]，在我国主要分布于吉林、河北、山西、江西、甘肃、云南、福建、西藏等省区[2]，其子实体外观乳白色，半平伏而反卷，盖面乳白色有短细绒毛，有绢丝状光泽。白耙齿菌具有很高的医学价值，20 世纪80−90 年代我国研究开发其用于治疗慢性肾小球肾炎，耙齿菌糖蛋白还有抗炎活性[3]。国外的研究主要是利用白耙齿菌产生的胞外酶进行生物预处理和环境污染修复。由于在自然界中白耙齿菌子实体存量较少，人工栽培技术还不成熟，现有野生子实体资源难以满足市场需求，为了可持续利用该资源，人工驯化野生资源，并快速高效地大量繁殖极具药用价值的菌丝技术研究成为关注点，而现阶段有关白耙齿菌培养基配方的研究较少[4]。笔者分离鉴定一株采自辽宁抚顺地区野生白耙齿菌菌株，并进行培养基优化试验，为今后人工栽培提供理论依据和技术支持。
1.1 材料与仪器
（1）供试菌株子实体于2020年采自辽宁省抚顺地区的桃木上，经形态学鉴定为白耙齿菌（图1），经组织培养分离纯化获得供试菌株（图2），由哈尔滨市农业科学院生物实验室保存。
图2 分离得到的白耙齿菌菌株
（2）培养基
碳源试验基础培养基：酵母膏2 g，KH2PO42 g，MgSO41 g，琼脂20 g。氮源试验基础培养基：葡萄糖20 g，磷酸二氢钾2 g，硫酸镁1 g，琼脂20 g。无机盐试验基础培养基：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g。
（3）主要仪器及试剂：5417R 型离心机、9700 型PCR 仪、DYY−8C 电泳仪、DK−24 水浴锅、3730XL 测序仪、琼脂糖（100 g/瓶）、PCR 产物磁珠法纯化试剂盒（10 mL/瓶）、细菌基因组提取试剂盒（50 次/盒）、BGI 2xSuperPCRMix（with dye）5 mL（5 支/包）、BGI D2000 Plus DNA Ladder 1 250 µL/包、电子天平。
1.2 试验方法
1.2.1 ITS序列分析
1.2.1.1 基因组DNA提取
取1.5 mL 离心管，加入200µL 预处理液和三颗玻璃珠，然后加入适量样本，放入研磨仪中研磨至粉状；
加入20 µL Proteinase K 溶液，混匀，37 ℃放置30~60 min；
加入 200µL 裂解液，颠倒充分混匀，70 ℃放置10 min；
加200 µL 无水乙醇，充分混匀，离心以去除管盖内壁液滴；
过吸附柱，洗涤液洗1 次，漂洗液洗2 次；
吸附柱室温放置5~10 min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附转入一个新离心管，往吸附膜中间位置悬空滴加50~100µL ddH2O，室温放置5~10 min，2 250g离心2 min，将溶液收集到离心管中。
图3 菌丝体形态（×1 600）
1.2.1.2 18 S扩增
利用ITS 序列通用引物ITS1（5’−TCCGTAGGT‐GAACCTGCGG−3’）和 ITS4（5’−TCCTCCGCTTATT‐GATATGC−3’）对样本进行扩增，PCR扩增反应体系和条件为：15µL Super Mix，1µL Primer F（10 p），1 µL Primer R（10 p），1 µL 模版，dd H2O 12 µL；
反应程序为：96 ℃预变性 5 min，96 ℃ 变性 20 s，56 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 30 s，72 ℃最后延伸 10 min，35 个循环，4 ℃保存。将扩增产物进行序列测定，其测序结果同GenBank 中其他白耙齿菌菌株ITS 序列进行比较，分析其亲缘关系，确定菌株真实性。
1.2.1.3 PCR产物检测及纯化
3µL PCR 产物进行1.0%的琼脂糖凝胶检测，观察条带性状。PCR 产物纯化按照磁珠纯化标准，利用磁珠能够吸附或者释放带电荷物质的原理，在高盐低pH 溶液吸附DNA，在低盐高pH 溶液释放DNA，从而达到分离提纯DNA产物的目的。
1.2.1.4 测序及结果比对
将纯化后的PCR 产物上机检测。测序结果进行NCBI−BLAST比对。
1.2.2 培养基优化试验
1.2.2.1 单因素筛选
在碳源试验基础培养基中，分别添加20 g 的葡萄糖、淀粉、乳糖、蔗糖、果糖、麦芽糖，配制固体平板培养基，接种直径为5 mm 菌块于平板中央，置25 ℃恒温箱中暗培养。每个处理重复6次。接种后20h左右，菌块开始萌发，采用十字交叉法测定菌落直径，并计算菌丝平均长速，同时，观察记录菌丝长势。
在氮源试验基础培养基中，分别添加10 g 的酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、黄豆粉、亚硝酸钠、尿素。培养方法同碳源试验。
在无机盐基础培养基中，分别添加1 g/L 硫酸镁、1 g/L 磷酸二氢钾、0.5 g/L 硫酸镁+0.5 g/L 磷酸二氢钾。培养方法同碳源试验。
1.2.2.2 多种培养基比较试验
