银耳多糖的急性毒性、遗传毒性和亚慢性毒性研究

时间：2023-04-10 09:10:05　来源：柠檬阅读网本文已影响人

杨非 ,姚文环 ,李慧 ,张静 ,唐慧 ,吕实波 ,郭婕,孙劭靖,陆震,程东∗

(1.山东省疾病预防控制中心,济南 250014;2.山东华熙海御生物医药有限公司,济南 250000;3.华熙生物科技股份有限公司,济南 250000)

银耳为担子菌门真菌银耳的子实体,又称白木耳、雪耳。中国食用银耳历史悠久,可追溯到南北朝时期。银耳多糖(Tremellapolysaccharide)是银耳的主要组成和活性成分,其种类较多,主要包括酸性、中性杂多糖、胞壁、胞外多糖、酸性低聚糖等五大类。目前,关于银耳多糖的研究主要集中在提取技术、多糖结构种类、保健作用方面,如调节机体免疫力、抗肿瘤,抗氧化、抗辐射、抗衰老、提高记忆力、皮肤保湿等[1-16],而关于银耳多糖的食用安全性的毒理学资料极少。为此我们选用华熙生物科技股份有限公司从银耳孢子经发酵等环节获得的银耳多糖为研究对象,依照食品安全国家标准要求,进行急性经口毒性试验、遗传毒性试验和大鼠90 d经口毒性试验[17-21]等毒理学试验,为初步确定银耳多糖的食用安全性,并为其开发利用提供基础毒理学资料。

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

本研究均使用SPF 级动物。90 d 经口毒性试验:SD 大鼠140 只雌雄各半,体重63～85 g,急性经口毒性试验:ICR 小鼠20 只雌雄各半,体重18.1～22.0 g,均来源于济南朋悦实验动物繁育有限公司[SCXK(鲁)2019-0003];哺乳动物红细胞微核试验:ICR 小鼠50 只雌雄各半,体重25.0～35.0 g,小鼠精原细胞染色体畸变试验:ICR 雄性小鼠30 只,体重31.0～34.0 g,均来源于北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2016-0006]。动物均饲养于山东省疾病预防控制中心屏障环境[SYXK(鲁)2018-0014],实验动物饲料来源于北京华阜康生物科技股份有限公司。本次实验经山东省疾病预防控制中心实验动物伦理委员会批准(A20210312-2),并按实验动物使用的3R 原则给予人道关怀。

1.1.2 菌株

组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌菌株购自上海宝录生物科技有限公司。

1.2 主要试剂与仪器

银耳多糖,黄褐色粉末,由华熙生物科技股份有限公司提供,总糖含量≥61%,蛋白质含量为≥6.2%。

S9 混合液,上海宝录生物科技有限公司提供;血液学试剂,SYSMEX 公司提供;血生化试剂,SIEMENS 公司提供。

CX21 生物显微镜,奥林巴斯公司提供;XN-1000 全自动血细胞分析仪,希思美康公司提供;Dimension Xpandplus 全自动生化分析仪,美国西门子公司提供;CombiScan500 全自动尿液分析仪,Combi 公司提供;Coatron 3000 全自动血凝仪,TECO公司提供;Multifuge 3plus 离心机,Heraeus 公司提供;病理设备,LEICA 公司提供;检眼镜,兰羚公司提供;电子天平,梅特勒-托勒多公司提供等。

1.3 实验方法

1.3.1 急性经口毒性试验

按照限量法试验进行。受试物最大灌胃浓度为100 mg/mL,按0.4 mL/10 g 体重(bw),一日内3次进行经口灌胃(ig),每次间隔4 h,合并一次剂量为12.0 g/(kg·bw),观察动物一般表现并记录,持续14 d。

1.3.2 细菌回复突变试验

考虑受试物对菌株的毒性和溶解度,最高剂量设置为每皿5 mg,按等比组距原则下设4 个剂量组(每皿8、40、200、1000 μg)和4 个对照组(自发回变、溶剂对照、DMSO 对照组和阳性对照组)。分别在加/不加S9 条件下用平板掺入法进行两次试验。

1.3.3 哺乳动物红细胞微核试验

受试物最大灌胃浓度为100 mg/mL,按0.2 mL/(kg·bw)灌胃,高剂量组为2.0 g/(kg·bw),按2 倍组距下设2 个剂量组[即1.0、0.5 g/(kg·bw)]。另设纯化水组和环磷酰胺组(40 mg/(kg·bw))。受试物按0.2 mL/10 (g·bw)间隔24 h 两次ig 给予。第二次ig 后6 h 采集胸骨骨髓,制片。每只动物至少观察200 个红细胞(RBC),同时计数嗜多染红细胞(PCE)在总红细胞中的比例。每只动物至少观察2000 个PCE,计数有微核的PCE 频率。