培养基比较试验分别采用PDA 培养基（土豆200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 17 g，蒸馏水 1 000 mL，pH自然）、CPDA 培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氢钾 2 g，硫酸镁 0.5 g，琼脂 17 g，蒸馏水1 000 mL，pH 自然）、YPAD 培养基（酵母膏10 g，蛋白胨 20 g，葡萄糖20 g，琼脂17 g，蒸馏水 1 000 mL，pH7.0）、PGY 培养基（蛋白胨10 g，酵母膏5 g，葡萄糖l g，琼脂17 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.0~7.2）、TY培养基（蛋白胨10 g，酵母膏5.0 g，葡萄糖1.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂17 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.0）、SEM 培养基（蔗糖10 g，酵母膏0.4 g，磷酸二氢钾0.5 g，硫酸 镁 0.2 g，氯 化 镁 10 g，碳 酸 钙 l g，蒸 馏 水1 000 mL，pH7.0~7.2）、试验所得的优化培养基。试验测定菌丝平均长速，观察记录菌丝长势及菌落边缘整齐度等特征。待菌丝长满后刮取平板菌丝，于45 ℃恒温箱中烘干后，采用电子天平称量并记录菌丝干重。
1.3 数据分析
数据采用SPSS 11.5 软件中的Duncan 检验进行差异显著性分析。
2.1 ITS序列分析鉴定结果
利用引物ITS1 和ITS4 进行PCR 扩增成功得到ITS序列片段，见图4。
图4 白耙齿菌ITS区域碱基序列
将ITS 序列结果在NCBI 中进行BLAST 比对，发现目标序列与白耙齿菌Irpex lacteus亲缘关系最近，并与登录号为MK343588.1、MH890689.1、MH301114.1、JX311924.1等10个白耙齿菌菌株相似性达99.85%，进一步验证了其形态学鉴定结果，确定其为白耙齿菌。
2.2 培养基单因素筛选结果
2.2.1 碳源试验结果
由表1可以看出，除乳糖外，其他碳源对白耙齿菌的菌丝平均长速影响差异不显著，在乳糖培养基上，菌丝平均长速明显较慢，菌丝长势弱。白耙齿菌对碳源的需求较广泛，虽然白耙齿菌在葡萄糖、果糖为碳源培养基中菌丝平均长速均较快，但菌丝在葡萄糖培养基上长势更浓密粗壮，所以从菌丝长势和平均长速分析，葡萄糖是试验最优的碳源。
表1 供试碳源培养基上白耙齿菌菌丝培养结果
2.2.2 氮源试验结果
由表2 可知，酵母膏较其他氮源明显促进白耙齿菌菌丝生长，而亚硝酸盐和尿素不能被利用，甚至可能对白耙齿菌的生长有毒害作用。在蛋白胨、牛肉膏、黄豆粉分别为氮源培养基上，菌丝平均长速差异极不显著，但是从菌丝长势可以看出，酵母膏、牛肉膏优于蛋白胨、黄豆粉。综合菌丝平均长速与长势，酵母膏为最优氮源。
表2 供试氮源培养基上白耙齿菌菌丝培养结果
2.2.3 无机盐试验结果
由表3可知，从菌丝长势和平均长速看，无机盐对白耙齿菌菌丝生长的影响：磷酸二氢钾+硫酸镁优于磷酸二氢钾、硫酸镁。
表3 供试无机盐培养基上白耙齿菌菌丝培养结果
2.2.4 单因素筛选优化配方
对氮源、碳源、无机盐单因素进行优化筛选，最终得出优化配方：葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，琼脂20 g/L。
2.3 白耙齿菌多种培养基培养结果
由表4 可知，白耙齿菌菌丝均能在多种试验培养基上生长，在优化培养基上菌丝平均长速最快，菌丝浓密，粗壮且菌落边缘规则整齐，并与YPAD 培养基差异不显著。YPAD 培养基培养的白耙齿菌菌丝干重最高，为178.6 mg，显著高于其他培养基，其次为优化培养基，为129.3 mg。菌丝长势，优化培养基、YPAD 培养基、CPDA 培养基的菌丝洁白，粗壮，浓密，菌落边缘规则；
PDA 培养基与PGY 培养基的菌丝生长较浓密；
TY 培养基与SEM 培养基的菌丝稀疏且边缘不规则。
综上所述，可促进白耙齿菌菌丝快速生长萌发，且可培养出质地优良菌丝的培养基为优化培养基。可能因为培养基添加磷酸二氢钾和硫酸镁，补充了镁、磷和钾元素，能更好地满足白耙齿菌菌丝生长发育的需求；
此外酵母膏富含蛋白质、氨基酸、多肽、核苷酸、B 族维生素及微量元素等，尤其B 族维生素是有关酶的活性辅基，对酶活起关键性作用，显著影响菌丝的生长发育。YPAD 培养基培养白耙齿菌，菌丝干重最高，原因可能是YPAD 培养基含有丰富的氮源、碳源和微量元素，且比例适宜，适合白耙齿菌菌丝生长及干物质积累。
表4 多种培养基培养白耙齿菌菌丝结果
将 ITS 序列结果在 NCBI 中进行 BLAST 比对，发现目标序列与白耙齿菌亲缘关系最近，并与登录号为MK343588.1、MH890689.1、MH301114.1、JX311924.1、MK883652.1 等10 个白耙齿菌菌株相似性达99.85%，进一步验证了其形态学鉴定结果。在试验范围内，促进白耙齿菌菌丝快速生长萌发并且使菌丝品质优良致密的培养基为优化培养基（葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，琼脂20 g/L）；
能够获得较大菌丝干重并且适宜白耙齿菌生长的培养基为YPAD培养基。