1.3.4 精原细胞染色体畸变试验

受试物最大灌胃浓度为100 mg/mL,按0.2 mL/(kg·bw)灌胃,1 日内两次进行ig(间隔6 h),高剂量组为4.0 g/(kg·bw),按2 倍组距下设2 个剂量组(即2.0、1.0 g/(kg·bw))。另设纯化水对照组和环磷酰胺对照组(40 mg/(kg·bw),单次ip)。高剂量组于末次ig 后的第24 h 和第48 h 处死动物采样,其余各组动物于末次ig 后第24 h 处死动物采样。处死动物前5 h,ip 秋水仙素(4 mg/(kg·bw))。常规制片。每只动物镜检1000 个细胞以确定精原细胞有丝分裂指数。每只动物计数100 个中期分裂相细胞,记录每个中期分裂相细胞的畸变类型和数量,计算染色体畸变细胞率。

1.3.5 90 d 经口毒性试验

(1)剂量选择与受试物给予方式

剂量组:大鼠100 只,随机分为5 组,每组20只,雌雄各半。根据《食品安全国家标准90 d 经口毒性试验》要求设计试验剂量:大鼠每日摄食量按体重8%折算,受试物最高可掺入饲料比例为质量分数10%,动物摄入剂量可达到8.00 g/(kg·bw),以此为高剂量组。下设三个剂量,分别为4.00、2.00、1.00 g/(kg·bw)。所有剂量组调整饲料配方,加酪蛋白使蛋白含量与对照组一致(蛋白含量约19%)。卫星组:设卫星对照组和卫星8.00 g/(kg·bw)剂量组,每组10 只,雌雄各5 只,卫星对照组给予基础饲料,卫星8.00 g/(kg·bw)剂量组给予受试物高剂量组饲料。于试验第45 天(试验中期)和停止给予受试物后(恢复期) 28 d 处死取材。

(2)方法

每天观察大鼠一般表现,每周记录大鼠摄食量、体重。试验前和试验结束时,对高剂量组和对照组大鼠进行眼部检查(角膜、结膜、虹膜和晶状体);试验中期、试验结束、恢复期结束血液学检查、血生化血检查和尿液检查。试验结束,麻醉解剖大鼠,称心脏、肝、肾、脾、胸腺、肾上腺、脑、睾丸、附睾、卵巢和子宫的绝对重量,计算脏/体比值和脏器组织病理学检查。

1.4 统计学方法

统计学处理用SPSS 22.0 软件进行分析,结果以平均数±标准差()形式表示。计量资料用方差分析、计数资料用卡方检验和Poisson 分布进行组间比较,以P<0.05 为显著性差异,P<0.01 为极显著性差异。

2.1 急性经口毒性试验

各组小鼠饮水进食正常,未见中毒症状,体重逐日增加,14 d 内无死亡。结果显示雌雄小鼠的LD50均大于12.0 g/(kg·bw),属实际无毒级。

2.2 细菌回复突变试验

两次试验中受试物各剂量组回变菌落数均未大于自发回变菌落数的2 倍,亦无剂量-反应关系,说明在加与不加S9 时该受试物对五株试验菌株均未呈现遗传毒性(见表1、表2)。

表1 细菌回复突变试验结果(,第一次)Table 1 Results of bacterial reverse mutation test (,First time)

注:(1):敌克松,每皿50 μg;(2):2-氨基芴,每皿10 μg;(3):甲基磺酸甲酯,每皿0.5 μL;(4):1,8-二羟基蒽醌,每皿50 μg;(5):叠氮钠,每皿0.25 μg ;(6):2-氨基蒽,每皿1 μg。Note.(1),Dioxone,50 μg per dish.(2),2-aminofluorene,10 μg per dish.(3),Methyl sulfonic acid,0.5 μL per dish.(4),1,8-dihydroxyanthraquinone,50 μg per dish.(5),Sodium azide,0.25 μg per dish.(6),2-aminoanthracene,1 μg per dish.

表2 细菌回复突变试验结果(,第二次)Table 2 Results of bacterial reverse mutation test(,Second time)

2.3 哺乳动物红细胞微核试验

如表3 所示,与阴性对照组比较,银耳多糖各剂量组对雌雄小鼠的含微核细胞率无统计学意义(P>0.05),结果为阴性。

表3 小鼠哺乳动物红细胞微核试验(n=5)Table 3 Results of mammalian erythrocyte micromucleus test

2.4 小鼠精原细胞染色体畸变试验

如表4、表5 所示,与阴性对照组比较,银耳多糖各剂量组对小鼠的染色体畸变细胞率无统计学意义(P>0.05),结果为阴性。

表4 小鼠精原细胞染色体畸变试验结果(个,%)Table 4 Results of mouse spermatogonial chromosomal aberration test(n,%)

表5 小鼠精原细胞染色体畸变试验结果(n=5)Table 5 Results of mouse spermatogonial chromosomal aberration test

2.5 90 d 经口毒性试验

2.5.1 动物的一般观察

90 d 试验期间和28 d 恢复期间,各组动物生长状况良好,体重逐周增长,被毛光滑、皮肤无溃破、眼、黏膜、分泌物和排泄物(大小便)无异常,呼吸、神经系统、自主活动,无实验动物死亡。

2.5.2 对大鼠体重、食物利用率的影响

与阴性对照组比较,银耳多糖各剂量组的每周体重、进食量、食物利用率和体重增重、总进食量、总食物利用率均无统计学意义(P>0.05)(表6)。

表6 90 d 经口毒性试验对大鼠总食物利用率的影响()Table 6 Results of total food utilization rate of rats in 90 d oral toxicity test

2.5.3 眼部检查

试验前后,8.00 g/(kg·bw)剂量组和对照组大鼠的角膜、晶状体、虹膜和结膜表面光滑,无充血水肿等异常表现。

2.5.4 血液学测定结果

与阴性对照组比较,试验末期雄性4.00 g/(kg·bw)剂量组白细胞分类嗜酸(%)升高、2.00 g/(kg·bw)剂量组PT 降低和8.00 g/(kg·bw)剂量组PT 降低,雌性4.00 g/(kg·bw)剂量组白细胞分类中性(%)升高、淋巴(%)降低(P<0.05 或P<0.01)(表7、表8、表9)。

表7 90 d 经口毒性试验中期血液学检查结果()Table 7 Results of hematological examination for mid-term in 90 d oral toxicity test

表8 90 d 经口毒性试验末期血液学检查结果(,n=10)Table 8 Results of hematological examination for final-term in 90 d oral toxicity test

注:与对照组比较,∗P<0.05,∗∗P<0.01。Note.Compared with the negative control group,∗P<0.05,∗∗P<0.01.

表9 90 d 经口毒性试验恢复期结束血液学检查结果(,n=5)Table 9 Results of hematological examination for recovery-term in 90 d oral toxicity test

2.5.5 血液生化学测定结果

试验中期,雌性实验动物8.00 g/(kg·bw)剂量组氯离子与对照组比较有显著性差异(P<0.05),但仍在本研究室正常值范围内,不认为存在生物学意义;试验末期和恢复期,剂量组动物各项指标与对照组比较均无显著性差异(P>0.05),且其值均在本实验室正常值范围内(表10、表11、表12)。

表10 90 d 经口毒性试验中期血液生化结果(,n=5)Table 10 Results of biochemistry examination for mid-term in 90 d oral toxicity test

注:与对照组比较,∗P<0.05。Note.Compared with the negative control group,∗P<0.05.

表11 90 d 经口毒性试验末期血液生化结果(,n=10)Table 11 Results of biochemistry examination for final-term in 90 d oral toxicity test

表12 90 d 经口毒性试验恢复期结束血液生化结果(,n=5)Table 12 Results of biochemistry examination for recovery-term in 90 d oral toxicity test

2.5.6 尿液检查结果

与对照组比较,试验中期雄性8.00 g/(kg·bw)剂量组尿蛋白有显著性差异(P<0.05);试验末期雌性2.00 g/(kg·bw)剂量组pH 值有显著性差异(P<0.05),但均在本研究室正常值范围内,不认为存在生物学意义。其余各剂量组各项指标均无显著性差异。

2.5.7 病理解剖

(1)大体解剖

90 d 经口毒性试验结束后,大体观察各剂量组动物的脑、垂体、甲状腺、胸腺、肺、心脏、肝、脾、肾、肾上腺、胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠、直肠、胰腺、肠系膜淋巴结、卵巢、子宫、睾丸、附睾、前列腺和膀胱等组织器官均未见明显异常。

(2)组织病理学检查

对照组和高剂量组大鼠各脏器病理切片检查发现对照组和高剂量组有少数动物出现肝、肺和肾轻微病理改变:雄性对照组和雌性高剂量组、对照组各1 只大鼠可观察到肝小叶内点状的炎症灶,灶内炎细胞浸润,个别肝细胞坏死,雄性高剂量组、对照组各1 只内可见汇管区内点状的炎症灶;雄性高剂量组1 只大鼠可观察到肺气肿,部分肺泡腔融合成肺大泡,雄性对照组和雌性高剂量组、对照组各有1 只可观察到肺间质炎,肺泡上皮增生,肺泡壁变厚,肺泡腔和肺泡壁有炎细胞浸润;雄性高剂量组、对照组各1 只大鼠可观察肾小管变性,小管上皮细胞肿胀,嗜碱性染色增强,胞浆内出现透明空泡样区,胞核疏松淡染,小管管腔变窄。

(3)脏器系数测定结果

试验末期及恢复期,脑、心脏、胸腺、肾上腺、肝、脾、肾、睾丸、附睾、子宫、卵巢等脏器的重量和脏器系数与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)(表13～表16)。

表13 90 d 经口毒性试验末期脏器重量(,n=10)Table 13 Organ weight for final-term in 90 d oral toxicity test

表14 90 d 经口毒性试验末期脏器系数(,n=10)Table 14 Organ coefficient for final-term in 90 d oral toxicity test

表15 90 d 经口毒性试验恢复期结束脏器重量(,n=10)Table 15 Organ coefficient for recovery-term in 90 d oral toxicity test

表16 90 d 经口毒性试验恢复期结束脏器系数(,n=10)Table 16 Organ coefficient for recovery-term in 90 d oral toxicity test

银耳多糖生理活性广泛,具有广阔的市场价值,但作为食品原料开发利用还缺乏充分的毒理安全评价资料。现仅查阅到贾汉卿等[22-25]报道的关于银耳多糖J 的小鼠急性毒性、慢性毒性、生殖毒性、致癌试验文章,其采用的试验方法参考文献为1978 年人民卫生出版社出版的《食品毒理》。报道未对受试物银耳多糖来源、性状等作出说明,实验动物选用小鼠,未标明小鼠品系、来源、饲养环境等,在慢性毒性试验中,未提供每周体重、进食量、食物利用率、血液学、血生化学、尿液检查、脏器湿重、脏体比等多项指标数据,也未设置卫星组,研究不够深入系统。本次研究依据最新的食品安全国家标准[17-21]对华熙生物科技股份有限公司生产的银耳多糖开展毒理学试验,初步研究银耳多糖的食用安全性。急性毒性试验采用限量法[17],24 h 内经口累积给予小鼠12.0 g/(kg·bw)的银耳多糖,小鼠无一死亡,无明显的毒性症状,可见银耳多糖属实际无毒级。在遗传毒性试验中,无论原核细胞试验还是真核细胞试验,无论体内试验还是体外试验,结果均为阴性,初步判断该银耳多糖没有遗传毒性。在90 d 经口毒性试验中,各剂量组动物每周体重、体重增重、进食量、总进食量、食物利用率和总食物利用率与对照组比较均无统计学意义,可见银耳多糖对大鼠生长发育、进食、营养吸收没有不良影响。血液学、血生化、尿液检查中,个别剂量白细胞分类嗜酸、中性、淋巴、PT,氯离子、尿蛋白、尿PH 值等与对照组比较出现统计学差异,但没有剂量反应关系,时间没有连续性,与性别无关,且其值均在本研究室正常值范围内,不认为有生物学意义和毒理学意义,可能与动物个体差异有关。组织病理学检查对照组和高剂量组少数动物的标本出现病理改变,但这些病理改变程度较轻且无组间特异性分布,考虑与动物质量有关,不认为与银耳多糖作用有关。

综合以上结果,在本次条件下,本次所研究的银耳多糖属于实际无毒级物质,未见遗传毒性效应,根据银耳多糖的实际摄入剂量初步确定该样品最大未观察到有害作用剂量(NOAEL)为:雄性动物为7.21 g/(kg·bw),雌性动物为8.18 g/(kg·bw)。本次对华熙生物科技股份有限公司生产的银耳多糖开展的毒理学安全研究为银耳多糖开发利用提供了科学数据,为进行下一步的毒理学试验提供了剂量参考依据。

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